向卓亞

朱柏雨1

朱永清1

夏 陳1

陳 松2

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所〔四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食物與營養(yǎng)健康研究所〕,四川 成都 610066;2. 古萃〔古藺〕生物科技有限公司,四川 瀘州 646500)

趕黃草為虎耳科扯根菜屬植物(PenthorumchinensePursh)全草,又名水楊柳、扯根菜,主要分布于東北、華北、華南和西南,是四川古藺縣重要農(nóng)作物及中藥材[1]。其富含多種活性成分,主要為類黃酮類、香豆素類、鞣質(zhì)類、三萜類等,其中黃酮類化合物被認(rèn)為是其主要活性成分[2-3]?；谄湄S富的活性成分,趕黃草常被苗醫(yī)作為治療肝病傳統(tǒng)藥物,現(xiàn)代研究[4-5]表明其具有抗氧化、抗肝炎病毒、酒精/非酒精性肝臟保護(hù)等作用。

趕黃草作為新食品原料[6-7],已有不同溶劑提取趕黃草的研究[8],但考察指標(biāo)僅為槲皮素這一指標(biāo)。此外,趕黃草作為全草植物,目前市場上通常將其花、葉、莖3個(gè)部位分別出售,其中花的價(jià)格最高,葉次之,莖最低,可能是由于不同部位的槲皮素含量差異較大[9],而關(guān)于趕黃草不同部位各類活性物質(zhì)分布及抗氧化活性的研究尚未見報(bào)道。研究擬以水、乙醇和甲醇作為溶劑提取趕黃草全草中的活性成分,以總多酚、總黃酮含量以及體外抗氧化能力為指標(biāo),比較不同溶劑的提取效果。并以趕黃草不同部位(花、莖、葉)為研究對象,采用最佳提取溶劑進(jìn)行提取,比較不同部位趕黃草活性成分含量差異,為趕黃草的合理開發(fā)與進(jìn)一步利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

趕黃草全草:分別于2021年8月和2022年8月在四川省瀘州市古藺縣黃荊鎮(zhèn)采收,將其花、葉、莖剝離分開,標(biāo)記為H1、J1、Y1、H2、J2、Y2,自然風(fēng)干,樣品信息見表1,所有樣品經(jīng)粉碎并過80目篩,密封,于-18 ℃保存?zhèn)溆?

表1 供試樣品信息來源

沒食子酸、兒茶素、原兒茶酸、表兒茶素、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、阿福豆苷、喬松素葡萄糖苷、槲皮素、山奈酚、沒食子酰3苯并、喬松素、趕黃草苷A(純度≥98%):色譜純,美國Simga公司;

α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(水溶性VE)、福林酚、三硝基化鋁、碳酸鈉、沒食子酸:分析純,成都市科龍化工試劑廠;

數(shù)控超聲波清洗儀:KQ-250DB型,昆山市超聲儀器有限公司;

酶標(biāo)儀:ELX-800型,美國伯騰儀器有限公司;

高效液相色譜儀:1290型,配備自動(dòng)進(jìn)樣器、二元泵、柱溫箱、DAD檢測器,美國Agilent公司;

超純水儀:UPT-11-2T型,四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取

(1) 溶劑:參照Guo等[10]的方法略作修改,稱取1 g趕黃草樣品,分別加入8 mL 不同溶劑(水、40%甲醇、80%甲醇、100%甲醇、40%乙醇、80%乙醇以及100%乙醇),40 ℃超聲提取30 min,8 000 r/min離心15 min,殘?jiān)貜?fù)提取2次,合并3次提取液,定容至25 mL,即為趕黃草全草提取液,過0.22 μm濾膜,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 部位:分別稱取1 g趕黃草葉、花和莖,加入8 mL 80%乙醇,40 ℃超聲浸提30 min,6 000 r/min離心10 min,殘?jiān)貜?fù)提取2次,合并3次提取液,定容至25 mL,即為趕黃草樣品提取液,過0.22 μm濾膜,于離心管中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總多酚含量測定 參照Xiang等[11]的方法。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.006 5x+0.004,R2=0.999。

