宋海英 李紅霞 王逍

摘要? 目的：探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）DANCR對缺氧誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞PC12氧化損傷的影響及其可能作用機(jī)制。方法：選取榆林市星元醫(yī)院于2019年10月—2021年10月就診的缺血性腦卒中病人40例為疾病組，以同期30名健康體檢者為正常組，檢測lncRNA DANCR、miR-193a-3p表達(dá)量，Pearson法分析血清lncRNA DANCR與miR-193a-3p的相關(guān)性；建立缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型，si-NC、si-DANCR、miR-NC、miR-193a-3p mimics分別轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后缺氧處理24 h，si-DANCR＋anti-miR-NC、si-DANCR＋anti-miR-193a-3p分別共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后缺氧處理24 h；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測lncRNA DANCR、miR-193a-3p表達(dá)量；試劑盒檢測乳酸脫氫酶（LDH）漏出率、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性；用凋亡試劑盒檢測凋亡率；雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)檢測lncRNA DANCR、miR-193a-3p靶向關(guān)系；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)量。結(jié)果：血清中l(wèi)ncRNA DANCR與miR-193a-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。缺氧處理后，PC12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DANCR表達(dá)量升高（P＜0.05），miR-193a-3p表達(dá)量降低（P＜0.05）；分別與轉(zhuǎn)染si-NC或miR-NC比較，轉(zhuǎn)染si-DANCR或miR-193a-3p mimics后，缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞LDH漏出率、MDA含量、凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白水平降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05）；與共轉(zhuǎn)染si-DANCR＋anti-miR-NC比較，共轉(zhuǎn)染si-DANCR＋anti-miR-193a-3p后，缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞LDH漏出率、MDA含量、凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白水平升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05）。結(jié)論：干擾lncRNA DANCR可通過促進(jìn)miR-193a-3p表達(dá)而抑制氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡，從而減輕缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，血清中l(wèi)ncRNA DANCR、miR-193a-3p水平對缺血性腦卒中病人具有預(yù)測價值，且聯(lián)合診斷價值更高。

關(guān)鍵詞? 缺氧；長鏈非編碼RNA DANCR；miR-193a-3p；神經(jīng)細(xì)胞；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.013

作者單位? 1.榆林市星元醫(yī)院（ 陜西榆林? 719000）；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（陜西咸陽? 712000）

通訊作者? 王逍，E-mail：459403867@qq.com

引用信息? 宋海英，李紅霞，王逍.lncRNA DANCR靶向調(diào)控miR-193a-3p表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（2）：279-285.

缺血性腦卒中屬于腦血管疾病，我國缺血性腦卒中發(fā)病率、死亡率逐年上升，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量，腦組織缺氧、缺血可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)功能障礙［1］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、代謝等生理過程，并可在腦血管疾病發(fā)生中發(fā)揮調(diào)控作用［2］。已有研究表明，lncRNA MALAT1在缺氧誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞PC12中表達(dá)量增加，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激［3-4］。lncRNA DANCR在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可增加白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率從而引起細(xì)胞損傷［5］。但lncRNA DANCR與腦血管疾病相關(guān)研究相對較少。StarBase預(yù)測顯示，lncRNA DANCR、miR-193a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。有研究表明，miR-193a-3p在高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［6］。目前l(fā)ncRNA DANCR、miR-193a-3p在缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷中的研究尚未見報道。因此，本研究主要探究lncRNA DANCR/miR-193a-3p是否介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷過程。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

上海通派生物科技有限公司提供大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞PC12；美國Thermo Fisher公司提供Lipofectamine 2000、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒；北京天根生化科技有限公司提供miRNA提取、SYBR Green試劑盒；上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供si-NC、si-DANCR、miR-NC、miR-193a-3p mimics、pcDNA、pcDNA-DANCR、anti-miR-NC、anti-miR-193a-3p；南京建成生物工程研究所提供乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒；上海愛必信生物科技有限公司提供凋亡檢測試劑盒；美國Promega公司提供野生型載體WT-DANCR、突變型載體MUT-DANCR；北京索萊寶公司提供熒光素酶活性檢測試劑盒；美國Abcam公司提供實(shí)驗(yàn)所需cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗及二抗。

