王嘉康

唐浩國

陳 靜

司啟賀

申茹曉

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽 471023)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為一種常見的食源性致病菌,可引起人類和動物的感染和食物性中毒[1]。隨著抗生素的使用,多重耐藥性金黃色葡萄球菌的傳播正在以驚人的速度增加[2]。金葡菌生物膜能夠幫助細(xì)菌抵御宿主免疫系統(tǒng),更容易產(chǎn)生耐藥菌株,甚至多重耐藥菌株,這些耐藥菌株是導(dǎo)致慢性感染的主要病源,給人類和家畜的生命健康和食品安全造成極大的危害[3]。

生物膜由細(xì)菌群落和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)構(gòu)成,是細(xì)菌黏附于物體的表面,通過分泌多糖、蛋白質(zhì)、糖蛋白、糖脂和細(xì)胞外DNA(eDNA)等形成的高度組織化的膜樣聚合物[4-5],具有極強的黏附性和抗逆性,能夠幫助細(xì)菌很好地適應(yīng)周圍的環(huán)境[6]。自然環(huán)境中大多數(shù)細(xì)菌都能以生物膜的形式存在,生物膜能夠黏附在宿主的組織表面,一旦組織細(xì)胞受損,致病菌能夠不斷釋放毒素引發(fā)感染,并且可能進(jìn)入機體內(nèi)隨血液流動播散,導(dǎo)致全身性感染[7]。

苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀、丙酸鈣等化學(xué)防腐劑雖能夠有效抑制食源性致病菌的生長,但它同時也對人體健康和環(huán)境造成一定威脅。因此,植物源天然防腐劑的開發(fā)和應(yīng)用成為當(dāng)下研究的熱點之一[8-10]。水飛薊素是從水飛薊果實及種子中提取的一類二氫黃酮醇與苯丙素衍生物縮合而成的黃酮木脂素類成分,因其安全無毒、無刺激性且具有抗炎保肝、抗氧化等優(yōu)點[11-12],在食品保健[13-15]、醫(yī)藥[16]、化妝品[17]等行業(yè)得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。研究擬探究水飛薊素對金黃色葡萄球菌生物膜的影響,以期為植物源活性物質(zhì)的進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水飛薊素:純度80%,西安云悅生物科技有限公司;

二甲基亞砜(DMSO)、結(jié)晶紫:分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;

腦心浸出液肉湯(BHI):青島海博生物技術(shù)有限公司;

噻唑藍(lán)(MTT):純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25923,ATCC29213,ATCC6538):中國普通微生物菌種保藏管理中心;

紫外—可見分光光度計:UV2400型,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;

離心機:TDZ5-WS型,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;

真空冷凍干燥機:ALPHA 1-2 LD plus型,德國Christ公司;

傅立葉變換中遠(yuǎn)紅外光譜儀:IFS 125HR,德國Bruker公司;

多功能酶標(biāo)儀:Infinite E Plex型,上海Tecan實驗器材有限公司。

1.2 最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定

采用Fei等[18]的方法,MIC為肉眼看不見細(xì)菌菌落生長的最低濃度,所有試驗平行3次。

1.3 S. aureus ATCC25923產(chǎn)膜能力鑒定

采用Tremblay等[19]的方法,結(jié)晶紫染色生物膜后,使用酶標(biāo)儀于OD490 nm測OD值;判斷標(biāo)準(zhǔn):以O(shè)D490 nm<0.11為陰性株,0.111.50為強產(chǎn)膜菌株。

1.4 結(jié)晶紫染色研究水飛薊素對S. aureus ATCC25923生物膜的抑制及清除作用

1.4.1 對S.aureusATCC25923生物膜的抑制作用 將制備好的含有不同濃度水飛薊素的菌懸液分別加入到96孔板中,每孔200 μL,以對應(yīng)濃度的含有水飛薊素的無菌培養(yǎng)液作為陰性對照。將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用酶標(biāo)儀測定630 nm處的吸光度。移除菌懸液,PBS輕柔漂洗3次,在60 ℃烘箱中干燥20 min。在每個孔中加入250 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的結(jié)晶紫溶液,37 ℃下染色5 min,用蒸餾水輕柔漂洗3次,在60 ℃烘箱中干燥20 min。加入250 μL體積分?jǐn)?shù)為33%的醋酸溶液溶解生物膜上結(jié)合的結(jié)晶紫染料,5 min后在酶標(biāo)儀上測定570 nm處的吸光度,所有試驗平行3次。相對生物膜形成能力以生物膜形成指數(shù)表示[20],生物膜形成指數(shù)按式(1)計算。

