張夏茹，趙薪豐，鄭遠(yuǎn)靜，劉元林，李雪，王洋，王麗峰，張毅

（1.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院研究生協(xié)作培養(yǎng)單位，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；河北大學(xué) 3.化學(xué)與材料科學(xué)院，4.生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。MSC具有向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的功能［1］。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控MSC 向不同細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用，激活轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)特定細(xì)胞分化基因的表達(dá)［2］。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）作為MSC 向脂肪細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，其在脂肪形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PPARγ以PPARγ1和PPARγ2 2 種形式的異構(gòu)體存在，后者主要在脂肪組織中表達(dá)［3］。當(dāng)PPARγ 被敲除后，脂肪將無(wú)法形成，且所有的前體成脂細(xì)胞信號(hào)通路均與PPARγ相關(guān)［4］。目前MSC向成脂細(xì)胞分化的作用機(jī)制尚不清楚，MSC多向分化調(diào)控作用的研究成為目前研究的熱點(diǎn)。

本課題組前期通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）激活的人臍帶來(lái)源MSC（stimulated- human umbilical cord-derived MSCs，S-HuMSC）基因表達(dá)與正常HuMSC 存在顯著差異，其中白細(xì)胞介素32（interleukin-32，IL-32）在S-HuMSC 中的表達(dá)顯著升高［5］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IL-32可參與調(diào)節(jié)MSC 的多向分化。IL-32又稱自然殺傷細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物4，是一種分泌性蛋白，由T 淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌［6］。IL-32 作為一種炎癥細(xì)胞因子，可通過(guò)激活NF-κB 和p38 絲裂原活化蛋白激酶誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如TNF-α，IL-1β，IL-6 和IL-8 等［7］。有研究報(bào)道，與高脂飲食的野生型小鼠相比，高脂飲食的IL-32β轉(zhuǎn)基因小鼠肝脂質(zhì)蓄積減少，肝組織PPARγ 表達(dá)下調(diào)［8］。由此提示，IL-32 對(duì)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程可能具有一定的調(diào)控作用。本研究利用過(guò)表達(dá)IL-32的慢病毒轉(zhuǎn)染HuMSC，檢測(cè)IL-32對(duì)HuMSC成脂分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

HuMSC 為軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所凍存細(xì)胞。胎牛血清、α-MEM 培養(yǎng)基和0.25%胰酶，美國(guó)Thermo Fisher 公司；APC-抗人CD14、APC-抗人CD34、APC-抗人CD45、PE-抗人CD73、PE-抗人CD90 和PE-抗人CD105，美國(guó)eBioscience公司；含過(guò)表達(dá)IL-32基因序列或陰性對(duì)照（negative control，NC）序列且?guī)в芯G色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）及嘌呤霉素抗藥基因的慢病毒載體（簡(jiǎn)稱為穩(wěn)定表達(dá)IL-32 慢病毒載體和NC 空載體）由吉?jiǎng)P基因生物工程有限公司構(gòu)建；成脂分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein α，C/EBPα）和脂肪酶（adiponectin，ADI），成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX family transcription factor 2，RUNX2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和無(wú)遠(yuǎn)側(cè)同源盒5（distalless homeobox 5，DLX5），IL-32及GAPDH引物（表1），上海生工生物工程股份有限公司合成；TNF-α、IFN-γ、嘌呤霉素鹽酸鹽、吲哚美辛、地塞米松、油紅O 粉、胰島素、維生素C 磷酸鹽、β-磷酸甘油、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）和Trizol 試劑，美國(guó)Sigma 公司；ALP 染液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；M-MLV、RNA 酶抑制劑、5×M-MLV 緩沖液、Oligo dT 和隨機(jī)引物，日本Takara 公司；dNTP 和DTT，康為世紀(jì)有限公司；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（CLM-170B-8-NF），新加坡藝思高科技有限公司；核酸定量?jī)x（ND life-5463）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（A40425）、PCR擴(kuò)增儀（4382286）和低溫高速離心機(jī)（Heraeus Fresco 21），美國(guó)Thermo Fisher 公司；倒置顯微鏡（CKX53SF-R）和熒光顯微鏡（CKX53），日本Olympus 公司；流式細(xì)胞儀（Accuri C6 Plus），美國(guó)Becton Dickinson公司。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 HuMSC培養(yǎng)和激活