1.2? 方法

1.2.1? 一般資料

選取2019年10月—2021年10月于榆林市星元醫(yī)院就診的缺血性腦卒中病人40例為疾病組，均為我院依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)確診的缺血性腦卒中病人，其中男18例，女22例；年齡45～68（61.65±3.72）歲；另選取30名同期健康體檢者作為正常組，男12名，女18名；年齡44～71（63.55±1.52）歲。研究對象性別、年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分別采集40例病人及30名健康體檢者空腹靜脈血6 mL，離心分離血清后保存至－80 ℃待測。

1.2.2? 實(shí)驗(yàn)處理及分組

PC12細(xì)胞用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為對照組。依據(jù)細(xì)胞密度不同分別接種于6孔板（1×105個/孔）、96孔板（2×103個/孔），放入缺氧培養(yǎng)箱（37 ℃、4%CO2體積分?jǐn)?shù)、95%N2、1%O2）內(nèi)缺氧處理24 h［7］，記為缺氧組。si-NC、si-DANCR、miR-NC、miR-193a-3p mimics用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，缺氧處理24 h，分別記為缺氧＋si-NC組、缺氧＋si-DANCR組、缺氧＋miR-NC組、缺氧＋miR-193a-3p組。si-DANCR與anti-miR-NC、si-DANCR與anti-miR-193a-3p用Lipofectamine 2000分別共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，缺氧處理24 h，分別記為缺氧＋si-DANCR＋anti-miR-NC組、缺氧＋si-DANCR＋anti-miR-193a-3p組。

1.2.3? 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測血清及細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DANCR、miR-193a-3p的表達(dá)水平

用Trizol試劑、miRNA提取試劑盒分別提取細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL/孔，正反向引物0.8 μL/孔，cDNA 1 μL/孔，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足體系至20 μL。GAPDH表達(dá)量作為lncRNA DANCR內(nèi)參，U6表達(dá)量作為miR-193a-3p內(nèi)參，2－ΔΔCt法分析lncRNA DANCR、miR-193a-3p相對表達(dá)量。

1.2.4? 檢測LDH漏出率、MDA含量、SOD活性

收集1.2.2實(shí)驗(yàn)分組PC12細(xì)胞，參照試劑盒說明書檢測LDH水平，并檢測細(xì)胞吸光度（OD），計(jì)算LDH漏出率。將1.2.2中實(shí)驗(yàn)分組PC12細(xì)胞分別接種于24孔板后棄培養(yǎng)基，加入裂解液裂解細(xì)胞，用試劑盒檢測上清液中MDA含量、SOD活性。

1.2.5? 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

取各組PC12細(xì)胞接種于6孔板，棄培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化，取細(xì)胞懸液（1×105個/mL），離心（1 000 r/min）10 min，棄上清，膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC）、碘化丙啶（PI）分別染色，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.2.6? 驗(yàn)證lncRNA DANCR、miR-193a-3p的靶向關(guān)系

雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)：WT-DANCR/MUT-DANCR與miR-NC、miR-193a-3p mimics用Lipofectamine 2000分別共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，試劑盒檢測熒光素酶活性。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)：si-NC、si-DANCR、pcDNA、pcDNA-DANCR用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，qRT-PCR法檢測miR-193a-3p相對表達(dá)量。

1.2.7? 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測蛋白表達(dá)量

RIPA裂解液提取PC12細(xì)胞蛋白，蛋白、上樣緩沖液充分混勻，沸水內(nèi)放置5 min。在每個泳道上加入40 μg蛋白后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），采用常規(guī)濕法將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，與稀釋的一抗［cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、cleaved-Caspase-9（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）］4 ℃反應(yīng)24 h，與稀釋的二抗（1∶3 000）37 ℃結(jié)合1 h，以GAPDH為內(nèi)參，采用Quantity One軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量。

1.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Pearson相關(guān)分析法分析缺血性腦卒中病人lncRNA DANCR、miR-193a-3p表達(dá)的相關(guān)性。

2? 結(jié)? 果

2.1? 疾病組與正常組血清lncRNA DANCR和miR-193a-3p表達(dá)比較

與正常組相比，疾病組血清lncRNA DANCR表達(dá)增加，miR-193a-3p表達(dá)降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2? 血清中l(wèi)ncRNA DANCR和miR-193a-3p的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，缺血性腦卒中病人血清lncRNA DANCR和miR-193a-3p呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.365，P＜0.05）。詳見圖1。

