葉煜冰,楊澤銳,3,陳楚君,仇志坤,李 雄,2,3

(1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥學(xué)重點(diǎn)?？?2.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3.國(guó)家藥監(jiān)局藥物警戒技術(shù)研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510000)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性中發(fā)病率較高的癌癥之一[1]。在接受手術(shù)治療或放化療后,仍然有近三分之一的患者最終會(huì)出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)(Biochemical recurrence,BCR)或臨床復(fù)發(fā),預(yù)示著潛在的臨床轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良。能夠早期發(fā)現(xiàn)BCR或臨床進(jìn)展是降低PCa死亡率的關(guān)鍵方法[2]。血清前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)是目前公認(rèn)的用來篩查和診斷PCa的生物標(biāo)志物,但由于其特異性差,它也使得低風(fēng)險(xiǎn)PCa進(jìn)行不必要的活檢或嚴(yán)重過度治療[3]。因此,迫切需要為PCa患者尋找新的早期預(yù)后標(biāo)志物。

失巢凋亡是由于細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ExtraCellular Matrix,ECM)的黏附喪失或細(xì)胞黏附不當(dāng)而誘導(dǎo)出現(xiàn)的一種特殊的細(xì)胞死亡方式[4]。腫瘤細(xì)胞在喪失對(duì)ECM的粘附性后通過旁自分泌以及旁分泌機(jī)制抵抗凋亡繼續(xù)存活,并重新獲得附著能力促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散、侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。研究證實(shí),失巢凋亡相關(guān)基因(anoikis-related genes,ARGs)在包括前列腺癌中的許多腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮作用,包括胃癌[6],頭頸鱗癌[7],膠質(zhì)瘤[8],乳腺癌[9]等。據(jù)報(bào)道,前列腺癌中跨膜絲氨酸蛋白酶4(transmembrane serine protease 4,TMPRSS4)能夠通過上調(diào)SOX2(SRY-Box Transcription Factor 2,SOX2)促進(jìn)失巢凋亡抵抗,提高了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存活率,促進(jìn)腫瘤早期轉(zhuǎn)移[10]。

盡管已證實(shí)失巢凋亡與腫瘤的預(yù)后相關(guān),但基于ARGs的前列腺癌預(yù)后指標(biāo)暫未得到分析。因此,本研究主要基于癌癥基因組數(shù)據(jù)集(The Cancer Genome Atlas Program,TCGA),構(gòu)建一個(gè)基于3個(gè)ARGs構(gòu)成的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型并驗(yàn)證其預(yù)測(cè)能力,為預(yù)測(cè)前列腺癌患者的預(yù)后情況和尋找新的潛在治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)處理通過將TCGA-UCEC(https://xena.ucsc.edu/)的數(shù)據(jù)整合到癌癥基因圖譜(TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov),獲得了419名PCa患者的基因表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù),包括BCR狀態(tài)、BCR生存時(shí)間、年齡、T分期、N分期、PSA值和Gleason評(píng)分。從GeneCards(https://www.genecards.org/)中獲得778個(gè)ARGs,選擇相關(guān)性評(píng)分>0.4的基因。通過在基于基因表達(dá)水平值的交互式分析平臺(tái)(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)中以“PRAD”為關(guān)鍵詞,染色體分布選擇“both”,其他為默認(rèn)選項(xiàng),獲得了PCa中差異表達(dá)基因(Differentially expressed gene,DEGs),建立火山圖。最后,通過與DEGs數(shù)據(jù)集取交集獲得差異表達(dá)的ARGs。

1.2 GO和KEGG通路富集分析為進(jìn)一步了解與前列腺癌相關(guān)的失巢凋亡基因所涉及的生物學(xué)功能和通路,使用R包“clusterProfler”進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)和京都基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。設(shè)定分析的物種為“智人”,顯著性水平P值<0.05。

1.4 建立基于ARGs的列線圖通過將419名患者的臨床信息與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相結(jié)合,并使用R語言中的“survival”等包進(jìn)行獨(dú)立預(yù)后分析。此外,基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和其他臨床病理學(xué)特征創(chuàng)建了基于ARGs的列線圖以預(yù)測(cè)病例的臨床結(jié)果,繪制校準(zhǔn)曲線,通過折線圖的預(yù)測(cè)能力與觀察到的生存結(jié)果進(jìn)行比較來估計(jì)ARGs的可靠性。