復(fù)蘇HuMSC 并接種于T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)約80%棄原培養(yǎng)基，PBS 潤(rùn)洗2 次；用0.125%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，150×g離心5 min，HuMSC 沉淀用α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）重懸。取部分HuMSC接種于新的T75培養(yǎng)瓶中，用TNF-α（20 μg·L-1）和IFN-γ（20 μg·L-1）孵育24 h，得到S-HuMSC。倒置顯微鏡下觀察HuMSC和S-HuMSC形態(tài)并拍照。

1.3 HuMSC和S-HuMSC表型鑒定

HuMSC和S-HuMSC分別用1.4 mL PBS重懸，細(xì)胞密度為1×109L 分別分裝于7 個(gè)EP 管（6 個(gè)流式抗體管，1個(gè)細(xì)胞對(duì)照管）中，每管200 μL。除細(xì)胞對(duì)照管外，其余6 管分別加入相應(yīng)抗體（APC-抗人CD14、APC-抗人CD34、APC-抗人CD45、PE-抗人CD73、PE-抗人CD90和PE-抗人CD105），每管1 μL，混勻；避光孵育30 min，每管加入PBS 800 μL 混勻，離心（150×g，5 min）；每管加入PBS 200 μL 重懸，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)HuMSC和S-HuMSC表型。

1.4 HuMSC和S-HuMSC成骨和成脂誘導(dǎo)分化

將HuMSC和S-HuMSC分別接種于六孔板中，每孔5×104細(xì)胞，進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化，同時(shí)設(shè)自分化對(duì)照組（含10%胎牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）。成骨分化誘導(dǎo)液含10%胎牛血清、地塞米松0.1 μmol·L-1、維生素C磷酸鹽50 μmol·L-1和β-磷酸甘油10 mmol·L-1；成脂分化誘導(dǎo)液含10%胎牛血清、地塞米松1 μmol·L-1、胰島素10 μg·L-1、IBMX 0.5 mmol·L-1和吲哚美辛0.5 mmol·L-1；每隔2 d換液1次。成骨分化誘導(dǎo)14 d，ALP 染色后用ImageJ軟件分析檢測(cè)ALP 染色面積，并收集各組細(xì)胞提取總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測(cè)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RUNX2，ALP和DLX5mRNA表達(dá)，測(cè)定HuMSC 和S-HuMSC成骨誘導(dǎo)分化能力。成脂分化誘導(dǎo)10 d，進(jìn)行油紅O染色后用ImageJ軟件分析檢測(cè)脂滴形成面積，并收集各組細(xì)胞提取總RNA，RT-qPCR 檢測(cè)成脂相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα和ADI mRNA表達(dá)，測(cè)定HuMSC 和S-HuMSC 成脂誘導(dǎo)分化能力。

1.5 利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)lL-32 的HuMSC（lL-32highHuMSC）

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代HuMSC按每孔1×105接種于六孔板內(nèi)，分為HuMSC，NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC 組。NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC組分別感染NC 空載體和穩(wěn)定表達(dá)IL-32 慢病毒載體，感染病毒載量均為1×1010L-1，復(fù)感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=10；HuMSC 組未加慢病毒懸液。轉(zhuǎn)染24 h 后，各組棄原培養(yǎng)基，更換為新的α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）。轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行嘌呤霉素抗藥基因篩選，嘌呤霉素終濃度為2 mmol·L-1。篩選72 h，待HuMSC 組無(wú)存活細(xì)胞，NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC組更換為不含嘌呤霉素的α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)并擴(kuò)增，同時(shí)另取同批次的HuMSC 繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)約80%時(shí)，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞GFP 表達(dá)，并收取各組細(xì)胞用流式細(xì)胞儀測(cè)定GFP熒光強(qiáng)度計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)收集各組細(xì)胞分別提取總RNA，RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞IL-32mRNA 表達(dá)，鑒定IL-32highHuMSC是否穩(wěn)定過(guò)表達(dá)IL-32。

1.6 lL-32highHuMSC 和NC-HuMSC 培養(yǎng)擴(kuò)增及形態(tài)和表型鑒定

同1.2 和1.3 對(duì)NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，并對(duì)其形態(tài)和細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定。

