黨玉婷

張 彥1

井波鑫1

蘇曉萌2

柴希艷3

(1. 西安醫(yī)學院,陜西 西安 710021;2. 陜西福祿成工貿(mào)有限公司,陜西 西安 710032;3. 西安雨潤百德健康管理有限公司,陜西 西安 710065)

黑豆在中國栽培歷史悠久,品種較多,如:黑豆、黑大豆、小黑豆和馬料豆等[1]。2020版《中國藥典》記載其性狀“長6～12 mm,直徑5～9 mm,種皮呈黑色或灰黑色,有益精明目,養(yǎng)血祛風,利水,解毒的作用”[2]。歷代古籍均認為“種皮黑者方可做藥用”且“黑者入藥,小者質佳”[3-4]。近年來陜北地區(qū)種植栽培黑豆已具有一定規(guī)模,且全部為小粒品種[5]。

黑豆可作為食品添加劑應用于大健康領域,在改善人類膳食結構和預防代謝綜合征、肥胖和海爾默茲綜合征中發(fā)揮著重要作用[6],這可能與黑豆中的次生代謝產(chǎn)物的抗氧化作用有關。但前人對黑豆的研究多集中在花青素、異黃酮等提取工藝上[7]。對于適合藥用的黑豆品種,魏玉等[8]指出中藥炮制輔料黑豆汁應選用“烏衣黃仁小扁粒黑豆”;李佳榮等[9]也通過比較不同產(chǎn)地黑豆大豆苷和大豆苷元的含量,提出優(yōu)質藥用的品種應是皮緊粒小的;李瑞等[10]比較了可作為豆芽、豆腐等豆制品的黑豆品種。從藥用及食用價值兩方面對黑豆進行綜合評價,以及對不同品種黑豆活性進行比較的研究尚未見報道。

體外酶抑制和抗氧化活性測定是初步篩選生物活性的一種簡便的方法[11]。胰脂肪酶是消化脂肪的關鍵酶;α-淀粉酶是重要的碳水化合物水解酶;乙酰膽堿酯酶是生物神經(jīng)傳導中的關鍵酶;酪氨酸酶是黑色素合成的關鍵限速酶[11]。以上酶抑制作用均與預防代謝綜合征有關,與氧化應激也有關[11]。當前雖有黑豆體外抗氧化的研究[12],但尚未見對黑豆代謝綜合征相關酶的抑制作用研究。

研究擬比較不同品種黑豆的主成分,并測定黑豆對代謝綜合征相關酶的抑制作用和抗氧化活性,明確其生物活性,探討其在代謝綜合征的輔助預防中應用的可能性,以期為闡釋黑豆藥用與食用的適宜品種提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

黑豆樣品:含水量<5%,根據(jù)《中國農(nóng)業(yè)百科全書》[13]中有關中國大豆品種分類標準,按照籽粒重量將其分為大粒(百粒重18.0 g以上)、中粒(百粒重12.0～17.9 g)、小粒(百粒重11.9 g以下)三類(見表1),市售;

表1 各黑豆樣品信息

沒食子酸、石杉堿甲、曲酸、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、(+)-兒茶素標準品:純度>98%,寶雞辰光生物科技有限公司;

福林酚:分析純,上海源葉生物科技有限公司;

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):分析純,成都艾科達化學試劑有限公司;

2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS):分析純,美國Sigma公司;

α-淀粉酶:13 U/mg,北京索萊寶科技有限公司;

胰脂肪酶:15～35 U/mg,上海阿拉丁生化科技有限責任公司;

乙酰膽堿酯酶(AChE):200～1 000 U/mg,美國Sigma公司;

酪氨酸酶:500 U/mg,寶雞辰光生物科技有限公司;

L-酪氨酸:分析純,上海薩恩化學技術有限公司;

維生素C片:華中藥業(yè)股份有限公司;

多奈哌齊:浙江華海藥業(yè)股份有限公司;

奧利司他:湖南明瑞制藥有限公司。

1.2 主要儀器與設備

酶標儀:ReadMax 1900/1900Plus型,上海生物閃譜科技有限公司;

