鄭萬財

黨 斌1,2

張 跡3

羅巧玉4

馮作山5

(1. 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實驗室,青海 西寧 810023;2. 青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室,青海 西寧 810023;3. 淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 淮安 223300;4. 青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,青海 西寧 810023;5. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000)

近年來,對植物中的活性成分的分析成為研究熱點。其中,原花青素(procyanidins,PCs)作為一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[1-5]。然而,原花青素對人體細胞的影響及其相關(guān)功能尚不完全清楚。原花青素是植物中廣泛存在的酚類化合物[6-8],主要被應(yīng)用于保健食品、功能性食品和生物醫(yī)藥等方面的開發(fā)利用[9-11]。目前,HepG2細胞作為人類肝癌細胞系,在肝癌研究中被廣泛應(yīng)用。通過研究原花青素對HepG2細胞的影響,可以探索其對肝癌的潛在治療作用。然而,有關(guān)原花青素對HepG2細胞及其相關(guān)功能的影響機制還存在許多未知之處[12-15]。中國肝癌發(fā)病總數(shù)占全球肝癌病人總數(shù)的50%,已成為影響人們生命健康的主要疾病[16]?；瘜W(xué)療法是肝癌中最常用的治療方法,由于癌細胞的劑量限制和耐藥性,化學(xué)藥物不能完全有效地治療癌癥[17]。

研究擬采用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù)[18-20],通過分析HepG2細胞在原花青素處理前后的基因表達差異,來鑒定潛在的關(guān)鍵基因和通路。利用RNA-Seq技術(shù)研究葡萄籽原花青素對HepG2細胞的作用機制,為進一步研究其在肝癌治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。同時,也有助于拓展對原花青素的認識,并為開發(fā)植物活性成分的藥物提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽原花青素:原花青素質(zhì)量分數(shù)>95%,四川省維克奇生物科技有限公司;

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清:美國Corning公司;

HepG2細胞:北京中科院生物化學(xué)和細胞生物學(xué)研究所;

Real-time試劑盒:美國BIO-RAD公司;

瓊脂糖:荷蘭Duchefa Biochemie公司;

Trizol:美國Ambion公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平:BT25S型,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;

真空冷凍干燥機:FD-1A-50型,德國Christ公司;

臺式高速冷凍離心機:5810R型,德國Eppendorf公司;

PCR擴增儀:T100 Thermal型,德國Eppendorf公司;

酶標儀:Infinite M200 Pro型,瑞士Tecan公司;

超微量紫外可見光分光光度計:NanoDrop One型,美國Thermo公司;

二氧化碳培養(yǎng)箱:HERACELL I50i型,日本SANYO公司;

PCR電泳槽:Power PacTMHC型,美國BIO-RAD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及處理 取對數(shù)生長期人肝癌HepG2細胞于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3 d傳代1次,當(dāng)細胞貼壁達到70%時,以體積分數(shù)為0.25%的胰酶消化傳代。預(yù)試驗采用不同質(zhì)量濃度的原花青素(5,10,15,20,25 g/mL)處理HepG2細胞24,48 h,以確認后續(xù)轉(zhuǎn)錄組處理的原花青素最適質(zhì)量濃度及時間。選取50 μg/mL的蝦青素添加到HepG2細胞中,處理48 h;另添加等量1%的DMSO作為溶劑對照組。

1.3.2 RNA提取和質(zhì)量檢測 采用Trizol試劑法[21]提取總RNA,每組3個重復(fù)。利用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度;提取樣本的總RNA后,通過常規(guī)試劑盒去除rRNA,將mRNA富集。進一步將富集得到的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成雙鏈cDNA,修復(fù)cDNA雙末端后,加上接頭,PCR擴增構(gòu)建上機文庫。通過帶有Oligo(dT)的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后,用超聲波將mRNA打斷。以片段化的mRNA為模板,隨機寡核苷酸為引物,在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈,隨后用RNaseH降解RNA鏈,并在DNA polymerase I 體系下,以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭,用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA,進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物,最終獲得文庫。為保證測序質(zhì)量,采用嚴格的質(zhì)控構(gòu)建文庫。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序和差異基因分析 由廣州基迪奧生物科技有限公司利用Illumina HiseqTM 4000system平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。對測序得到的原始序列(raw reads)進行過濾,去除接頭序列、重復(fù)冗余序列和低質(zhì)量的reads,得到高質(zhì)量序列(clean reads)。利用HISAT2[22]軟件開展基于參考基因組的比對分析。根據(jù)HISAT2的比對結(jié)果,利用Stringtie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本,并計算每個樣本中所有基因的表達量?；诨虮磉_量信息,利用R(http://www.r-project.org/)開展主成分分析(PCA),基因差異表達分析的數(shù)據(jù)為基因表達水平分析中得到的reads count數(shù)據(jù),使用DESeq2[23]軟件分析篩選差異表達基因,差異倍數(shù)篩選FDR<0.05 且 |log2FC|>1的基因為顯著差異基因。

利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行功能注釋,并采用FPKM值反映基因的表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 22軟件、計算機軟件R(版本3.5.0)、Excel對數(shù)據(jù)進行分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

由表1可知,最小Q20值為98.04%,最小Q30值為94.31%,說明獲得的clean reads質(zhì)量較高,重復(fù)性在誤差范圍內(nèi),完全滿足后續(xù)生物學(xué)及相關(guān)分析的要求。

表1 數(shù)據(jù)質(zhì)量和參考序列比對分析結(jié)果?