1.7 lL-32highHuMSC 和NC-HuMSC 成脂分化能力測(cè)定

分別將HuMSC，NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC同1.4 進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，分別于誘導(dǎo)后第0，3，5，7，10 和14 天進(jìn)行油紅O 染色，并用ImageJ 軟件分析脂滴形成面積；同時(shí)收集各組細(xì)胞并提取總RNA，RT-qPCR 檢測(cè)成脂相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA 表達(dá)，測(cè)定NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC成脂分化能力。

1.8 RT-qPCR檢測(cè)成骨和成脂相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及IL-32 mRNA表達(dá)

取1.4 和1.7 提取的細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，程序?yàn)椋?0 ℃，10 min；42 ℃，1 h；70 ℃，15 min。隨后以cDNA 為模板進(jìn)行PCR，檢測(cè)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RUNX2，ALP和DLX5及成脂相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα和ADI或IL-32mRNA 表達(dá)水平。RT-qPCR 反應(yīng)體系（20 μL）：上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL，cDNA 1.0 μL，2×MltraSYRP 混合物10.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，使用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HuMSC和S-HuMSC形態(tài)和表型鑒定

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的HuMSC 和S-HuMSC 均呈長(zhǎng)梭形、漩渦狀、貼壁生長(zhǎng)（圖1）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，HuMSC 和S-HuMSC 均高表達(dá)CD73，CD90 和CD105，不表達(dá)或低表達(dá)CD14，CD34 和CD45（圖2），提示HuMSC 和S-HuMSC符合MSC的生物學(xué)特征。

Fig.1 Morphology of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（HuMSCs）and stimulated HuMSCs（S-HuMSCs）.S-HuMSCs were the HuMSCs activated by tumor necrosis factor-α 20 μg·L-1 and interferon-γ 20 μg·L-1 for 24 h.Both HuMSCs and S-HuMSCs showed spindleshaped growth under an inverted microscope.

Fig.2 Cellular phenotypes of HuMSCs（A）and S-HuMSCs（B）detected by flow cytometry.See Fig.1 for the cell treatment.Both HuMSCs and S-HuMSCs positively expressed CD73，CD90 and CD105，and negatively expressed CD14，CD34 and CD45.

2.2 HuMSC 和S-HuMSC 成骨和成脂誘導(dǎo)分化能力鑒定

HuMSC 和S-HuMSC 成骨誘導(dǎo)分化14 d，ALP染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞ALP 染色面積明顯大于各自自分化對(duì)照組（P＜0.01，圖3A）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，HuMSC 和S-HuMSC 誘導(dǎo)組成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2，ALP和DLX5mRNA 表達(dá)亦顯著高于各自自分化對(duì)照組（P＜0.01，圖3B）。由此表明，HuMSC和S-HuMSC均具有成骨分化能力。

Fig.3 Osteogenic differentiation abilities of HuMSCs and S-HuMSCs.A：alkaline phosphatase（ALP）staining area of HuMSCs and S-HuMSCs after 14 d of osteogenic induction，A2 was the semi-quantitative result of A1.B：the mRNA expressions of osteogenesis-related transcription factors.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with the corresponding self-differentiated control group.

HuMSC和S-HuMSC成脂誘導(dǎo)分化10 d，油紅O 染色可見，誘導(dǎo)組脂滴形成面積明顯多于各自自分化對(duì)照組（P＜0.01，圖4A）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，HuMSC 和S-HuMSC 誘導(dǎo)組成脂分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA 表達(dá)亦顯著高于各自自分化對(duì)照組（P＜0.01，圖4B）。由此表明，HuMSC和S-HuMSC均具有成脂分化能力。

Fig.4 Adipogenic differentiation abilities of HuMSCs and S-HuMSCs.A：oil red O staining area of HuMSCs and S-HuMSCs after 10 d of adipogenic induction，A2 was the semi-quantitative result of A1.B：the mRNA expressions of adipogenic transcription factors.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with the corresponding self-differentiated control group.

