古麗米拉·卡德爾

阿曼妮薩·麥提如則1

李明珠1

康金森1

海力茜·陶爾大洪1,2,3

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830011;2. 新疆及中亞特色醫(yī)藥資源教育部工程研究中心,新疆 烏魯木齊 830011;3. 新疆天然藥物活性組分與釋藥技術(shù)重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830011)

蕪菁(BrassicarapaL.)又名恰麻古、蔓菁,屬于十字花科蕓薹屬植物,以塊根入藥,富含多糖[1]。蕪菁多糖具有潤肺、開胸理氣的功效[1],還具有抗氧化[2-3]、抗衰老[4]、抗腫瘤[5]、抗疲勞[6]等作用。已有研究表明,蕪菁酸性多糖在體內(nèi)具有抗Lewis肺癌活性[7];蕪菁多糖有降血糖作用[8],對LPS/ATP誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞焦亡具有抑制作用[9];蕪菁中性多糖能夠抑制LDH的生成、提高抗氧化酶活性、上調(diào)凋亡蛋白表達(dá)水平,改善PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[10],能有效提高D-半乳糖致衰老小鼠模型抗氧化能力,達(dá)到延緩衰老的作用[11]。

非小細(xì)胞肺癌是常見的一種肺癌類型。據(jù)調(diào)查[12-14],非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率和致死率均占惡性腫瘤的首位,傳統(tǒng)治療效果不理想、不良反應(yīng)多,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究[15]表明,細(xì)胞壞死性凋亡可能在癌癥中發(fā)揮重要作用,作為一種腫瘤抑制效應(yīng),壞死性凋亡可作為一種“故障安全”機制,在細(xì)胞凋亡受到損害時防止腫瘤發(fā)展。在壞死性細(xì)胞死亡過程中,壞死性凋亡導(dǎo)致細(xì)胞器腫脹、細(xì)胞膜破裂及其內(nèi)容物滲漏到細(xì)胞間隙中[16-17]。但與壞死不同的是,壞死性凋亡中的細(xì)胞裂解受到嚴(yán)格調(diào)控,其關(guān)鍵調(diào)控分子包括受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)、RIPK3和混合譜系激酶域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like proteins,MLKL),它們共同形成一個復(fù)合物激活壞死性凋亡通路[18]。

研究擬采用人H226細(xì)胞建立荷瘤小鼠模型,通過體內(nèi)試驗分析蕪菁酸性均一多糖對荷瘤小鼠血清中白細(xì)胞介素18(interleukin-18,IL-18)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)細(xì)胞因子水平、腫瘤組織中壞死性凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況的影響,進(jìn)一步闡明蕪菁酸性均一多糖體內(nèi)抗腫瘤活性及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蕪菁:采自新疆阿克蘇柯坪縣;

4～6周齡BALB/c裸鼠:湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司;

H226細(xì)胞株、細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒(cell counting Kit-8,CCK-8)、緩沖液(PBS):武漢普諾賽生命科技有限公司;

順鉑:北京索萊寶科技有限公司;

DMEM培養(yǎng)基:美國Gibco公司;

0.25%胰蛋白酶:美國Gibco公司;

胎牛血清(FBS):南京生航生物技術(shù)有限公司;

TB Green qPCR試劑盒:日本Takara Bio公司;

酶聯(lián)免疫試劑盒:武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;

氯化鈉注射液:四川科倫藥業(yè)股份有限公司;

二抗:美國Affinity公司;

MLKL、RIP1、RIP3抗體:兔抗,英國Abcam公司;

GAPDH抗體:兔抗,武漢賽維爾生物科技有限公司;

倒置顯微鏡:IX71-12FL/PH型,賽默飛世爾科技公司;

離心機:5424R型,德國Eppendorf公司;

二氧化碳培養(yǎng)箱:Galaxy 170R型,賽默飛世爾科技公司;

熒光定量PCR儀:Quant Studio 6Fle型,美國ABI公司;

電熱恒溫水槽:SSW-600-2S型,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9023A型,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;

全波長酶標(biāo)儀:TECAN F50型,賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蕪菁酸性多糖提取物制備 蕪菁酸性多糖(BrassicarapaL. acid polysaccharides,BRAP)一組分和二組分(BRAP-1、BRAP-2)按課題組前期優(yōu)化條件提取、分離、純化、除蛋白后得到[9],BRAP-1平均相對分子質(zhì)量為6 080,糖醛酸含量為28.13%,由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成,摩爾比為2.07∶4.53∶2.20∶1.00;BRAP-2平均相對分子質(zhì)量為7 590,糖醛酸含量為20.80%,由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成,摩爾比為1.06∶1.00∶5.03∶2.22∶1.50[4]。