由圖1可知,Control組和PCs組各自聚為一類,且Control組的重復(fù)性較好。每兩個樣品之間的皮爾斯(Pearson)相關(guān)系數(shù)均>0.99,說明同一處理組樣品間差異較少,組內(nèi)穩(wěn)定性較好;不同組樣品間的相關(guān)性均>0.90,不同處理組之間差異表達基因較少,說明不同組之間差異較小。

圖1 葡萄原花青素對HepG2細胞轉(zhuǎn)錄組主成分和相關(guān)系數(shù)分析

2.2 葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉(zhuǎn)錄組差異表達基因分析

原花青素處理細胞后,通過兩組轉(zhuǎn)錄本對比,對基因表達進行層次聚類分析(圖2、圖3),并篩選差異基因(表達倍數(shù)差異log2FC>2,顯著性P-value<0.05)結(jié)果顯示,共有2 554個差異基因,其中有887個上調(diào)基因和1 667個下調(diào)基因。由圖4、圖5可知,在PCs的作用下,細胞HepG2差異表達基因表達上調(diào)與表達下調(diào)的數(shù)量相比,下調(diào)的基因數(shù)高于上調(diào)的。原花青素的生物活性主要是清除自由基抗氧化,原花青素通過抑制細胞生長增殖、誘導(dǎo)細胞程序性凋亡、調(diào)節(jié)核因子NF-κB的活性、阻滯細胞周期、抑制目標基因的表達等達到其抗癌作用[24]。課題組[25]前期研究表明:小劑量PCs(50 μg/mL)即能誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡,與空白對照相比差異極顯著(P<0.01),且PCs對HepG2細胞增殖的抑制作用具有時間和濃度依賴關(guān)系。通過兩組樣本中差異表達基因分析,原花青素可明顯抑制HepG細胞中基因的轉(zhuǎn)錄水平。

深灰色代表上調(diào)基因;淺灰色代表下調(diào)基因;白色代表基因無顯著差異

圖3 差異表達基因統(tǒng)計

圖4 HepG2細胞葡萄籽原花青素處理條件下的差異基因表達火山圖

A1. 細胞 A2. 細胞部分 A3. 細胞器 A4. 細胞器部分 A5. 大分子復(fù)合物 A6. 膜封閉腔 A7. 膜 A8. 細胞外區(qū)域 A9. 細胞外區(qū)域部分 A10. 細胞外基質(zhì) B1. 結(jié)合 B2. 催化活性 B3. 核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性 B4. 轉(zhuǎn)運活性 B5. 分子功能調(diào)節(jié) B6. 結(jié)構(gòu)分子活性 B7. 轉(zhuǎn)錄因子活性 C1. 細胞過程 C2. 單一生物過程 C3. 代謝過程 C4. 應(yīng)激效應(yīng) C5. 生物調(diào)節(jié) C6. 細胞組分組織或合成 C7. 發(fā)育進程 C8. 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) C9. 胞質(zhì)定位 C10. 生物調(diào)控過程 C11. 免疫系統(tǒng)過程 C12. 多細胞組織過程 C13. 運動調(diào)節(jié) C14. 生物黏附 C15. 繁殖調(diào)節(jié) C16. 生長調(diào)節(jié) C17. 多組織過程

2.3 葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉(zhuǎn)錄組GO功能分析

對葡萄籽原花青素處理的HepG2細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行差異表達基因GO功能富集分析。每組差異基因被注釋到生物學(xué)過程、分子功能、細胞組分和3個GO分類中(圖5),2 279個差異基因富集到166個分子功能通路中,具有顯著差異的通路依次為細胞過程、單一生物過程、代謝過程、刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、細胞組分組織或合成、發(fā)育進程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞質(zhì)定位、生物調(diào)控過程、免疫系統(tǒng)過程、多細胞組織過程、運動調(diào)節(jié)、生物黏附、繁殖調(diào)節(jié)、生長調(diào)節(jié)、多組織過程。2 286個差異基因富集到62個分子功能通路中,具有顯著差異的通路依次為結(jié)合、催化活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)運活性、分子功能調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性。2 400個差異基因富集到60個細胞組分通路中,具有顯著差異的通路依次為細胞、細胞部分、細胞器、細胞器部分、大分子復(fù)合物、膜封閉腔、膜、細胞外區(qū)域、細胞外區(qū)域部分、細胞外基質(zhì)。