2.3 S-HuMSC與HuMSC成脂誘導(dǎo)分化能力和lL-32表達(dá)水平的比較

HuMSC 和S-HuMSC 成脂誘導(dǎo)分化10 d 后，油紅O 染色結(jié)果表明，S-HuMSC 誘導(dǎo)組細(xì)胞脂滴形成面積明顯小于HuMSC 誘導(dǎo)組（P＜0.01，圖5A）；RT-qPCR 結(jié)果表明，S-HuMSC 誘導(dǎo)組成脂分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA 表達(dá)亦低于HuMSC 誘導(dǎo)組（P＜0.05，圖5B），提示S-HuMSC 成脂分化能力較HuMSC 顯著降低。RT-qPCR測(cè)定IL-32mRNA表達(dá)結(jié)果表明，S-HuMSC中IL-32mRNA 表達(dá)顯著高于HuMSC（P＜0.01，圖5C）。

Fig.5 Comparison of adipogenic differentiation ability and IL-32 mRNA expression levels between HuMSCs and S-HuMSCs after 10 d of adipogenic induction.A：oil red O staining area，A2 was the semi-quantitative result of A1.B：the mRNA expressions of adipogenic transcription factors by RT-qPCR.C：IL-32 mRNA expression by RT-qPCR.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with HuMSC group.

2.4 慢病毒感染HuMSC 的效率和lL-32highHuMSC中IL-32 mRNA表達(dá)水平

熒光顯微鏡下可見，與HuMSC相比，NC-HuMSC和IL-32highHuMSC均出現(xiàn)大量綠色熒光（圖6A）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率結(jié)果顯示，NC-HuMSC和IL-32highHuMSC 轉(zhuǎn)染效率均＞90%（圖6B）。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，NC-HuMSC中IL-32mRNA表達(dá)與HuMSC 比較無(wú)明顯變化，IL-32highHuMSC中IL-32mRNA表達(dá)顯著高于HuMSC和NC-HuMSC（P＜0.01）（圖6C）。以上結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)IL-32 的慢病毒可高效感染HuMSC，且IL-32highHuMSC 可穩(wěn)定高表達(dá)IL-32。

Fig.6 Efficiency of lentivirus infection of HuMSCs and expression of IL-32 mRNA in lL-32highHuMSCs.The lentiviral vector containing the over-expression of IL-32 gene sequence with green fluorescent protein（GFP）and puromycin resistance genes（lentiviral vector with IL-32 over-expression）and the negative control（NC）lentiviral vector were constructed before the lentiviruses were harvested.HuMSCs were infected with the lentiviral vector with IL-32 over-expression and NC lentiviral vector，respectively，to obtain IL-32highHuMSCs and NC-HuMSCs.HuMSCs untransfected control group was set up at the same time.A：morphology of the cells under an inverted microscope and GFP expression under a fluorescence microscope；B：transfection efficiency calculated by capturing GFP fluorescence intensity by flow cytometry；C：IL-32 mRNA expression detected by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with HuMSC group；##P＜0.01，compared with NC-HuMSC group.

2.5 lL-32highHuMSC細(xì)胞表型鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，HuMSC，NC-HuMSC和IL-32highHuMSC均高表達(dá)CD73，CD90和CD105，不表達(dá)或低表達(dá)CD14，CD34 和CD45（圖7），提示IL-32highHuMSC表型未發(fā)生改變，符合MSC表型特征。

Fig.7 ldentification of phenotypes of lL-32high HuMSCs by flow cytometry.See Fig.6 for the cell treatment.HuMSCs（A），NC-HuMSCs（B）and IL-32highHuMSCs（C）highly expressed CD73，CD90 and CD105，while CD14，CD34 and CD45 were negatively or lowly expressed.

2.6 過(guò)表達(dá)lL-32抑制HuMSC成脂分化

將HuMSC，NC-HuMSC 和IL-32highHuMSC 進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后第0，3，5，7，10和14天，三者脂滴形成面積隨時(shí)間均呈增加趨勢(shì)。但從誘導(dǎo)后第3 天開始，IL-32highHuMSC 與HuMSC 和NC-HuMSC 相比，其脂滴形成面積均明顯減少（P＜0.01，圖8A）。RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明，從成脂誘導(dǎo)后第3 天開始，與HuMSC 和NC-HuMSC 相比，IL-32highHuMSC 成脂相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA 表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，圖8B）。以上結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)IL-32 對(duì)HuMSC 成脂分化具有抑制作用。

Fig.8 Over-expression of lL-32 on adipogenic differentiation ability of HuMSCs.HuMSCs，NC-HuMSCs and IL-32highHuMSCs were adipogenic induction and their adipogenic differentiation abilities were determined on the 0，3，5，7，10，and 14 days after induction.A：oil red O staining area，A2 was the semi-quantitative result of A1.B：mRNA expressions of adipogenic transcription factors by RT-qPCR.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with HuMSC group；##P＜0.01，compared with NC-HuMSC group.