1.2.2 CCK-8法檢測蕪菁酸性多糖對H226細(xì)胞增殖情況的影響 取對數(shù)生長期的H226細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL,將細(xì)胞100 μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,設(shè)置空白組、對照組、BRAP-1/BRAP-2各劑量給藥組。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞24 h至細(xì)胞貼壁,給藥24 h后吸棄上清液,每組加100 μL完全培養(yǎng)液和10 μL CCK-8試劑,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1～2 h后用酶標(biāo)儀于450 nm處測定其OD值[5]。

1.2.3 H226細(xì)胞荷瘤小鼠模型的建立、分組及給藥情況

取對數(shù)生長的人肺鱗癌H226細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/mL,將細(xì)胞懸液150 μL/只皮下注入到小鼠右腋上側(cè)。造模成功后進(jìn)行分組,分組情況:正常對照組、模型組,陽性藥物順鉑組[3 mg/(kg·2 d)],BRAP-1低劑量組[50 mg/(kg·d)],BRAP-1中劑量組[100 mg/(kg·d)]和BRAP-1高劑量組[200 mg/(kg·d)],每組10只,腹腔注射給藥[19-20]。

1.2.4 腫瘤體積、抑瘤率及脾臟指數(shù)的計算 給藥當(dāng)天開始每隔1 d測量活體腫瘤的大小(腫瘤的最大長徑a和最小短徑b),給藥結(jié)束第2天處理小鼠,眼球采血收集血清、腫瘤、脾臟等,腫瘤體積、抑瘤率及脾臟指數(shù)計算公式:

v=a×b2/2,

(1)

(2)

(3)

式中:

v——腫瘤體積,cm3;

a——腫瘤最大長徑,cm;

b——腫瘤最小短徑,cm;

c1——抑瘤率,%;

s——脾臟指數(shù),mg/g;

m1——給藥組平均瘤重,g;

m2——模型組平均瘤重,g;

m3——脾臟質(zhì)量,mg;

m4——小鼠體質(zhì)量,g。

1.2.5 ELISA法檢測小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-ɑ含量 小鼠全血靜置2 h,離心分離血清(4 ℃,1 200 r/min,20 min)-80 ℃的冰箱保存。根據(jù)試劑盒說明書檢測荷瘤小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-ɑ的含量。

1.2.6 RT-RCR法檢測小鼠腫瘤組織中IL-18、IL-1β、MLKL、RIP1、RIP3RNA表達(dá)量 提取各組小鼠腫瘤中的RNA[22-24],按TB Green q-PCR試劑盒說明書操作。引物設(shè)計如表1所示。

表1 引物序列

1.2.7 Western Blot法檢測小鼠腫瘤組織中MLKL、RIP1、RIP3蛋白表達(dá)量 提取各組小鼠腫瘤中的蛋白[25-28],經(jīng)蛋白定量、制膠并上樣、電泳、電轉(zhuǎn)后,將涂布顯影液的PDVF膜曝光后保存圖片。

1.2.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS、Origin 2022軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BRAP-1、BRAP-2對H226細(xì)胞增殖率的影響

如圖1所示,BRAP-1對H226細(xì)胞增殖率的影響顯著,隨著給藥質(zhì)量濃度從1 μg/mL增加到5 000 μg/mL,H226細(xì)胞增殖率逐漸降低,呈劑量依賴性[7]。相比BRAP-1,BRAP-2對H226細(xì)胞增殖率的影響較小,1 μg/mL干預(yù)細(xì)胞后增殖率仍較高,而在50～5 000 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),各組干預(yù)濃度雖有明顯差別,但對H226細(xì)胞增殖率的影響相近。BRAP-1對H226細(xì)胞的增殖有更顯著的抑制作用,可能是BRAP-1糖醛酸含量較高相對分子質(zhì)量較小,有利于其發(fā)揮抗炎抗腫瘤作用[29],因此后續(xù)動物試驗以BRAP-1給藥。

圖1 BRAP-1、BRAP-2質(zhì)量濃度對H226細(xì)胞增殖率的影響

2.2 BRAP-1對H226細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量的影響

各組荷瘤小鼠抑瘤率從高到低依次為:陽性組>BRAP-1高劑量組>BRAP-1中劑量組>BRAP-1低劑量組。如圖2所示,隨著BRAP-1給藥劑量的增加,小鼠腫瘤生長出現(xiàn)遲緩現(xiàn)象,相比模型組,陽性組抑瘤效果顯著(P<0.01)、BRAP-1中、高劑量組均可減緩腫瘤生長速度,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BRAP-1可能通過破壞腫瘤生長微環(huán)境、免疫細(xì)胞胞間復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮抗腫瘤作用,抗腫瘤作用呈劑量依賴性[30-31]。

與模型組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01

2.3 BRAP-1對H226細(xì)胞荷瘤小鼠體重的影響

陽性組小鼠體重下降,可能是化療藥物順鉑在抑制腫瘤的過程中使荷瘤小鼠的食欲減退等毒副作用引起的。與陽性組相比,BRAP-1各劑量組荷瘤小鼠的體重前后變化較小,說明BRAP-1對小鼠毒副作用甚少,可在盡量不損傷機體正常組織的情況下防治腫瘤進(jìn)一步發(fā)展,這便是植物多糖BRAP-1優(yōu)勢所在(圖3)。