葡萄籽原花青素處理后主要富集到的生物學(xué)過程為細胞過程、代謝過程、生物調(diào)控過程、免疫系統(tǒng)過程、繁殖調(diào)節(jié)、生長調(diào)節(jié),符合原花青素在肝癌細胞上的作用機制[26]。杜宏等[27]研究發(fā)現(xiàn),蓮房原花青素可誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡,抑制其生長且呈濃度依賴性,通過對肝癌細胞周期比率分析顯示,蓮房原花青素具有抑制肝癌細胞DNA合成,阻滯其增殖的作用。梁惠敏等[28]研究發(fā)現(xiàn),原花青素可抑制肝癌細胞的生長,且濃度和時間呈劑量關(guān)系,原花青素對肝癌細胞SMMC27721具有抑制增殖和促進肝癌細胞分化作用,進一步研究發(fā)現(xiàn),原花青素通過清除活性氧酶活降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)抑制細胞增殖,促進細胞凋亡。許慧等[29]研究發(fā)現(xiàn),蓮房原花青素可降低肝癌細胞合成DNA的能力,使其停滯于S期,繼而抑制細胞的生長介導(dǎo)其凋亡。綜上,原花青素通過抑制細胞生長,清除氧自由基,對癌細胞DNA合成具有抑制作用,可以阻滯細胞增殖,導(dǎo)致細胞凋亡。

2.4 葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉(zhuǎn)錄組KEGG Pathway富集分析

葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉(zhuǎn)錄組的KEGG通路富集分析,共有1 016個基因富集到322條代謝通路(圖6、圖7),差異基因主要被聚類到六大途徑:基礎(chǔ)代謝過程、生物系統(tǒng)、人類疾病、細胞過程、基因信息過程和環(huán)境信息過程?；A(chǔ)代謝過程包括外源化合物的生物降解與代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝和核苷酸代謝等;生物系統(tǒng)包括免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等;人類疾病包括傳染性疾病、癌癥、內(nèi)分泌和代謝疾病、心血管疾病、神經(jīng)衰退行性疾病和免疫疾病等;細胞過程包括細胞凋亡、運輸與分解代謝和細胞運動等;基因信息過程主要包括基因復(fù)制、修復(fù)、翻譯、折疊、轉(zhuǎn)錄和降解等;環(huán)境信息過程包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號分子與相互作用、膜運輸。如圖7所示,細胞凋亡相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑包括TNF信號通路、p53信號傳導(dǎo)途徑被顯著地富集。這兩個途徑類別中的差異表達基因可能與原花青素處理引起的細胞凋亡密切相關(guān),突顯出葡萄籽原花青素在抑制HepG2細胞的作用,與TNF信號通路、p53信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)的信號通路有PI3K/Akt信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路均與細胞凋亡密切相關(guān)。

A. 基礎(chǔ)代謝過程 A1. 外源化合物的生物降解與代謝 A2. 氨基酸代謝 A3. 脂質(zhì)代謝 A4. 碳水化合物代謝 A5. 核苷酸代謝 A6. 輔因子和維生素代謝 A7. 其他氨基酸的代謝 A8. 多糖合成和代謝 A9. 外源生物的生物降解與代謝 A10. 能量代謝 A11. 其他次生代謝生物的生物合成 A12. 萜類和聚酮類代謝 B. 生物系統(tǒng) B1. 免疫系統(tǒng) B2. 內(nèi)分泌系統(tǒng) B3. 神經(jīng)系統(tǒng) B4. 消化系統(tǒng) B5. 發(fā)育 B6. 環(huán)境適應(yīng) B7. 血液循環(huán)系統(tǒng) B8. 感官系統(tǒng) B9. 排泄系統(tǒng) B10. 老化 C. 人類疾病 C1. 傳染性疾病 C2. 癌癥 C3. 內(nèi)分泌 C4. 代謝疾病 C5. 心血管疾病 C6. 神經(jīng)衰退性疾病 C7. 免疫疾病 C8. 抗藥性 D. 細胞過程 D1. 細胞凋亡 D2. 運輸與分解代謝 D3. 真核細胞群落 D4. 細胞運動 E. 基因信息過程 E1. 基因復(fù)制和修復(fù) E2. 翻譯 E3. 折疊和轉(zhuǎn)錄 E4. 降解 F. 環(huán)境信息過程 F1. 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) F2. 信號分子與相互作用 F3. 膜運輸