B=(S-C1)/(G-C2),

(1)

式中:

B——生物膜形成指數(shù);

S——染色后OD570 nm值;

C1——染色后空白對照OD570 nm值;

G——培養(yǎng)后OD630 nm值;

C2——培養(yǎng)后空白對照OD630 nm值。

1.4.2 對S.aureusATCC25923成熟生物膜的清除作用

于96孔板上每孔加入1×108CFU/mL的菌懸液200 μL,靜置培養(yǎng)24 h形成成熟生物膜后棄去培養(yǎng)液,注入新的培養(yǎng)液與不同濃度的水飛薊素藥液。陰性對照組依舊使用培養(yǎng)液進(jìn)行處理。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,PBS洗去浮菌,使用結(jié)晶紫定量染色法觀察生物膜的剩余量,所有試驗平行3次。按式(2)計算生物膜清除率[21]。

(2)

試中:

B——生物膜清除率,%;

c1——各處理組OD570 nm值;

c2——對照組OD570 nm值。

“拓基礎(chǔ)、強根基、淡專業(yè)、重運用、靈考核”五位一體的人才培養(yǎng)模式是一個有機整體，不可分開運用與理解，但是各個部分的側(cè)重點又各不相同。

1.5 MTT染色法檢測水飛薊素對生物膜代謝的影響

參照J(rèn)adhav等[22]的方法,使用MTT染色法檢測水飛薊素對生物膜代謝的影響。所有試驗平行3次。

1.6 水飛薊素對S. aureus ATCC25923毒力因子的影響

1.6.1 對S.aureusATCC25923溶血活性的影響 參照徐云鳳[23]37-41的方法測定水飛薊素對金黃色葡萄球菌溶血活性的影響。溶劑組為陽性對照,無菌液組為陰性對照,所有試驗平行3次。

1.6.2 對S.aureusATCC25923凝固酶效價的影響 參照徐云鳳[23]37-41的方法測定水飛薊素對金黃色葡萄球菌凝固酶效價的影響。使用凍干血漿測定細(xì)菌凝固酶效價,6 h內(nèi)間隔0.5 h觀察一次結(jié)果,若出現(xiàn)凝固現(xiàn)象,即為陽性,否則為陰性。所有試驗平行3次。

1.7 光學(xué)顯微鏡觀察水飛薊素對S. aureus ATCC25923生物膜的影響

取不同濃度水飛薊素處理的菌懸液1 mL加入6孔板中,同時放入已滅菌的蓋玻片,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用結(jié)晶紫染色法在光學(xué)顯微鏡下觀察水飛薊素對生物膜的影響。所有試驗平行3次。

1.8 傅里葉紅外光譜分析

參照Padmavathi等[24]的方法并稍作修改,采用傅里葉紅外光譜法(fourier transform infrared spectrometry,FT-IR)對水飛薊素處理的金黃色葡萄球菌成分變化進(jìn)行測定。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次,試驗結(jié)果使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析和處理數(shù)據(jù),采用Tukey法進(jìn)行差異顯著性檢驗,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)膜能力的鑒定

結(jié)晶紫染色后,S.aureusATCC25923生物膜在490 nm處的OD值為1.704±0.133,大于1.5,根據(jù)Tremblay等[19]的判斷標(biāo)準(zhǔn),試驗采用的菌株為高產(chǎn)膜菌株。

2.2 MIC的測定

如表1所示,對照組均有菌落生長,但在水飛薊素質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg/mL的培養(yǎng)基上,S.aureusATCC25923均無菌落生長,證明水飛薊素對ATCC25923的MIC為0.5 mg/mL。與二氫楊梅素(MIC為1.25 mg/mL)和藤茶提取物(MIC為6.3 mg/mL)以及大蒜水提物(MIC為24.0 mg/mL)對金黃色葡萄球菌的抑菌活性相比[25-26],水飛薊素的抑菌能力具有明顯優(yōu)勢。

表1 水飛薊素對S. aureus ATCC25923的最小抑菌濃度?