1.2.3 總黃酮含量測定 參照Zhang等[12]的方法。以兒茶素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.001 7x+0.001,R2=0.999。

1.2.4 抗氧化活性測定

(1) ABTS自由基清除能力:參照Ma等[13]的方法,以水溶性VE質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),ABTS自由基清除率為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.098x-0.140 1,R2=0.992 4。

(2) DPPH自由基清除能力:參照Deng等[14]的方法,以水溶性 VE質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.310 7x+ 0.032 9,R2=0.998 6。

(3) 鐵離子還原能力(FRAP):參照Tian等[15]的方法,以水溶性VE質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.786 3x+0.010 6,R2=0.999 8。

1.2.5 多酚類化合物測定 參照朱柏雨等[16]的方法稍作修改,提取物經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后,采用高效液相色譜法進(jìn)樣分析。流動(dòng)相A為1%甲酸—水溶液,流動(dòng)相B為乙腈,梯度洗脫:0～10 min, 5%～10% B;10～15 min, 10%～20% B;15～20 min, 20%～35% B;20～30 min,35%～75% B;30～32 min,75%～95% B。Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm),檢測波長分別為280,350 nm;柱溫30 ℃;流量0.8 mL/min;進(jìn)樣量2 μL。15個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品分別用甲醇溶解,以二倍稀釋法制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,差異顯著性比較使用Duncan多重比較方法,P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取趕黃草全草活性成分

2.1.1 總多酚、總黃酮含量 由表2可知,不同溶劑提取趕黃草總多酚、總黃酮含量強(qiáng)弱為80%乙醇=40%乙醇≥100%甲醇>80%甲醇>40%甲醇>水>100%乙醇。80%,40%乙醇提取物中總多酚含量顯著高于其他溶劑提取物。此外,除100%乙醇外,乙醇提取總多酚的效果總體優(yōu)于甲醇,其中40%,80%乙醇更有利于獲得較高含量的酚類化合物,但乙醇體積分?jǐn)?shù)過高(100%)對酚類物質(zhì)提取量反而顯著降低。酚類物質(zhì)在水中的溶解度較低,水提物中總多酚含量最低。研究[17-19]表明,多酚易溶于一定濃度的有機(jī)溶劑中,不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液提取中藥材中多酚效果優(yōu)于水提取物。

表2 不同溶劑提取趕黃草全草中總多酚、總黃酮含量及抗氧化活性?

總黃酮與總多酚含量趨勢大致相同,80%乙醇提取物中總黃酮含量最高,水提物的最低。相同溶劑條件下,隨著溶劑極性降低,提取物中總黃酮含量顯著增加,相同濃度下乙醇提取物中的總黃酮量顯著高于甲醇提取物的,一方面可能是由于黃酮類化合物在水中的溶解度低于有機(jī)溶劑;另一方面,趕黃草中可能存在大量弱極性黃酮類化合物,極性較低的溶劑容易破壞細(xì)胞膜,使其他細(xì)胞器中的黃酮類化合物被釋放[20]。

2.1.2 抗氧化活性比較 由表2可知,趕黃草全草的DPPH自由基清除能力為8.97～20.67 mg/g。Ismail等[21]指出DPPH在極性溶劑體系中可以清除更多自由基。與其他溶劑提取物相比,80%乙醇提取物的抗氧化能力最高,水提物的最低,可能與其較高含量的總多酚和總黃酮有關(guān)。除100%乙醇外,其他溶劑提取物對DPPH自由基清除能力差異不顯著(P>0.05)。ABTS自由基清除能力與鐵離子還原能力變化趨勢大致相似,80%乙醇提取物的抗氧化活性最高,而100%乙醇提取物的最低。Lu等[22]發(fā)現(xiàn),趕黃草醇提物的DPPH自由基清除能力和氧化還原能力高于水提物的。綜上,除DPPH自由基清除能力外,ABTS自由基清除能力與鐵離子還原能力均為80%乙醇提取物的最高。