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球成年人肥胖（身體質(zhì)量指數(shù)＞30 kg·m-2）率近年來(lái)呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)。異位脂質(zhì)的沉積與胰島素抵抗［9］、2 型糖尿?。?0］和非酒精性脂肪性肝病［11］的發(fā)生密切相關(guān)。因此，調(diào)節(jié)脂肪生成對(duì)治療脂肪代謝失衡相關(guān)疾病尤為重要。MSC 是成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的共同祖細(xì)胞，需嚴(yán)格調(diào)控其分化，以維持成骨和成脂的分化平衡。與年齡、絕經(jīng)后和慢性疾病相關(guān)的多種骨質(zhì)疏松性骨丟失疾病的特征是骨髓脂肪生成增加和骨形成減少［12］。MSC 向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化需要重要的信號(hào)通路，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白、Wnt 和Hedgehog 信號(hào)以及特異性轉(zhuǎn)錄因子如RUNX2 和PPARγ 等［13］，其中PPARγ 在脂肪形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在脂肪形成過(guò)程中，MSC表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白423，參與前脂肪細(xì)胞形成，并產(chǎn)生調(diào)節(jié)因子PPARγ和轉(zhuǎn)錄共激活因子C/EBPα/β 從而進(jìn)一步促進(jìn)其分化和成熟［14］。研究報(bào)道，IL-32共含有8 個(gè)外顯子，組合構(gòu)成不同的IL-32剪接異構(gòu)體；IL-32 亞型有9 種，其中最常見的為IL-32α，IL-32β和IL-32γ［15］，其中IL-32β可通過(guò)抑制PPARγ表達(dá)和AMP依賴的蛋白激酶活化而減少脂質(zhì)累積［8］。但它們之間的聯(lián)系錯(cuò)綜復(fù)雜，影響因素也很多，MSC成脂機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本研究首先對(duì)S-HuMSC 和HuMSC 進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化。結(jié)果表明，S-HuMSC 脂滴形成面積明顯小于HuMSC，且成脂相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA表達(dá)亦明顯低于HuMSC，提示S-HuMSC 成脂能力降低；但S-HuMSC 中IL-32mRNA表達(dá)顯著升高。由此推測(cè)，IL-32對(duì)脂肪細(xì)胞形成具有一定的調(diào)控作用。

隨后，用本研究構(gòu)建的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)IL-32 的慢病毒載體轉(zhuǎn)染HuMSC，獲得IL-32highHuMSC，進(jìn)一步驗(yàn)證IL-32 是否參與MSC 成脂分化過(guò)程。首先檢測(cè)IL-32highHuMSC 是否保持MSC 的生物學(xué)特性。結(jié)果表明，IL-32highHuMSC細(xì)胞形態(tài)仍為成纖維樣貼壁生長(zhǎng)，高表達(dá)CD73，CD90 和CD105，低表達(dá)或不表達(dá)CD14，CD34 和CD45，且仍具有成脂分化能力，表明IL-32highHuMSC 具有MSC 的生物學(xué)特性。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，隨成脂誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，IL-32highHuMSC 脂滴形成面積與HuMSC 和NC-HuMSC相比明顯減少；而且從成脂誘導(dǎo)分化后第3 天開始，IL-32highHuMSC 成脂相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，C/EBPα和ADImRNA 表達(dá)與HuMSC 和NC-HuMSC 相比亦顯著降低。由此提示，IL-32 參與調(diào)控HuMSC 的成脂分化，且過(guò)表達(dá)IL-32 對(duì)HuMSC的成脂分化具有抑制作用。

綜上所述，IL-32 在MSC 成脂分化中發(fā)揮重要作用。隨對(duì)其具體調(diào)控機(jī)制的深入研究，其有可能作為調(diào)控MSC 成脂分化的有效靶點(diǎn)，為脂肪代謝失衡相關(guān)疾病的精準(zhǔn)治療提供新思路。