2.3 水飛薊素對S. aureus ATCC25923生物膜的抑制及清除作用

*表示與對照組相比具有顯著差異,P<0.05;**表示與對照組相比具有極顯著差異,P<0.01

由圖1可以看出,水飛薊素可以顯著抑制金黃色葡萄球菌ATCC25923生物膜的形成,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,其中對照組的生物膜形成指數(shù)為2.679,1/2MIC和MIC濃度的生物膜形成指數(shù)為0.566和0.271,相比于對照組分別下降了78.9%和90.0%,具有極顯著差異。而低濃度的水飛薊素對生物膜形成的抑制作用較小?；艏验萚27]研究發(fā)現(xiàn),1/16MIC濃度下的蒲公英水提物可誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌生物膜的形成,使生物膜生成量增加,但高濃度的蒲公英水提物可顯著抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成。崔海英等[28]研究發(fā)現(xiàn),0.1%丁香精油對金黃色葡萄球菌生物膜的抑制率達(dá)到99.73%。與其他天然產(chǎn)物相比,水飛薊素對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用較為顯著。

2.3.2 對S.aureusATCC25923成熟生物膜的清除作用

在細(xì)菌生物膜成熟之后,加入不同濃度的水飛薊素處理,結(jié)晶紫染色后,使用酶標(biāo)儀測定其對生物膜的清除能力,結(jié)果如圖2所示。

*表示與對照組相比具有顯著差異, P<0.05;**表示與對照組相比具有極顯著差異,P<0.01

由圖2可以看出,較高濃度的水飛薊素對成熟生物膜具有良好的清除作用,其中1/4MIC、1/2MIC和MIC濃度的生物膜清除率分別為16.6%,46.4%,89.2%,而1/16MIC濃度的清除率僅有0.16%,與對照組相比差異不顯著。在李虹[29]的研究中,最小生物膜抑制濃度(MBIC)下的環(huán)二肽處理金黃色葡萄球菌8 h,其生物膜清除率達(dá)到59.17%。試驗結(jié)果說明水飛薊素具有較好的生物膜清除作用,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

2.4 水飛薊素對生物膜內(nèi)細(xì)菌代謝的抑制作用

MTT可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈,在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下,外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無此功能。

二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶,用多功能酶標(biāo)儀在570 nm處測定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞代謝情況。如圖3所示,當(dāng)水飛薊素濃度達(dá)到1/4MIC時就能顯著抑制生物膜內(nèi)細(xì)菌的代謝,隨著水飛薊素濃度的增加,抑制作用逐漸增強,MIC濃度的抑制率達(dá)到85.5%。此試驗結(jié)果與結(jié)晶紫染色法測定水飛薊素對生物膜形成的抑制作用有較高的一致性。

*表示與對照組相比具有顯著差異,P<0.05;**表示與對照組相比具有極顯著差異,P<0.01

2.5 光學(xué)顯微鏡觀察水飛薊素對生物膜的抑制作用

將蓋玻片用結(jié)晶紫染色后,放在光學(xué)顯微鏡下觀察,結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 水飛薊素對S. aureus ATCC25923生物膜的影響

*表示與對照組相比具有顯著差異,P<0.05;**表示與對照組相比具有極顯著差異,P<0.01

低濃度的水飛薊素對生物膜的抑制作用較弱,高濃度的水飛薊素能夠顯著抑制S.aureusATCC25923生物膜的生長,在MIC濃度下僅有極少量的生物膜形成,生物膜覆蓋率僅為9.5%。這與結(jié)晶紫法檢測結(jié)果高度一致。

2.6 對溶血活性的影響

金黃色葡萄球菌溶血因子已被證明可影響多種人類細(xì)胞類型,包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,同時還可裂解哺乳動物的紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(PMN)[30],β-溶血素還可以通過內(nèi)皮細(xì)胞抑制白細(xì)胞介素-8(IL-8)的表達(dá),這些有助于金黃色葡萄球菌的逃逸和誘導(dǎo)生物膜形成[31]。試驗采用無菌脫纖維羊血,使用多功能酶標(biāo)儀檢測OD450 nm處吸光值來測定水飛薊素對S.aureusATCC25923溶血因子表達(dá)的影響,結(jié)果如圖6所示。