2.1.3 15種多酚類化合物含量 由表3和圖1(a)可知,80%乙醇提取物中有7種化合物含量最高,分別為兒茶素(2.03 mg/g)、蘆丁(0.04 mg/g)、喬松素葡萄糖苷(0.86 mg/g)、槲皮素(0.46 mg/g)、山奈酚(0.32 mg/g)、喬松素(1.12 mg/g)以及趕黃草苷A(88.60 mg/g)。40%乙醇提取物中異槲皮苷(0.39 mg/g)含量最高;80%甲醇提取物中山奈酚-3-O-蕓香糖苷(1.18 mg/g)、紫云英苷(1.22 mg/g)和沒食子酰3苯并(13.38 mg/g)含量最高,而水提物中沒食子酸(1.85 mg/g)和原兒茶酸(0.57 mg/g)含量最高。說明不同溶劑對趕黃草中酚類物質(zhì)的提取差異較大,80%乙醇是較有前景的提取溶劑,與He等[23]的研究結(jié)果一致。范玲等[24]研究發(fā)現(xiàn),相比水提物和95%乙醇提取物,趕黃草中70%乙醇提取物對小鼠內(nèi)毒素性肝損傷具有明顯保護(hù)作用。槲皮素在《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中作為趕黃草的指標(biāo)成分,但其含量<1 mg/g且與趕黃草保肝的臨床療效關(guān)聯(lián)性較小[25]。

圖1 趕黃草液相圖

表3 不同溶劑提取趕黃草中多酚類化合物?

綜上,結(jié)合總多酚、總黃酮、多酚類化合物提取量,80%乙醇提取趕黃草中活性成分具有更強(qiáng)優(yōu)勢,將作為提取溶劑提取趕黃草不同部位(花、莖、葉)活性成分。

2.2 趕黃草不同部位活性成分比較

2.2.1 總多酚、總黃酮含量 由圖2可知,同一收獲時(shí)期的趕黃草花和葉中總多酚、總黃酮含量顯著高于莖,說明趕黃草多酚物質(zhì)主要存在于葉和花中,與陀揚(yáng)凌等[9]的結(jié)果一致。此外,2022年采收的趕黃草多酚、總黃酮含量順序均為花>葉>莖,隨著貯藏時(shí)間的延長,2021年采收的順序則為葉≥花>莖,花和莖中總多酚、總黃酮含量顯著降低,減少了約36%～ 50%,而葉中含量無顯著差異,可能是葉中酚類物質(zhì)性質(zhì)較花和莖中更穩(wěn)定,通常酚類物質(zhì)性質(zhì)極其活潑,貯藏過程中極易發(fā)生氧化[26]。綜上,多酚物質(zhì)主要分布在趕黃草花和葉中,但隨著貯藏時(shí)間的延長,花和莖中的總多酚、總黃酮含量顯著下降(P<0.05)。

小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05)

2.2.2 15種多酚類化合物含量 由表4和圖1(b)可知,除兒茶素、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、喬松素葡萄糖苷、槲皮素、沒食子酰3苯并以及喬松素外,7種多酚類化合物含量分布情況均為葉>花>莖,與孫佩等[27]的結(jié)果一致。花和葉中含量最高的為趕黃草苷A,其次為沒食子酰3苯并,與Sun等[28]的結(jié)果一致。但與Yin等[29]的結(jié)論存在差異,可能是由趕黃草品種、產(chǎn)地等因素導(dǎo)致的。喬松素含量在花中較高,僅次于沒食子酰3苯并,在葉和莖中含量較低。趕黃草苷A、喬松素、沒食子酰3苯并以及喬松素葡萄糖苷的藥理作用與趕黃草的藥理作用密切相關(guān),具有保肝護(hù)肝活性[3]。槲皮素在花、莖和葉中含量接近,與孫佩等[27]、周瀅等[30]的研究結(jié)果不一致。此外,趕黃草中表兒茶素、蘆丁、紫云英苷、槲皮素以及山奈酚在3個(gè)部位的含量均<1 mg/g,且各部位的酚類物質(zhì)含量隨貯藏時(shí)間的延長而降低,其中花和莖中酚類物質(zhì)降低程度最大。

