劉旭明　辛蕊華　仇正英　李錦宇　劉蓮　王貴波

【摘 要】 目的：建立參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷的定量檢測(cè)方法。方法：采用HPLC法，以C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），乙腈作為流動(dòng)相A，測(cè)定了參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、甘草苷的含量。結(jié)果：蒼術(shù)酮在0.0082～0.1308 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率97.8%（RSD=0.7%，n=6）；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在0.0016～0.0256 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率103.4%（RSD=1.8%，n=6）；甘草苷在0.0153 ～0.2444 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率104.2%（RSD=0.5%，n=6）。結(jié)論：本研究成功建立了參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I和甘草苷的檢測(cè)方法，且方法專屬性強(qiáng)，精密度、重復(fù)性良好。

【關(guān)鍵詞】 參苓白術(shù)散；HPLC；蒼術(shù)酮；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；甘草苷

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2024）05-0048-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.05.zgmzmjyyzz202405010

Determination of three components in Shenling Baizhu Powder by HPLC

LIU Xuming XIN Ruihua QIU Zhengying LI Jinyu LIU Lian WANG Guibo*

Abstract：Objective A method for the determination of Atractyloketone， Atractylolactone Ⅰ and Liquiritin in Shenling Baizhu Powder was established.Methods The contents of Atractylone， Atractylide Ⅰ and Liquiritin in Shenling Baizhu Powder were determined by HPLC on C18 column （5 μm， 4.6×250 mm） with acetonitrile as mobile phase A.Results Atractylone had a good linear relationship in the concentration range of 0.0082-0.1308 mg/mL， and the average sample recovery rate was 97.8% （RSD=0.7%， n=6）; Atractylide Ⅰ had a good linear relationship in the concentration range of 0.0016-0.0256 mg/mL， and the average sample recovery rate was 103.4% （RSD=1.8%， n=6）; The linear relationship of Liquiritin in the concentration range of 0.0153-0.2444 mg/mL was good， and the average sample recovery rate was104.2% （RSD=0.5%，n=6）.Conclusion In this study， a method for the detection of Atractyloketone， Atractylolactone Ⅰ and Liquiritin in Shenling Baizhu Powder was established successfully， and the method had strong specificity， good precision and repeatability.

Keywords：Shenling Baizhu Powder; HPLC; Atractylone;Atractylide Ⅰ ; Liquiritin

參苓白術(shù)散，出自《太平惠民和劑局方》［1］。由人參、茯苓、炒白術(shù)、甘草、山藥、炒白扁豆、蓮子、炒薏苡仁、砂仁、桔梗等十味中藥粉碎混合，過(guò)篩制得，具有益氣、健脾、止瀉的功效［2］。該處方中人參、茯苓、炒白術(shù)為君藥，山藥、炒白扁豆、蓮子、炒薏苡仁為臣藥，砂仁為佐藥，桔梗、甘草為使藥，可用于脾虛濕盛型泄瀉、脾虛濕阻型腹瀉、肺脾氣虛證慢性鼻竇炎、慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期等的治療［3-7］。處方中白術(shù)有“健脾補(bǔ)氣第一要藥”之稱，主要有效成分是倍半萜類，包括蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ等，具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤等功效［8-9］。甘草苷作為甘草的主要活性成分之一，具有抗炎、抗胃潰瘍活性等功效［10］。目前中華人民共和國(guó)藥典和獸藥典對(duì)于參苓白術(shù)散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅記載薄層色譜法定性鑒別，未見(jiàn)收載相關(guān)成分含量測(cè)定項(xiàng)；已有的研究主要應(yīng)用HPLC法等對(duì)參苓白術(shù)散中人參的主要成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1、甘草的主要成分槲皮素和蘆丁、白術(shù)的主要成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、砂仁的主要成分樟腦、龍腦和乙酸龍腦酯進(jìn)行了含量測(cè)定［15-18］，而對(duì)其中的蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷的含量研究鮮有報(bào)道；且市面上白術(shù)與甘草的質(zhì)量差異很大［11-12］。本試驗(yàn)將其為切入點(diǎn)，用HPLC法定量測(cè)定參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷的含量，以期為參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷含量測(cè)定法的確立及今后藥典和獸藥典制訂相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó) Waters 公司）；AP-01P真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，美國(guó)Agilient公司）；多功能粉碎機(jī)（永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）。

