屈翔宇,戴恒文,童 旭,張文靜,陸 進(jìn)

(蚌埠醫(yī)科大學(xué) 1.臨床醫(yī)學(xué)院2020級(jí);2.臨床醫(yī)學(xué)院2022級(jí);3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,安徽 蚌埠 233030)

肝癌是一種全球常見的消化道惡性腫瘤,也是癌癥的主要死亡原因之一[1]。在所有肝癌病例中,肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占80%以上,是原發(fā)性肝癌中最常見的一種亞型[2]。HCC具有隱蔽性強(qiáng),預(yù)后差的特點(diǎn)。早期無明顯癥狀,而到了晚期就僅有3個(gè)月的生存時(shí)間,并且5年生存率不足20%[3]。目前,HCC的治療方法包括肝切除,肝移植,消融和聯(lián)合治療,但這些治療方法的復(fù)發(fā)率較高,并且無法應(yīng)用于晚期患者[4]?；熀兔庖咧委熆蓱?yīng)用于晚期患者,但由于腫瘤耐藥性的發(fā)展,這些治療也可能會(huì)無效[4]。因此,探索能夠預(yù)測患者預(yù)后和治療反應(yīng)的預(yù)后標(biāo)志物十分重要。

中心體是一種非膜質(zhì)細(xì)胞器,由一對中心粒構(gòu)成。在人體內(nèi),中心體主要參與有絲分裂紡錘體的形成、染色體的分離、細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)和纖毛的形成。最近的研究表明,中心體異常會(huì)引起細(xì)胞分裂失敗以及染色體的不穩(wěn)定,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。目前,在許多類型的癌癥中均觀察到中心體異常[5]。因此,對于中心體相關(guān)基因(centrosome related genes,CRGs)的研究將有利于尋找新的HCC預(yù)后標(biāo)志物,并為HCC的治療提供新的思路。

本研究從MSigDB和已報(bào)到文獻(xiàn)中收集CRGs,使用LASSO Cox回歸構(gòu)建預(yù)后模型。國際癌癥組聯(lián)盟(International Cancer Group Consortium,ICGC)數(shù)據(jù)庫用于驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。此外,還進(jìn)一步探究了高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的生物學(xué)功能、免疫浸潤以及對化療和免疫治療的反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與處理從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載TCGA-LIHC隊(duì)列的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù),其中包括50例正常組織樣本和374例HCC樣本;從ICGC數(shù)據(jù)庫(https://dcc.icgc.org/)中下載LIRI-JP隊(duì)列的243例HCC樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。CRGs從MSigDB(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)數(shù)據(jù)庫和已報(bào)到文獻(xiàn)[6]中獲得。具體分析思路與流程圖見圖1。

圖1 研究流程圖

1.2 CRGs差異分析和預(yù)后分析使用R軟件“l(fā)imma”包比較CRGs在TCGA-LIHC隊(duì)列正常樣本和腫瘤樣本之間的表達(dá)差異,以|log2FC|>1且FDR<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異基因。對差異基因進(jìn)行單因素Cox分析,以P<0.001為標(biāo)準(zhǔn)篩選出預(yù)后基因。

1.3 聚類分析基于預(yù)后基因的表達(dá)量,使用R軟件“ConsensusClusterPlus”包對TCGA-LIHC隊(duì)列的HCC樣本進(jìn)行聚類分析,根據(jù)累積分布函數(shù)(cumulative distribution function,CDF)和CDF曲線下面積變化確定最佳聚類結(jié)果。Kaplan-Meier曲線用于探究不同聚類之間的生存差異。R軟件“GSVA”包用于探究不同聚類之間生物學(xué)功能的差異。