超聲波清洗器:KQ-250B型,昆山市超聲儀器有限公司;

旋轉蒸發(fā)儀:XD-52AA型,上海申生科技有限公司;

全自動凱氏定氮儀:K1100F型,深圳市賽亞泰科儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同方法制備黑豆樣品

(1) 超聲提取:黑豆用粉碎機粉碎,過100目篩,備用。取黑豆粉2 g,按1∶10 (g/mL)的料液比加入體積分數(shù)為70%的乙醇,60 ℃超聲提取2 h后7 000 r/min離心8 min,取上清液,殘渣在相同條件下重復提取1次,合并兩次上清液,得質量濃度為100 mg/mL黑豆提取液。另取20 g黑豆粉同以上操作。將超聲提取液濃縮蒸干制得黑豆提取物浸膏。稱取浸膏125 mg用pH為7.2～7.4的PBS緩沖液配成質量濃度為2.5 mg/mL樣品溶液,再稀釋為質量濃度0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/mL的黑豆提取物樣品溶液。

(2) 丙酮提取:取0.5 g過篩后的黑豆粉,置于5 mL酸性70%丙酮(0.5%乙酸)溶液中超聲3 h,避光靜置12 h后,3 000 r/min離心10 min,取上清液。殘渣按相同方法再提取1次,合并浸提液,得黑豆提取液。

1.3.2 黑豆主成分測定

(1) 總酚酸含量:參照文獻[11]取1.3.1中超聲提取制備的黑豆提取液,采用福林酚法測定其總酚酸含量。

(2) 總黃酮含量:以(+)-兒茶素為標準品,取1.3.1中丙酮提取制備的黑豆提取液,參照文獻[14]采用亞硝酸鈉—硝酸鋁法測定總黃酮含量,結果以每毫克兒茶素當量表示(mg CAE/g樣品)。

(3) 縮合單寧含量:以(+)-兒茶素為標準品采用香草醛鹽酸法,參照文獻[15]略作修改,取1.3.1中丙酮提取制備的黑豆提取液采用香草醛甲醇溶液—濃鹽酸法,測定黑豆樣品中縮合單寧的含量,結果以每毫克兒茶素當量表示(mg CAE/g樣品)。

(4) 總花色苷含量:參照文獻[16]修改如下:取1.3.1中超聲提取制備的黑豆提取液3 mL,分別用pH 1.0的0.025 mol/L KCl溶液和pH 4.5的0.4 mol/L醋酸鈉緩沖溶液定容至10 mL。平衡1 h后,分別在530,700 nm處測吸光值,按式(1)～式(3)計算總花色苷含量(以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計)。

Aλmax=(A530 nm-A700 nm)pH 1.0-(A530 nm-A700 nm)pH 4.5,

(1)

(2)

(3)

式中:

Aλmax——最大吸收波長處的吸光值;

A530 nm——530 nm處的吸光度;

A700 nm——700 nm處的吸光度;

MW——矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相對分子質量,449.2;

D——稀釋體積;

F——濃度校正因數(shù);

ε——消光系數(shù),29 600 L/(mol·cm);

l——光路長度,cm;

WA——總花色苷含量,mg/100 g;

C——花色苷質量濃度,mg/L;

V——待測液的體積,mL;

M——樣品質量,g。

(5) 總多糖含量:取1.3.1中丙酮提取制備的黑豆提取液,參照文獻[17]采用苯酚硫酸法測定黑豆中總多糖。

(6) 總蛋白含量:取粉碎過100目篩的黑豆粉末,按GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》第一法(凱氏定氮法)測定總蛋白含量。

1.3.3 抗氧化活性

(1) DPPH自由基清除活性:參照文獻[18]修改如下:取1.3.1中超聲提取制備的黑豆粗提液和DPPH溶液與無水乙醇反應測吸光度,按式(4)計算DPPH自由基清除率。

(4)

式中:

Y——DPPH自由基清除率,%;

A1——待測試樣吸光度;