1.2 材料 蒼術(shù)酮標(biāo)準(zhǔn)品（CAS#6989-21-5，95%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品（CAS#73069-13-3，98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品（111610-201908，95%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，色譜純乙腈、甲醇均購(gòu)自賽默飛；分析純磷酸購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)所用藥材全部購(gòu)自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所質(zhì)量檢測(cè)均合格。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒼術(shù)酮和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量測(cè)定

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 精密稱取一定量蒼術(shù)酮和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品粉末于5 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.1.2 供試品溶液制備［8］ 稱取參苓白術(shù)散粉末2.0 g，加入20 mL甲醇，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率50 Hz）30 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足缺失的重量，搖勻后過(guò)濾，濾液用0.45 μm濾膜濾過(guò)即得供試品溶液。

2.1.1.3 陰性對(duì)照溶液制備 去除方劑中的白術(shù)，按2.1.1.2方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.2 色譜條件［8］ C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，梯度洗脫程序見(jiàn)表1，柱溫 25 ℃；蒼術(shù)酮檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品溶液、陰性對(duì)照溶液、供試品溶液，按2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖1～6所示，參苓白術(shù)散供試品溶液和蒼術(shù)酮標(biāo)準(zhǔn)品、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品在相同時(shí)間出現(xiàn)色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，說(shuō)明該方法專屬性良好。

2.1.4 線性關(guān)系考察 將2.1.1.1中蒼術(shù)酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至濃度為0.1308 mg/mL、0.0654 mg/mL、0.0327 mg/mL、0.0164 mg/mL、0.0082 mg/mL，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至濃度為0.0256 mg/mL、0.0128 mg/mL、0.0064 mg/mL、0.0032 mg/mL、0.0016 mg/mL。按2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果如圖7、圖8所示，蒼術(shù)酮的回歸方程為y=10000000X+62991，R2=0.9991；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的回歸方程為y=60000000X-8055.9，R2=0.9997。說(shuō)明蒼術(shù)酮在0.0082～0.1308 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在0.0016～0.0256 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.1.1.1項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計(jì)算出蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的峰面積RSD值分別為0.3%、0.2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定同一批樣品6份，每份2.0 g，按2.1.1.2方法制備供試液，按2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計(jì)算出蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量的RSD值分別為1.5%、0.5%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取2.1.1.2項(xiàng)下供試品溶液，按2.1.2色譜條件分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計(jì)算出蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量的RSD值分別為0.7%、1.3%，表明蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定1g已知含量樣品6份，精密加入濃度為0.327 mg/mL蒼術(shù)酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，濃度為0.064 mg/mL白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按2.1.1.2方法制備供試液，按2.1.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2，蒼術(shù)酮和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ平均加樣回收率分別為97.8%、103.4%，RSD值分別為0.7%、1.8%（n=6）。

2.2 甘草苷含量測(cè)定

2.2.1 溶液配制

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 精密稱取一定量的甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品粉末于5 mL容量瓶，加70%乙醇溶解并定容，配制成含甘草苷濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液制備［13］ 精密稱取參苓白術(shù)散粉末2.0 g，加入70%乙醇20 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再次稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足缺失的重量，搖勻后過(guò)濾，濾液用0.45 μm濾膜濾過(guò)即得供試品溶液。