1.5 免疫浸潤(rùn)分析基于TCGA訓(xùn)練集數(shù)據(jù),使用CIBERSORT(Cell-type Identification By Estimating Relative Subsets Of RNA Transcripts,CIBERSORT)工具量化了22種類型的免疫細(xì)胞比例。將P<0.05設(shè)置為閾值。此外,采用單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)方法反映前列腺癌中免疫微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)的狀態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)分類和分析由R軟件(4.2.1)完成。應(yīng)用Kaplan-Meier(K-M)分析評(píng)估兩組之間的生存差異。使用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析測(cè)試了ARGs模型的可靠性。所有分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性均設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)失巢凋亡基因的確定和功能分析從GEPIA數(shù)據(jù)庫中共收集3005個(gè)差異表達(dá)基因DEGs(圖1a),接下來將這些DEGs與從GeneCards中提取的445個(gè)失巢凋亡基因ARGs取交集,獲得了82個(gè)在前列腺癌中差異表達(dá)的失巢凋亡基因(differentially expressed anoikis-related genes,DE-ARGs)(圖1b)。為了進(jìn)一步探索PCa中發(fā)生失巢凋亡的可能途徑,我們采用clusterProlifer包對(duì)82個(gè)DE-ARGs的GO和KEGG通路分析進(jìn)行處理。結(jié)果顯示,在生物過程方面(biological process,BP),DE-ARGs主要與細(xì)胞黏附調(diào)控、阿米巴型細(xì)胞遷移、細(xì)胞-底物黏附等有關(guān)(圖1c)。從細(xì)胞成分(cellular component,CC)來看,DE-ARGs在含有膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞前緣和局部黏附中具有極大的參與性。在分子功能(molecular function,MF)方面,82個(gè)DE-ARGs主要與整合素結(jié)合、生長(zhǎng)因子結(jié)合和蛋白酶結(jié)合。KEGG富集分析顯示,這些差異基因主要富集于PI3K-Akt信號(hào)通路、局部黏附,腫瘤中的MicroRNAs,Rap1信號(hào)通路和Ras信號(hào)通路等(圖1d)。

圖1 差異表達(dá)的失巢凋亡相關(guān)基因(DE-ARGs)

2.2 ARGs預(yù)后標(biāo)志物的構(gòu)建和驗(yàn)證我們將419名PCa患者隨機(jī)分為訓(xùn)練集(n=210)和驗(yàn)證集(n=209)。采用單變量Cox方法在訓(xùn)練集中獲得6個(gè)與BCR生存相關(guān)的ARGs:GNE(UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase,GNE)、凋亡抑制因子5(baculoviral IAP repeat containing5,BIRC5)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、糖基化轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated protein 1,MTA1)、肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1),見圖2a。然后使用LASSO線性回歸和多元Cox分析來確定預(yù)后標(biāo)志物最具預(yù)測(cè)性的基因,發(fā)現(xiàn)3個(gè)潛在的預(yù)測(cè)因子(GNE、PTGS2、OGT)(圖2b～d)。采用以下風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式,風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=[GNE×(-0.2806))+(PTGS2×(-0.3445))+(OGT×(1.0868)]。利用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中值將病例分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組。箱式圖結(jié)果顯示6個(gè)基因在正常組織和PCa組織中基因表達(dá)存在差異,P<0.05(圖2e)。具體數(shù)值分別為:GNE(5.1e-3),BIRC5(5.2e-19),PTGS2(4.7e-11),OGT(4.0e-15),MTA1(2.4e-4),MALAT1(1.9e-5)。