A2——不加待測試樣而用無水乙醇代替待測試樣的吸光度;

A3——待測試樣自身的吸光度。

(2) ABTS自由基清除活性:參照文獻[16]修改如下:將ABTS水溶液與K2S2O8水溶液混合暗反應12 h后,用甲醇稀釋使其吸光度在0.78～0.82,得ABTS自由基工作液。在1.3.1中超聲提取的黑豆提取物樣品溶液或無水乙醇中加入ABTS自由基工作液混勻測定吸光度。按式(5)計算ABTS自由基清除率。

(5)

式中:

Y——ABTS自由基清除率,%;

A0——無水乙醇+ABTS自由基工作液的吸光度;

A1——提取液+ABTS自由基工作液的吸光度。

1.3.4 體外酶抑制活性研究

(1) 胰脂肪酶:參照文獻[19]的方法配制胰脂肪酶溶液、底物PNPP溶液和陽性藥奧利司他溶液。在1.3.1中超聲提取的黑豆提取物樣品溶液中加入緩沖液和胰脂肪酶,反應體系如表2所示,測定各組吸光度,按式(6)計算胰脂肪酶抑制率。

(6)

表2 胰脂肪酶反應體系

式中:

Y——抑制率,%;

A1——空白組吸光度;

A2——空白對照組吸光度;

A3——抑制組吸光度;

A4——抑制對照組吸光度。

(2)α-淀粉酶:參照文獻[20]的方法配制α-淀粉酶溶液、淀粉溶液和DNS顯色劑溶液。根據(jù)如表3所示的反應體系測定在1.3.1中超聲提取的黑豆提取物樣品溶液各組的吸光度,按式(6)計算α-淀粉酶抑制率。

表3 α-淀粉酶活性測定體系

(3) 乙酰膽堿酯酶:以陽性藥石杉堿甲為陽性藥,參照文獻[21]的方法測定各黑豆提取物的吸光度,按式(7)計算乙酰膽堿酯酶抑制率。

(7)

式中:

Y——乙酰膽堿酯酶抑制率,%;

A樣品——只加樣品吸光度;

A背景——PBS溶液代替酶液吸光度;

A空白——溶劑代替樣品吸光度。

(4) 酪氨酸酶:參照文獻[22],按式(8)計算酪氨酸酶抑制率。

(8)

式中:

Y——酪氨酸酶抑制率,%;

A——空白對照組(PBS 130 μL+酶50 μL+底物20 μL)吸光度;

B——空白背景組(PBS 180 μL+底物20 μL)吸光度;

C——不同濃度樣品組(PBS 80 μL+酶50 μL+樣品溶液50 μL+底物20 μL)吸光度;

D——試驗背景組(PBS 130 μL+供試品溶液50 μL+底物20 μL)吸光度。

2 結果與分析

2.1 各黑豆樣品的浸膏提取率

將1.3.1項下超聲提取液濃縮蒸干制得的各黑豆樣品的浸膏計算提取率,提取率為浸膏質量與提取之前的黑豆粉總重之比,詳見表4。

表4 各黑豆樣品的浸膏提取率

2.2 各黑豆總酚酸、總黃酮、縮合單寧、花色苷、多糖與總蛋白含量

小黑豆和馬料豆中總酚酸含量和總黃酮、縮合單寧含量普遍遠高于黑豆,以上3種分成含量為馬料豆>小黑豆>黑豆。尤其是小黑豆的總黃酮與縮合單寧含量約是黑豆的5～10倍,馬料豆約是黑豆的8～20倍。就總花色苷、總多糖和總蛋白含量而言,小黑豆與黑豆含量差別不大。比較發(fā)現(xiàn)總花色苷為馬料豆>小黑豆>黑豆,總多糖為小黑豆>黑豆>馬料豆,總蛋白為馬料豆>黑豆>小黑豆,詳見表5。

表5 各黑豆樣品中主要活性成分含量

2.3 黑豆提取物體外抗氧化活性

各類黑豆均具有一定的抗氧化活性。其中,馬料豆>小黑豆>黑豆。黑豆各類品種中馬料豆的抗氧化活性最好,但相同質量濃度下均不及陽性藥維生素C(VC)的抗氧化活性,詳見圖1、圖2及表6。