表4 趕黃草不同部位多酚類化合物含量?

2.2.3 抗氧化活性比較 由圖3可知,趕黃草不同部位提取物的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力以及鐵離子還原能力均為花>葉>莖。隨著貯藏時(shí)間的延長,趕黃草花和葉中DPPH自由基、ABTS自由基清除能力顯著減弱(P<0.05),而葉中鐵離子還原能力也顯著減弱。不同部位的抗氧化活性變化趨勢與總多酚、總黃酮含量變化趨勢一致,表明趕黃草提取物的抗氧化活性與總多酚、總黃酮含量有密切關(guān)聯(lián)。

小寫字母不同代表差異顯著 (P<0.05)

2.3 相關(guān)性分析

由表5可知,兒茶素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、阿福豆苷以及喬松素葡萄糖苷、山奈酚均與總多酚含量呈顯著正相關(guān)(P< 0.05)或極顯著正相關(guān)(P< 0.01);兒茶素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、阿福豆苷、喬松素葡萄糖苷、山奈酚沒食子酰苯并以及趕黃草苷A與總黃酮含量呈顯著正相關(guān)(P< 0.05)或呈極顯著正相關(guān)(P< 0.01);而原兒茶酸與總黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)。DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力與總多酚含量分別呈顯著(P<0.05)或極顯著正相關(guān)(P<0.01),DPPH自由基清除能力與兒茶素、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、阿福豆苷、喬松素葡萄糖苷以及山奈酚分別呈顯著(P<0.05)或極顯著正相關(guān)(P<0.01),鐵離子還原能力與兒茶素、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、阿福豆苷以及喬松素葡萄糖苷分別呈顯著(P<0.05)或極顯著正相關(guān)(P<0.01)。Liu等[31]研究表明,酚類化合物中游離羥基是抗氧化活性的主要原因,而游離羥基數(shù)量越多抗氧化活性越強(qiáng),這可能是酚類化合物與抗氧化活性有較強(qiáng)相關(guān)性的原因。

表5 趕黃草中總多酚、總黃酮、多酚化合物與抗氧化活性的相關(guān)性?

3 結(jié)論

研究先利用不同溶劑提取趕黃草全草中活性成分,再對其總多酚、總黃酮、多酚類化合物含量以及抗氧化活性進(jìn)行比較。結(jié)果表明,提取溶劑類型和溶劑濃度對酚類物質(zhì)提取能力及抗氧化活性有顯著影響。隨著溶劑濃度的增加,趕黃草葉提取物中總多酚、總黃酮含量和抗氧化活性大體上呈先升高后降低的趨勢,且乙醇的提取能力優(yōu)于甲醇,而80%乙醇提取物中有7種化合物含量最高。綜合比較,80%乙醇提取趕黃草中活性成分具有更強(qiáng)的優(yōu)勢。總多酚、總黃酮、15種多酚類化合物主要分布于趕黃草花和葉中,且葉中的多酚物質(zhì)穩(wěn)定。隨著貯藏時(shí)間的延長,總多酚、總黃酮及多酚類化合物含量顯著下降,尤其是花和莖的。后續(xù)可以將趕黃草不同部位(花、莖、葉)分開研究和使用,以提高療效和更大程度開發(fā)利用川產(chǎn)趕黃草新食品資源。