1.4 構(gòu)建預(yù)后模型為防止模型過度擬合,以TCGA-LIHC隊(duì)列作為訓(xùn)練組,使用最小絕對值選擇與收縮算子(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO) Cox回歸對預(yù)后基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選并構(gòu)建預(yù)后模型。根據(jù)基因表達(dá)量和回歸系數(shù)(coef)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=Σcoef×基因表達(dá)量。依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將HCC患者分成高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。Kaplan-Meier曲線用于探究兩組之間的生存差異,接受者操作特性(receiver operating characteristic,ROC)曲線用于評(píng)估模型的準(zhǔn)確性。隨后,使用ICGC數(shù)據(jù)庫的LIRI-JP隊(duì)列進(jìn)行外部驗(yàn)證,采用與訓(xùn)練組相同的公式計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,并根據(jù)訓(xùn)練組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將患者分成高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。Kaplan-Meier曲線和ROC曲線用于驗(yàn)證預(yù)后模型。

1.5 基因富集分析使用R軟件“l(fā)imma”包,以|log2FC|>1且FDR<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異基因。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因本體論(gene ontology,GO)用于探究差異基因的生物學(xué)功能。

1.6 免疫浸潤分析使用XCELL、TIMER、QUANTISEQ、MCPCOUNTER、EPIC、CIBERSORT-ABS、CIBERSORT七種方法分析免疫浸潤與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的相關(guān)性。單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)用于計(jì)算高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組中免疫細(xì)胞和免疫相關(guān)功能的評(píng)分,以比較兩組之間的免疫活性。隨后本文探究了免疫檢查點(diǎn)基因在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中的表達(dá)。

1.7 化療和免疫治療分析腫瘤免疫功能障礙和排除(tumor immune dysfunction and exclusion,TIDE)評(píng)分用于評(píng)估免疫治療的效果,本研究計(jì)算了高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的TIDE評(píng)分。IMvigor210隊(duì)列用于探究高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組對抗PD-L1治療的反應(yīng)。IMvigor210隊(duì)列的表達(dá)數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)來源于http://research pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies。R軟件“pRRophetic”包用于計(jì)算多柔比星、埃博霉素B、絲裂霉素C在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中的半最大抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50),以評(píng)估兩組對三種化療藥物的敏感性。將高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異基因上傳到CMAP數(shù)據(jù)庫,以預(yù)測能夠治療HCC的小分子化合物。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析R軟件(4.2.1)用于本文的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Wilcoxon檢驗(yàn)用于評(píng)估兩組之間的差異,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 CRGs的差異表達(dá)和預(yù)后分析從MSigDB中的11個(gè)基因集和先前文獻(xiàn)中共收集到132個(gè)CRGs。使用TCGA-LIHC隊(duì)列正常樣本和腫瘤樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)鑒定出77個(gè)差異基因(圖2A～B)。隨后,對差異基因進(jìn)行單因素Cox分析,發(fā)現(xiàn)有46個(gè)基因與預(yù)后相關(guān)(圖2C)。

圖2 中心體相關(guān)基因的差異分析和預(yù)后分析

2.2 聚類分析基于預(yù)后基因的表達(dá),對TCGA-LIHC隊(duì)列的HCC樣本進(jìn)行聚類分析,根據(jù)CDF曲線及曲線下面積變化確定K=3為最佳聚類結(jié)果(圖3A～C)。熱圖結(jié)果顯示,中心體相關(guān)預(yù)后基因在A聚類中高表達(dá),在B聚類中低表達(dá)(圖3D)。生存分析結(jié)果顯示,B聚類的總生存率最高,A聚類的總生存率最低(圖3E)。使用GSVA富集分析探究高表達(dá)聚類(A聚類)和低表達(dá)聚類(B聚類)生物功能的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期、DNA復(fù)制以及同源重組等通路在兩組之間具有顯著差異(圖3F)。