圖1 體外對DPPH自由基清除曲線

圖2 體外對ABTS自由基清除曲線

表6 各黑豆提取物體外抗氧化活性的IC50值

2.4 黑豆提取物體外酶抑制活性

2.4.1 胰脂肪酶 以樣品質量濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標作圖,得到各樣品質量濃度與抑制率的曲線圖,見圖3。各品種黑豆粗提物對胰脂肪酶抑制作用的IC50,結果見表7。

圖3 各黑豆提取物體外對胰脂肪酶的抑制作用

表7 各黑豆提取物體外抑制胰脂肪酶的IC50值

由圖3和表7可知,各黑豆提取物在一定質量濃度范圍內(nèi)對胰脂肪酶均有較好的抑制作用,小黑豆>黑豆>馬料豆。其中,小黑豆和黑豆的抑制效果優(yōu)于陽性藥奧利司他。

2.4.2α-淀粉酶 以樣品質量濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標作圖,得各樣品質量濃度與抑制率的曲線圖,見圖4。計算各黑豆提取物對α-淀粉酶活性抑制作用的IC50,結果見表8。

圖4 各黑豆提取物體外對α-淀粉酶的抑制作用

表8 各黑豆提取物體外抑制α-淀粉酶的IC50值?

由圖4和表8可知,各類黑豆提取物在一定質量濃度范圍內(nèi)對α-淀粉酶均有抑制作用,其中馬料豆>黑豆>小黑豆。

2.4.3 乙酰膽堿酯酶 以樣品質量濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標作圖,得到各樣品質量濃度與抑制率的曲線圖,見圖5。計算黑豆提取物對乙酰膽堿酯酶抑制作用的IC50,結果見表9。

圖5 各黑豆提取物體外對乙酰膽堿酯酶的抑制作用

表9 各黑豆提取物體外抑制乙酰膽堿酯酶的IC50值?

由圖5和表9可知,除黑豆外,小黑豆、馬料豆及花青素單體(矢車菊素-3-O-葡萄糖苷)和陽性藥石杉堿甲對乙酰膽堿酯酶均有一定的抑制作用,其中小黑豆>馬料豆。

2.4.4 酪氨酸酶 以樣品質量濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標作圖,得到各樣品質量濃度與抑制率的曲線圖,見圖6。計算粗提物對酪氨酸酶活性抑制作用的IC50,結果見表10。

圖6 黑豆提取物體外對酪氨酸酶的抑制作用

表10 黑豆提取物體外抑制酪氨酸酶的IC50值

由圖6和表10可知,各類黑豆在一定質量濃度范圍內(nèi)對酪氨酸酶均有抑制作用,黑豆>馬料豆>小黑豆。其中,黑豆的抑制效果優(yōu)于陽性藥曲酸。

3 結論

酚酸、黃酮、花色苷等植物次生代謝產(chǎn)物與多種疾病治療密切相關,而小黑豆的總酚酸、總黃酮、縮合單寧、總花色苷和總多糖含量高于其他品種,故小黑豆的藥用價值更高。馬料豆其百粒重量僅為小黑豆的1/10,黑豆的1/40。而馬料豆除多糖含量外,其余主成分主要活性成分均高于小黑豆和黑豆,其抗氧化活性和酶抑制活性也較好。這印證了前人[8-9]提出的藥用黑豆炮制何首烏等藥材時應選擇小黑豆的觀點。

研究從藥用和食用兩個方面評價不同黑豆品種,發(fā)現(xiàn)黑豆體外有抗氧化和抑制多種代謝綜合征相關酶的作用,其有輔助預防代謝綜合征的應用價值[23]。后期可加強小黑豆藥用價值的開發(fā)與研究,進一步開展整體動物體內(nèi)試驗進而對黑豆不同品種降脂降糖和預防海爾默茲綜合征等生物活性進行深入研究。