圖2 差異失巢凋亡相關(guān)標(biāo)志物的鑒定

2.3 驗(yàn)證3個(gè)ARGs在無BCR生存預(yù)測(cè)中的作用在訓(xùn)練集中,我們指定的ARGs可以區(qū)分PCa樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床狀態(tài)(圖3a～b)。 K-M分析顯示,與低風(fēng)險(xiǎn)組相比,高危組的無進(jìn)展生存期(recurrence free survival,RFS)較差(圖3c)。其預(yù)測(cè)患者1年,3年和5年復(fù)發(fā)率的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的ROC曲線下的面積(area under curve,AUC)分別為0.76,0.74和0.68(圖3d)。應(yīng)用測(cè)試集和整個(gè)隊(duì)列來驗(yàn)證ARGs的預(yù)測(cè)性能。PCa患者在測(cè)試集和整個(gè)隊(duì)列中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床狀態(tài)的布局如圖3e～f和圖3i～j,兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之間的預(yù)后差異也在測(cè)試集和整隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證,如圖3g和圖3k所示,高風(fēng)險(xiǎn)組表現(xiàn)出更差的預(yù)后,差異具有顯著性意義,p值分別為4.996e-2,3.796e-2。ROC曲線表明ARGs在測(cè)試和整組中的預(yù)測(cè)可靠性。結(jié)果顯示測(cè)試集中預(yù)測(cè)患者1年,3年和5年生化復(fù)發(fā)率的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC值分別為0.58,0.68和0.61,整個(gè)隊(duì)列中與預(yù)測(cè)患者1年,3年和5年復(fù)發(fā)率的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC值分別為0.62,0.73,0.71,見圖3h和圖3l。表明該風(fēng)險(xiǎn)模型可用于預(yù)測(cè)預(yù)后。

圖3 PCa中ARGs的預(yù)測(cè)價(jià)值

2.4 列線圖的確定為了確定ARGs模型的獨(dú)立意義,我們應(yīng)用單變量和多變量Cox分析顯示,訓(xùn)練集中PSA值和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分均可作為PCa獨(dú)立預(yù)后因素,PSA值(P<0.001),風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(P=0.001),見圖4a～b。為了進(jìn)一步挖掘ARGs的預(yù)后價(jià)值,結(jié)合臨床因素如年齡、T分期、N分期、PSA數(shù)值和Gleason評(píng)分。我們構(gòu)建了用于預(yù)測(cè)PCa患者1、3、5年生存率的諾模圖(圖4c～d),訓(xùn)練集和測(cè)試集列線圖的C-index分別為0.784和0.702,表明上述列線圖相當(dāng)令人滿意的預(yù)測(cè)性能。此外,校準(zhǔn)曲線的結(jié)果表明上述諾模圖有良好的預(yù)測(cè)性能。(圖4e～h))

圖4 基于ARGs列線圖的構(gòu)建

2.5 ARGs模型的免疫活性分析為了探究ARGs與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性,我們使用CIBERSORT算法來分析訓(xùn)練集中ARGs在22種免疫細(xì)胞中的比例(圖5a)。此外,我們還使用ssGSEA進(jìn)一步比較分析TCGA訓(xùn)練集和測(cè)試集隊(duì)列中低、高風(fēng)險(xiǎn)人群中間16種免疫細(xì)胞的富集分?jǐn)?shù)和13種免疫相關(guān)通路的活性。結(jié)果顯示,在訓(xùn)練集中,高風(fēng)險(xiǎn)人群免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度普遍較低,活化的樹突狀細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞,未成熟的樹突狀細(xì)胞,肥大細(xì)胞,自然殺傷細(xì)胞,Th1和Th2細(xì)胞以及T調(diào)節(jié)細(xì)胞在高低風(fēng)險(xiǎn)組的分布有差異,尤其是肥大細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞,見圖5b。與低風(fēng)險(xiǎn)組相比,高風(fēng)險(xiǎn)組的一些免疫通路下調(diào),如抗原呈遞細(xì)胞共抑制、CC趨化因子受體、Ⅱ型干擾素反應(yīng)等(圖5c),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如表1所示。