圖3 肝細(xì)胞癌樣本的聚類分析

2.3 預(yù)后模型的構(gòu)建基于TCGA-LIHC隊(duì)列的樣本數(shù)據(jù),對46個(gè)中心體相關(guān)預(yù)后基因使用LASSO Cox回歸分析,共篩選出8個(gè)基因(CEP85、KIF3A、MYCN、NDRG1、NPM1、PARD3、SAC3D1、TUBG1)(全稱見表1)用于構(gòu)建預(yù)后模型(圖4A～B)。根據(jù)LASSO Cox回歸分析的結(jié)果計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=0.051 317×CEP85+0.006 093×KIF3A+0.029 806×MYCN+0.0016 26×NDRG1+0.002 449×NPM1+0.001 187×PARD3+0.000 952×SAC3D1+0.004 556×TUBG1。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將患者劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。TCGA-LIHC隊(duì)列和LIRI-JP隊(duì)列的Kaplan-Meier分析結(jié)果均顯示高風(fēng)險(xiǎn)組的總生存率(overall survival,OS)降低(圖4C,E)。ROC分析結(jié)果顯示,TCGA-LIHC隊(duì)列1年、2年、3年OS的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.789,0.696,0.692(圖4D),LIRI-JP隊(duì)列1年、2年、3年OS的AUC值為0.689,0.750,0.735(圖4F),表明模型具有良好的預(yù)測能力。TCGA-LIHC隊(duì)列的生存狀態(tài)分布圖顯示,隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增加,患者的死亡率升高,生存率降低(圖5A～B)。熱圖顯示8個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因在高風(fēng)險(xiǎn)組中高表達(dá)(圖5C)。而對LIRI-JP隊(duì)列的分析也得到了同樣的結(jié)果(圖5D～F)。對臨床性狀和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行單因素Cox和多因素Cox分析。單因素Cox分析結(jié)果顯示,TCGA-LIHC隊(duì)列的臨床分期、T分期、M分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分以及LIRI-JP隊(duì)列的性別、臨床分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素(圖6A,C)。多因素Cox分析結(jié)果顯示,TCGA-LIHC隊(duì)列的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、LIRI-JP隊(duì)列的性別、臨床分期以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是影響預(yù)后的獨(dú)立因素(圖6B,D)。

表1 8個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因

圖4 預(yù)后模型的構(gòu)建和驗(yàn)證

圖5 預(yù)后模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和生存狀態(tài)分布

圖6 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的獨(dú)立預(yù)后分析

2.4 基因富集分析為進(jìn)一步探究高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組潛在的生物學(xué)機(jī)制,對兩組之間的差異基因進(jìn)行KEGG和GO分析。KEGG結(jié)果顯示,差異基因在肝癌、膀胱癌以及p53信號(hào)通路等癌癥相關(guān)通路中顯著富集(圖7A)。GO結(jié)果顯示,差異基因在中心體重復(fù)、Toll樣受體的結(jié)合及中心粒等通路富集(圖7B)。

圖7 高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的生物學(xué)功能和免疫狀態(tài)

2.5 免疫浸潤分析免疫浸潤在腫瘤進(jìn)展過程中具有重要作用,且能夠反映免疫治療的效果。本研究使用ssGSEA計(jì)算高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組免疫細(xì)胞和免疫功能的評(píng)分。結(jié)果顯示,活化的樹突狀細(xì)胞(activated Dendritic Cells,aDCs)、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer cells,NK cells)等免疫細(xì)胞的評(píng)分;檢查點(diǎn)、主要組織相容性復(fù)合體I(Major Histocompatibility Complex I,MHCI)、2型干擾素等免疫功能的評(píng)分在兩組之間具有顯著差異(圖7C)。之后分析了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和免疫浸潤之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示,大部分免疫浸潤與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)(圖7D)。人的腫瘤共有6種免疫亞型,包括C1(傷口愈合)、C2(IFN-G主導(dǎo))、C3(炎癥)、C4(淋巴細(xì)胞耗竭),C5(免疫沉默)、C6(TGF-B主導(dǎo))。本文探究了每種免疫亞型與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)C1與高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān),而C3與低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān)(圖7E)。免疫檢查點(diǎn)分析結(jié)果顯示,免疫檢查點(diǎn)基因在高風(fēng)險(xiǎn)組中高表達(dá)(圖7F)。