2.2.1.3 陰性對(duì)照溶液制備 去除方劑中甘草，按2.2.1.2方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.2色譜條件［13］ C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表3；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液、陰性對(duì)照溶液、供試品溶液，按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖9～11所示，參苓白術(shù)散供試品溶液和甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品在相同時(shí)間出現(xiàn)色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，說(shuō)明該方法專屬性良好。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1.1項(xiàng)下甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至濃度為0.2444 mg/mL、0.1222 mg/mL、0.0611 mg/mL、0.0306 mg/mL、0.0153 mg/mL，按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果如圖12所示，甘草苷的回歸方程為y=10000000X+16664，R2=0.9994，說(shuō)明甘草苷在0.0153 ～0.2444 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1.1項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計(jì)算出甘草苷峰面積RSD值為0.9%（n=6），說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定同一批樣品6份，每份2.0 g，按2.2.1.2方法制備供試品溶液，按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計(jì)算出甘草苷含量的RSD值為1.3%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取2.2.1.2項(xiàng)下供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。計(jì)算出甘草苷含量的RSD值為1.8%，說(shuō)明甘草苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取0.5g已知含量樣品6份，精密加入濃度為0.306 mg/mL甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按2.2.1.2方法制備供試品溶液，按2.2.2色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，分析數(shù)據(jù)。結(jié)果見(jiàn)表4，甘草苷平均加樣回收率為104.2%，RSD值為0.5%（n=6）。

2.3 樣品含量測(cè)定 分別取3批購(gòu)自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司的中藥飲片，按照藥典要求粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，混勻。取各批參苓白術(shù)散各約2.0 g，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算制劑中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

HPLC法具有靈敏度高，方便快速等特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛運(yùn)用于中藥成分鑒別、含量測(cè)定等方面［14］。在參苓白術(shù)散的研究中，多數(shù)研究者利用HPLC法僅對(duì)人參皂苷Rg1、Re及Rb1進(jìn)行定量分析［1，15］，個(gè)別學(xué)者應(yīng)用HPLC、UPLC和氣相色譜法對(duì)甘草黃酮和人參皂苷等進(jìn)行了定量分析［16-18］，而對(duì)蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和甘草苷的研究較少。

在對(duì)白術(shù)含量測(cè)定時(shí)，按照丁逸雪等［8］構(gòu)建的色譜條件檢測(cè)時(shí)所呈現(xiàn)的峰形對(duì)稱、分離效果良好，因此直接選用該色譜條件分別考察了100%甲醇溶液、100%乙醇溶液兩種溶劑的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100%甲醇溶液作為溶劑時(shí)，檢測(cè)到待測(cè)成份的含量較高，雜峰較少。此外，也考察了超聲提取時(shí)間（20 min、30 min、40 min）對(duì)待測(cè)成份的影響，結(jié)果表明樣品在100%甲醇溶液中超聲處理30 min時(shí)，待測(cè)成份已提取完全，該方法在操作上簡(jiǎn)單易行。

在對(duì)甘草苷含量測(cè)定時(shí)，參考《中華人民共和國(guó)獸藥典》甘草項(xiàng)檢測(cè)方法色譜條件及樣品處理方法，對(duì)流動(dòng)相比例稍作調(diào)整用以檢測(cè)樣品，結(jié)果顯示峰形對(duì)稱、分離效果良好。在樣品制備方面，本試驗(yàn)所用方法相對(duì)于靳雪飛構(gòu)建的供試品溶液制備方法簡(jiǎn)單易行，大大節(jié)約了時(shí)間成本［19］。以改良后的色譜條件考察了70%乙醇溶液、100%乙醇溶液作為溶劑的提取效果，結(jié)果表明，70%乙醇溶液作為溶劑時(shí)，檢測(cè)到待測(cè)成份的含量較高，雜峰較少；另外也考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液流動(dòng)相體系洗脫效果，結(jié)果顯示乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，甘草苷分離效果較好且峰形對(duì)稱。

本研究成功建立了參苓白術(shù)散中蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I和甘草苷的檢測(cè)方法，且方法簡(jiǎn)單快捷、專屬性強(qiáng)、精密度、重復(fù)性良好，將為確立和進(jìn)一步完善參苓白術(shù)散中相關(guān)成分的定量分析及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

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（收稿日期：2023-06-12 編輯：陶希睿）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFD1602203）；甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目（21CX6NA126）；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2019-4-1）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS- ASTIP-2015-LIHPS-06）

作者簡(jiǎn)介：劉旭明（1996—），男，漢族，碩士，研究方向?yàn)橹蝎F醫(yī)學(xué)。E-mail：Lxm_plasmid@163.com

通信作者：王貴波（1982—）男，漢族，碩士，副研究員，研究方向?yàn)橹蝎F醫(yī)學(xué)。E-mail：wangguibo2005@163.com