圖5 訓(xùn)練集中ARGs的免疫藍(lán)圖分析

表1 ARGs在16種免疫細(xì)胞和13種免疫相關(guān)通路分析結(jié)果

3 討論

前列腺癌是危害男性健康的惡性腫瘤之一,容易發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌。這種疾病在早期階段很難被診斷出來,可靠的預(yù)后生物標(biāo)志物可以幫助準(zhǔn)確評(píng)價(jià)前列腺癌患者的預(yù)后情況。失巢凋亡是一種特殊的凋亡細(xì)胞死亡方式,發(fā)生失巢凋亡抵抗的細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生,是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一[11]。這種獨(dú)特的死亡方式吸引了大量研究,例如,色素框同源物2(chromobox homolog 2,CBX2)被確定為高級(jí)漿液卵巢癌中發(fā)生失巢凋亡逃逸和擴(kuò)散的驅(qū)動(dòng)因素。CBX2的缺失可以抑制細(xì)胞增殖,降低干性,并增加順鉑敏感性[12]。環(huán)狀RNAs(CircCEMIP)通過增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的保護(hù)性自噬來促進(jìn)失巢凋亡抵抗[13]。同樣的,轉(zhuǎn)錄因子BRN2表達(dá)能夠誘導(dǎo)c-MET水平和STAT3的磷酸化增加,從而增加在黑色素瘤中的抗失巢凋亡[14]。在肺腺癌、肝細(xì)胞癌中,癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule6,CEACAM6),GTP酶激活蛋白1(IQ motif containing GTPase-activating protein 1,IQGAP1)的表達(dá)均能通過激活Src-FAK信號(hào)通路來抑制失巢凋亡。表明它們可作為腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后指標(biāo)之一[15-16]。然而,失巢凋亡及其相關(guān)基因在PCa中的具體作用尚不清楚。

在本研究中,首先通過TCGA等數(shù)據(jù)庫獲得前列腺癌患者的基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù),利用GeneCards數(shù)據(jù)庫確定PCa中相關(guān)的失巢凋亡基因。為了檢測(cè)差異表達(dá)失巢凋亡基因影響的潛在生物學(xué)途徑,我們通過GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因主要激活了各種腫瘤通路。GO分析結(jié)果顯示主要與細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附有關(guān),KEGG分析主要在PI3K-AKT信號(hào)通路,局部粘附,Rap1信號(hào)通路,腫瘤中的MicroRNAs中富集。這些通路都參與PCa的發(fā)生發(fā)展。例如,MicroRNA-151通過靶向PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)人前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),化療敏感性和轉(zhuǎn)移[17]。Rap1信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)整合素和鈣粘蛋白,兩者在細(xì)胞對(duì)ECM的黏附和細(xì)胞間黏附中起重要作用[18]。在前列腺癌細(xì)胞中,信號(hào)誘導(dǎo)增殖相關(guān)1(signal-induced proliferation-associated 1,SIPA1)通過抑制Rap1介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)ECM的粘附促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。Talin1作為一種粘附復(fù)合物蛋白通過局部粘附信號(hào)傳導(dǎo)和失巢凋亡抵抗促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[20],因此,推測(cè)失巢凋亡基因可能主要通過激活以上通路促進(jìn)PCa生化復(fù)發(fā)的發(fā)生。

為獲得PCa的生化復(fù)發(fā)預(yù)后指標(biāo),我們將所有患者分為訓(xùn)練集和測(cè)試集。進(jìn)行逐步回歸后,在訓(xùn)練集中開發(fā)了3個(gè)基于ARGs的預(yù)后模型,并將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。數(shù)據(jù)顯示兩組的預(yù)后存在差異。并在測(cè)試集和TCGA整個(gè)隊(duì)列確認(rèn)了3個(gè)標(biāo)志物的準(zhǔn)確性。為了進(jìn)一步研究ARGs模型的功能,我們生成了一個(gè),結(jié)合了年齡、分級(jí)、階段和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分等因素的列線圖。同時(shí)校準(zhǔn)圖顯示列線圖與預(yù)后指標(biāo)的預(yù)測(cè)具有很好的擬合。