2.6 化療和免疫治療分析由于高風(fēng)險(xiǎn)組的免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)量更高,表明高風(fēng)險(xiǎn)組可能對免疫治療更敏感,TIDE評(píng)分的計(jì)算結(jié)果也表明高風(fēng)險(xiǎn)組接受免疫治療的效果更好(圖8A)。為進(jìn)一步探究高風(fēng)險(xiǎn)組接受免疫治療的效果,本研究使用IMvigor210隊(duì)列探究高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組對抗PD-L1治療的反應(yīng)。結(jié)果顯示,免疫治療反應(yīng)組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分更高。高風(fēng)險(xiǎn)組接受抗PD-L1治療后擁有更高的緩解率和更長的生存時(shí)間(圖8B～D)。本研究還計(jì)算了多柔比星,埃博霉素B,絲裂霉素C三種化療藥物在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中的IC50,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種化療藥物在高風(fēng)險(xiǎn)組的IC50更低,表明高風(fēng)險(xiǎn)組對于三組化療藥物更敏感(圖8E～G)。此外,將高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異基因上傳到CMAP數(shù)據(jù)庫,以評(píng)分小于-80為標(biāo)準(zhǔn)共篩選出38個(gè)具有潛在治療效果的小分子化合物(圖8H)。

圖8 高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組對化療和免疫治療的反應(yīng)

3 討論

肝細(xì)胞癌是一種發(fā)病率和死亡率都很高的惡性腫瘤。由于腫瘤的異質(zhì)性,臨床上很難預(yù)測患者的預(yù)后,給臨床治療帶來了很大的困難。目前越來越多的研究表明,中心體的異常與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[7]。例如,中心體蛋白70(CEP70)過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致微管紊亂和多極染色體的形成,進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展[8]。中心體蛋白72(CEP72)通過介導(dǎo)SERPINE1促進(jìn)膀胱癌的侵襲和遷移[9]。但CRGs在HCC中的預(yù)后尚不清楚。本研究構(gòu)建了CRGs在HCC中的預(yù)后模型,能夠預(yù)測HCC患者的預(yù)后及對化療和免疫治療的敏感性,為臨床治療提供幫助。

本研究從MSigDB和先前的文獻(xiàn)中收集到132個(gè)CRGs,其中有77個(gè)基因具有表達(dá)差異,46個(gè)基因與預(yù)后相關(guān)。最終篩選出8個(gè)CRGs(CEP85、KIF3A、MYCN、NDRG1、NPM1、PARD3、SAC3D1、TUBG1)用于構(gòu)建預(yù)后模型。訓(xùn)練組和驗(yàn)證組ROC曲線的AUC值表明模型對HCC患者預(yù)后的預(yù)測較為準(zhǔn)確。單因素Cox和多因素Cox分析結(jié)果表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以作為肝細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)后因子。