不同大寫字母表示組間具有顯著差異(P<0.05)

由圖6可以看出,水飛薊素處理組的溶血活性與陽性對照組相比顯著降低,當(dāng)水飛薊素濃度達(dá)到1/8MIC時可以顯著抑制S.aureusATCC25923溶血因子的表達(dá),且濃度達(dá)到1/4MIC時的溶血活性與無菌空白對照組相當(dāng)。

2.7 凝固酶效價的測定

金黃色葡萄球菌凝固酶能夠與凝血酶原以及其他幾種血漿蛋白結(jié)合,形成血纖蛋白凝塊,觸發(fā)血纖蛋白原向血纖蛋白轉(zhuǎn)化,進(jìn)而增加金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面的血纖維蛋白凝塊,抑制吞噬作用[32]。試驗采用凍干兔血漿來測定金黃色葡萄球菌凝固酶的表達(dá),結(jié)果如表2所示。

表2 對凝固酶表達(dá)的影響?

由表2可知,對照組在0.5 h后出現(xiàn)凝固現(xiàn)象,1 h后完全凝固,1/8MIC組在5.5 h后完全凝固,而1/4MIC組在4 h后已完全凝固,1/2MIC以及MIC組分別在2.5 h和4 h開始出現(xiàn)凝固現(xiàn)象,且一直處于半凝固狀態(tài)。說明水飛薊素可以顯著抑制S.aureusATCC25923凝固酶的表達(dá),但未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

2.8 FT-IR分析

圖7 傅里葉紅外分析

2.9 水飛薊素對S. aureus ATCC25923生物膜的作用機制

如圖8所示,在金黃色葡萄球菌生物膜形成的4個階段中,水飛薊素可以作用于細(xì)菌增殖聚集階段抑制初期生物膜的形成,也可作用于成熟生物膜形成階段,清除已形成的生物膜。同時水飛薊素還可在很大程度上抑制金黃色葡萄球菌溶血因子以及凝固酶等毒力因子的表達(dá)。

圖8 水飛薊素對S. aureus ATCC25923生物膜及毒力因子影響機制

3 結(jié)論

采用結(jié)晶紫法探究了水飛薊素對S.aureusATCC25923生物膜形成的抑制以及對成熟生物膜的清除作用,0.5倍和1倍最小抑菌質(zhì)量濃度下的水飛薊素處理對生物膜的抑制率分別達(dá)到78.9%和90%,清除率分別達(dá)到46.4%和89.2%。同時采用MTT染色法測定水飛薊素對生物膜內(nèi)活菌代謝的影響,結(jié)果顯示亞抑制濃度下的水飛薊素能夠顯著抑制生物膜內(nèi)細(xì)菌的代謝能力。在Jadhav等[22]的研究中,使用MTT染色法檢測處蓍草精油可以顯著抑制單增李斯特菌生物膜內(nèi)活菌的代謝能力。后續(xù)試驗中,采用結(jié)晶紫染色在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)一步觀察水飛薊素對金黃色葡萄球菌生物膜的影響,以更直觀地呈現(xiàn)水飛薊素對細(xì)菌生物膜的影響。之后針對S.aureusATCC25923溶血活性以及凝固酶的表達(dá)進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)低濃度的水飛薊素可以顯著抑制其溶血因子及凝固酶的表達(dá),在徐云風(fēng)[23]37-41關(guān)于安石榴苷對金黃色葡萄球菌抑制作用的研究中顯示,低劑量的安石榴苷可以抑制其毒力因子的表達(dá),但未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。傅里葉紅外光譜分析結(jié)果顯示,在水飛薊素處理后,與金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)、脂肪酸、水合作用等相關(guān)吸收峰強度明顯減弱,這也揭示了水飛薊素可能通過影響細(xì)菌水合,蛋白質(zhì)合成來影響細(xì)菌表面疏水性、黏附性、毒力因子的表達(dá),從而抑制其生物膜形成的潛在機制。

綜上所述,水飛薊素對金黃色葡萄球菌的生物膜形成具有很好的抑制以及清除作用,同時能夠顯著抑制其毒力因子的表達(dá)。