我們提出的ARGs模型與PCa患者的生存結(jié)果密切相關(guān)。包括OGT、PTGS2、GNE。OGT廣泛存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,參與基因表達(dá)、代謝反應(yīng)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等與細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)狀況相關(guān)的反應(yīng)的調(diào)控[21]。有研究發(fā)現(xiàn)OGT在胰腺癌腫瘤組織中表達(dá)水平大幅升高,高水平的OGTmRNA表達(dá)與PDAC患者的總體生存率低下有關(guān)[22]。此外,OGT還能促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中脂質(zhì)代謝和腫瘤的發(fā)展,可能作為潛在的治療靶點(diǎn)[23]。相反,OGT下調(diào)促進(jìn)卵巢癌中順鉑耐藥的發(fā)生,可作為化療耐藥新的分子標(biāo)志物[24]。而我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)OGT在高風(fēng)險(xiǎn)組中表達(dá)升高。PTGS2是前列腺素的一種限速酶,PTGS2/NF-κB信號(hào)通路參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射耐受性和PCa細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲進(jìn)展[25-26]。在胃癌中表達(dá)上調(diào),與患者生存率低有關(guān)?？捎米鬏o助治療靶點(diǎn)來逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的化學(xué)耐藥性[27]。GNE作為一種激酶,是唾液酸合成過程中的主要調(diào)節(jié)因子之一[28]。GNE表達(dá)的改變可導(dǎo)致唾液酸化模式的改變,引起包括癌癥,神經(jīng)退行性疾病和感染性疾病等多種疾病表型[29]。研究發(fā)現(xiàn),GNEmRNA和蛋白表達(dá)在人淋巴瘤細(xì)胞和人髓系白血病細(xì)胞中表達(dá)顯著降低,富含CpG的GNE啟動(dòng)子異常高甲基化,導(dǎo)致GNE表達(dá)沉默[28,30],關(guān)于GNE和OGT基因在前列腺癌中的作用尚未明確,值得開展進(jìn)一步的研究。

免疫抑制細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中腫瘤免疫逃逸的發(fā)生,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。但前列腺癌是典型的“冷腫瘤”之一,腫瘤內(nèi)殺傷性T細(xì)胞浸潤(rùn)少,抑制性免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞比較多[31]。有研究報(bào)道Th1細(xì)胞與PCa進(jìn)展最相關(guān),T調(diào)節(jié)細(xì)胞與PCa患者預(yù)后之間存在正相關(guān)關(guān)系[32]。Th2細(xì)胞和中樞記憶性T細(xì)胞與根治性前列腺切除術(shù)后前列腺癌復(fù)發(fā)有關(guān),是復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因子[33-34]。在這項(xiàng)研究中,我們發(fā)現(xiàn)幾種免疫細(xì)胞的組成在高風(fēng)險(xiǎn)組中表達(dá)低,包括Th2細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞,肥大細(xì)胞,NK細(xì)胞和Treg細(xì)胞等。而PCa的典型腫瘤微環(huán)境表現(xiàn)為T細(xì)胞密度降低,尤其是在CD8細(xì)胞亞群中。這種從TME中排除T細(xì)胞有助于形成免疫特權(quán)位點(diǎn)[35]?？傮w而言,高風(fēng)險(xiǎn)組患者的免疫細(xì)胞在腫瘤組織中浸潤(rùn)的比例較低,表明高風(fēng)險(xiǎn)組患者可能抑制前列腺癌中的免疫反應(yīng)。

綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)了可能參與PCa生化復(fù)發(fā)過程的失巢凋亡相關(guān)基因的預(yù)后價(jià)值,這些基因?qū)︻A(yù)測(cè)患者的BCR有重要價(jià)值。盡管我們提出的ARGs在預(yù)測(cè)PCa患者的預(yù)后方面顯示出強(qiáng)大的性能,但本研究具有一定的局限性。首先,當(dāng)前研究中分析的所有PCa病例臨床隊(duì)列僅從TCGA網(wǎng)站獲得。ARGs模型的效力也需要由外部隊(duì)列進(jìn)行驗(yàn)證。其次,這是一項(xiàng)基于TCGA數(shù)據(jù)庫的回顧性研究,缺乏吸煙史等其他因素可能影響前列腺癌預(yù)后的信息。此外,應(yīng)基于實(shí)驗(yàn)分析來闡釋ARGs基因的潛在分子機(jī)制。