CEP85在機(jī)體中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)中心體的分離。研究表明,CEP85與STIL之間的相互作用能夠介導(dǎo)PLK4從而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[10]。KIF3A是驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員之一,在機(jī)體中參與纖毛生成、細(xì)胞遷移和分裂[11]。研究表明,KIF3A能夠通過Wnt信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌的增殖和侵襲[12]。此外,抑制KIF3A的表達(dá)可以通過抑制Rb-E2F信號(hào)傳導(dǎo)和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制三陰性乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[13]。MYCN是MYC家族成員之一。實(shí)驗(yàn)表明,MYCN在HCC中過表達(dá),并與HCC的不良預(yù)后相關(guān)[14]。最近的研究證實(shí)MYCN可作為HCC復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物和抗HCC治療的靶標(biāo)[15]。NDRG1是NDRG家族成員之一,在機(jī)體中能夠促進(jìn)脂肪的生成并維持脂肪的功能[16]。研究表明,NDRG1在HCC中過表達(dá),并與較差的預(yù)后相關(guān)[17]。此外,NDRG1可以通過調(diào)節(jié)整合素β3以抑制HCC的增殖和侵襲[18]。NPM1是一種核仁伴侶蛋白,在機(jī)體中參與基因組穩(wěn)定,中心體復(fù)制,DNA修復(fù)等多種生物學(xué)功能[19]。NPM1能夠調(diào)節(jié)激活轉(zhuǎn)錄因子5(ATF5)進(jìn)而促進(jìn)HCC的增殖和存活[19]。并且,NPM1也能夠介導(dǎo)HCC對索拉菲尼的耐藥[20]。PARD3是一種支架蛋白,與多數(shù)癌癥的增殖,遷移和侵襲密切相關(guān)[21]。研究表明,PARD3在HCC中高表達(dá),并與HCC的不良預(yù)后相關(guān)[22]。敲低PARD3能夠抑制HCC的增殖,自噬和血管形成。SAC3D1是一種中心體相關(guān)蛋白,在機(jī)體中參與細(xì)胞周期,中心體復(fù)制和紡錘體形成。研究表明,SAC3D1在HCC中過表達(dá),并與HCC的不良預(yù)后相關(guān),可以作為HCC的預(yù)后標(biāo)志物[23]。TUBG1是微管蛋白超家族的成員,參與細(xì)胞周期和微管的形成。TUBG1在HCC中高表達(dá),并與HCC的不良預(yù)后相關(guān)。TUBG1在體外能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲,并能抑制細(xì)胞凋亡[24]。

為了進(jìn)一步探究高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的生物學(xué)功能,本研究進(jìn)行了KEGG和GO分析。結(jié)果表明差異基因主要與癌癥和中心體相關(guān)。ssGSEA分析結(jié)果顯示,aDCs、肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞評(píng)分,檢查點(diǎn)、MHC I、2型干擾素等免疫功能評(píng)分在兩組之間具有顯著差異。本研究分析了免疫浸潤和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的相關(guān)性,結(jié)果顯示,多數(shù)的免疫浸潤與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)。免疫亞型與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分關(guān)系的分析結(jié)果顯示,C1和C2與高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān),C3和C4與低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān)。免疫治療已成為腫瘤治療中的重要部分,而免疫治療抑制劑是腫瘤免疫治療中最主要的部分。目前CTLA-4和PD-L1等免疫檢查點(diǎn)的抑制劑已應(yīng)用于癌癥的治療,為癌癥患者帶來了新的希望。本研究探究了免疫檢查點(diǎn)基因在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中的表達(dá),結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)組接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的效果更好。IMvigor 210隊(duì)列是一項(xiàng)為評(píng)估PD-L1抗體阿特珠單抗在晚期尿路上皮癌中活性的Ⅱ期研究[25]。使用IMvigor 210隊(duì)列探究抗PD-L1治療反應(yīng)組和非反應(yīng)組與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的關(guān)系,結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)組接受抗PD-L1治療的效果更好。除免疫治療,本文還探究了高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組對多柔比星、埃博霉素B和絲裂霉素C的敏感性,結(jié)果顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組對三種化療藥物的敏感性更高。此外,使用CMAP數(shù)據(jù)庫分析高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異基因,最終鑒定出38個(gè)具有潛在治療效果的小分子化合物。

綜上所述,本研究從中心體相關(guān)基因出發(fā),構(gòu)建了HCC預(yù)后模型,為預(yù)測HCC患者的預(yù)后以及對化療和免疫治療的反應(yīng)提供幫助。但是,本研究仍然存在一定局限性,使用公共數(shù)據(jù)庫構(gòu)建預(yù)后模型,還需要大量的臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。此外,8個(gè)風(fēng)險(xiǎn)基因在肝細(xì)胞癌中的作用還需要實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。