圖3 BRAP-1對H226細(xì)胞荷瘤小鼠體重的影響

2.4 BRAP-1對H226細(xì)胞荷瘤小鼠脾臟指數(shù)的影響

與對照組相比,陽性藥順鉑組小鼠脾臟指數(shù)均降低顯著(P<0.01),BRAP-1各劑量給藥組的脾臟指數(shù)均有所增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中低、中、高劑量組間無顯著差異(圖4)。脾臟是免疫細(xì)胞居住的場所,屬于外周免疫器官,也是血液循環(huán)系統(tǒng)中重要的過濾器官,可清除血液內(nèi)的病原體、衰亡的血細(xì)胞等[32-33]。機體免疫功能表現(xiàn)亢進(jìn)或抑制時,脾臟細(xì)胞也相應(yīng)的增殖或萎縮,因此,脾臟指數(shù)可在一定程度上體現(xiàn)BRAP-1對機體免疫功能的影響[34]。

與對照組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01

2.5 H226細(xì)胞荷瘤小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-ɑ含量

模型組小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-ɑ的含量均顯著增加,陽性組小鼠血清中IL-18、TNF-ɑ的含量與模型組相比有降低趨勢,而BRAP-1各組血清中細(xì)胞因子水平具有增長趨勢。陽性組和BRAP-1高劑量組的IL-1β明顯增加(P<0.05),而BRAP-1低、中劑量組小鼠血清中IL-1β含量均比模型組低(表2)。

表2 BRAP-1對H226細(xì)胞荷瘤小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-ɑ含量的影響?

有研究[29]表明,腫瘤壞死因子、白介素對腫瘤的增殖、發(fā)展具有重要作用。當(dāng)IL-1β、IL-18被消除時,腫瘤生長會延遲。但I(xiàn)L-1β、IL-18在腫瘤發(fā)生中既可以是協(xié)作關(guān)系,也可以是對立關(guān)系,具體取決于腫瘤類型和背景。在一項肺癌細(xì)胞系研究[30]中,IL-1β可通過刺激炎癥介質(zhì)(如IL-6、IL-8等)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,還會增加乳腺癌細(xì)胞的侵襲性;TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生,其在一些細(xì)胞中的表達(dá)較低,包括成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。綜上,BRAP-1可通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子水平發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.6 H226細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤中IL-18、IL-1β、MLKL、RIP1、RIP3 mRNA表達(dá)量

與模型組比較,陽性藥順鉑組小鼠腫瘤組織中IL-18、MLKL、RIP1、RIP3mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),IL-1βmRNA表達(dá)量減小(P<0.05);BRAP-1組小鼠腫瘤組織中MLKL、RIP1、RIP3mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),表明BRAP-1可激活壞死性凋亡通路,導(dǎo)致其關(guān)鍵因子基因轉(zhuǎn)錄水平升高(圖5)。壞死性凋亡受MLKL、RIP1、RIP3的調(diào)控,研究[35-36]表明,癌組織中RIPK1和RIPK3的表達(dá)量顯著低于周圍正常組織,此外,腫瘤中RIPK3和MLKL表達(dá)的降低與較差的總體生存率顯著相關(guān)。BRAP-1可通過上調(diào)MLKL、RIP1、RIP3基因的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡,從而阻遏腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步增殖及癌癥的繼續(xù)發(fā)展。

與模型組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01

2.7 H226細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤中MLKL、RIP1、RIP3蛋白表達(dá)量

感染、組織損傷、炎癥和癌癥都會導(dǎo)致MLKL、RIP3表達(dá)升高,雖然RIP1、RIP3是MLKL的上游蛋白,但在許多細(xì)胞系和組織中MLKL可在缺乏RIP3的情況下表達(dá)[37]。與模型組比較,陽性藥順鉑組小鼠腫瘤組織中MLKL、RIP1蛋白表達(dá)水平顯著升高,RIP3蛋白表達(dá)量無明顯差別;BRAP-1組小鼠腫瘤組織中MLKL、RIP1、RIP3蛋白表達(dá)水平顯著升高,可見BRAP-1通過激活壞死性凋亡通路發(fā)揮抗腫瘤作用(圖6)。

從左到右分別為模型組、陽性藥組、BRAP-1低劑量組、BRAP-1中劑量組、BRAP-1高劑量組

3 結(jié)論

蕪菁酸性多糖一組分可控制H226細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤生長,升高脾臟指數(shù)及荷瘤小鼠血清中的白細(xì)胞介素18、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子α細(xì)胞因子水平,上調(diào)MLKL、RIP1、RIP3基因及其蛋白的表達(dá)。通過調(diào)控MLKL/RIP1/RIP3壞死性凋亡通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡,從而抑制癌細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用。