1. DNA復(fù)制 2. 細胞周期 3. 同源重組 4. 范可尼貧血信號通路 5. 失配修正 6. 堿基切除修復(fù) 7. 代謝途徑 8. 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝 9. 過氧化物酶體 10. 真核生物核糖體的生物發(fā)生 11. 流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化 12. 為嘧啶代謝 13. TNF信號通路 14. 二羧酸代謝 15. 膽固醇代謝 16. p53信號通路 17. TGF-β信號通路 18. 膀胱癌 19. 核苷酸切除修復(fù) 20. 脂肪酸降解 21. 精氨酸和脯氨酸代謝 22. 丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝 23. 白細胞經(jīng)外周遷移 24. 精氨酸生物合成 25. 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解

通過細胞凋亡相關(guān)差異基因篩選出5條與細胞凋亡相關(guān)的通路,包括NF-κB信號通路、MAPK通路、TNF信號通路、p53信號傳導(dǎo)途徑和PI3K/Akt信號通路,NF-κB是基因表達的重要調(diào)控因子之一。Maldonado等[30]研究發(fā)現(xiàn),原花青素通過NF-κB和p53上調(diào)細胞凋亡相關(guān)受體的表達與其誘導(dǎo)的癌細胞凋亡具有一定的相關(guān)性。盧婷婷等[31]研究發(fā)現(xiàn),用熒光素酶表達載體PGL3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞,原花青素對COX-2啟動子活性有明顯抑制作用。Engelbrecht等[32]研究發(fā)現(xiàn),原花青素處理后Caco細胞無明顯變化,而NCM460細胞隨原花青素濃度的增大,其細胞抑制率也增大,通過蛋白印跡試驗,原花青素使PI3K/Akt的催化亞基(P110)和調(diào)節(jié)亞基(P85)出現(xiàn)衰減,使PKB-SER473的磷酸化減弱,細胞出現(xiàn)程序性死亡。據(jù)報道[33-34],絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路參與細胞內(nèi)炎癥信號的級聯(lián),與促炎細胞因子和NF-κB轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān),并參與增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡等一系列生物學(xué)過程。綜上,原花青素通過抑制HepG2細胞相關(guān)基因的表達和通路的活化,誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生凋亡。

2.5 葡萄籽原花青素對HepG2細胞轉(zhuǎn)錄組信號通路及差異基因表達分析

對兩組差異代謝通路對比分析(表2),細胞凋亡通路相關(guān)的差異基因24個,與TNF信號通路相關(guān)的差異基因28個,p53信號通路相關(guān)的差異基因18個,MAPK信號通路相關(guān)的差異基因47個,PI3K-Akt信號通路相關(guān)的差異基因51個,NF-κB信號通路相關(guān)的差異基因18個。

表2 差異基因與細胞凋亡相關(guān)的KEGG途徑

結(jié)合GO和KEGG富集結(jié)果,與細胞凋亡相關(guān)的差異基因有24個(表3),12個關(guān)鍵差異基因中,上調(diào)基因有9個,下調(diào)基因有3個。細胞凋亡12個關(guān)鍵差異基因與TNF、p53、MAPK、PI3K-Akt、NF-κB信號通路密切相關(guān),其中,與TNF信號通路相關(guān)差異基因有9個,與p53信號通路相關(guān)的差異基因有2個,與MAPK信號通路相關(guān)差異基因有6個,與PI3K-Akt信號通路相關(guān)差異基因有2個,與NF-κB信號通路相關(guān)差異基因有6個。

表3 原花青素對HepG2細胞差異基因及差異表達水平分析

葡萄籽原花青素對HepG2細胞的轉(zhuǎn)錄組信號通路產(chǎn)生了明顯影響,尤其在細胞凋亡過程中起到了重要的調(diào)控作用。差異基因與多個信號通路的調(diào)控相互交織,共同參與了細胞凋亡的調(diào)控過程。

3 結(jié)論

葡萄籽花青素處理HepG2細胞后,其主要富集到的生物學(xué)過程為細胞過程、代謝過程、生物調(diào)控過程、免疫系統(tǒng)過程、繁殖調(diào)節(jié)和生長調(diào)節(jié)。通過KEGG pathway分析,葡萄籽花青素處理HepG2細胞后的基因差異表達水平涉及到細胞凋亡和多個信號通路的調(diào)控。12個關(guān)鍵差異基因與相關(guān)通路結(jié)果表明,細胞凋亡與TNF信號通路、p53信號傳導(dǎo)途徑、PI3K/Akt信號通路、NF-κB信號通路及MAPK信號通路密切相關(guān)。葡萄籽花青素通過調(diào)節(jié)這些信號通路的活性,可能在細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡,從而抑制細胞進一步生長和擴散。后續(xù)可以重點關(guān)注差異基因在信號通路中的具體作用和相互調(diào)控關(guān)系,以深入揭示葡萄原花青素在肝癌細胞中的作用機制。