2.3? 血清lncRNA DANCR和miR-193a-3p水平對缺血性腦卒中的預(yù)測價值

血清lncRNADANCR、miR-193a-3p水平預(yù)測缺血性腦卒中病人的曲線下面積分別為0.888、0.853，特異度分別為83.33%、73.33%，敏感度分別為82.50%、82.50%，最佳截?cái)嘀捣謩e為0.84、0.59；二者聯(lián)合預(yù)測缺血性腦卒中病人的曲線下面積、特異度、敏感度分別為0.917、83.33%、87.50%。詳見圖2。

2.4? lncRNA DANCR和miR-193a-3p在缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中的表達(dá)

與對照組比較，缺氧組lncRNA DANCR表達(dá)量升高（P＜0.05），miR-193a-3p表達(dá)量降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.5? 干擾lncRNA DANCR表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的影響

與對照組比較，缺氧組LDH漏出率、MDA含量升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05），凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與缺氧＋si-NC組比較，缺氧＋si-DANCR組LDH漏出率、MDA含量降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05），凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。詳見圖3、表3。

2.6? lncRNA DANCR靶向調(diào)控miR-193a-3p的表達(dá)

lncRNA DANCR、miR-193a-3p存在互補(bǔ)序列，詳見圖4。miR-193a-3p過表達(dá)可降低野生型載體WT-DANCR熒光素酶活性（P＜0.05），而對突變型載體MUT-DANCR熒光素酶活性無明顯影響。詳見表4。與si-NC組比較，si-DANCR組miR-193a-3p表達(dá)量升高（P＜0.05）；與pcDNA組比較，pcDNA-DANCR組miR-193a-3p表達(dá)量降低（P＜0.05）。詳見表5。

2.7? miR-193a-3p過表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的影響

與缺氧＋miR-NC組比較，缺氧＋miR-193a-3p組LDH漏出率、MDA含量降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05），凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。詳見圖5、表6。

2.8? 下調(diào)miR-193a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA DANCR表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的作用

與缺氧＋si-DANCR＋anti-miR-NC組比較，缺氧＋si-DANCR＋anti-miR-193a-3p組LDH漏出率、MDA含量升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05），凋亡率、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。詳見圖6、表7。

3? 討? 論

lncRNA作為內(nèi)源性長鏈非編碼RNA分子，其作用機(jī)制主要為lncRNA含有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，一個lncRNA包含多個miRNA的反應(yīng)元件，并可通過充當(dāng)miRNA競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）而影響miRNA靶基因表達(dá)，該機(jī)制在細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程中具有重要調(diào)控作用，并可參與神經(jīng)細(xì)胞損傷過程［8-10］。

lncRNA DANCR在氧糖剝奪誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中表達(dá)水平升高，lncRNA DANCR直接與miR-19a-3p結(jié)合，敲低lncRNA DANCR可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡［11］。lncRNA DANCR表達(dá)下調(diào)可降低氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞炎性細(xì)胞因子水平并減少細(xì)胞凋亡［12］。骨折病人血清中l(wèi)ncRNA DANCR表達(dá)明顯升高，干擾lncRNA DANCR可促進(jìn)成骨細(xì)胞系的增殖和分化［13］。lncRNA DANCR在缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果顯示，缺血性腦卒中病人血清及缺氧條件下PC12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DANCR表達(dá)上調(diào)，提示lncRNA DANCR可能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷，引發(fā)神經(jīng)功能障礙，在缺血性腦卒中發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。LDH、MDA屬于氧化酶，SOD屬于抗氧化酶，SOD可清除負(fù)氧離子而保護(hù)細(xì)胞免受損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞LDH、MDA水平升高，SOD活性降低，而干擾lncRNA DANCR可降低LDH、MDA水平，并可增強(qiáng)SOD活性，提示干擾lncRNA DANCR可抑制氧化應(yīng)激而減輕細(xì)胞損傷。Caspase家族蛋白可參與腦組織損傷過程，cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9表達(dá)量增加可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［15］。本研究結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)，其主要通過激活Caspase-3、Caspase-9而促進(jìn)細(xì)胞損傷，干擾lncRNA DANCR可減弱缺氧對PC12細(xì)胞凋亡的作用。提示干擾lncRNA DANCR可抑制缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

本研究進(jìn)一步證實(shí)lncRNA DANCR、miR-193a-3p存在靶向調(diào)控作用，lncRNADANCR可以充當(dāng)miR-193a-3p ceRNA而抑制其表達(dá)。有研究表明，miR-193a-3p過表達(dá)可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷并抑制細(xì)胞凋亡［16］。miR-193a-3p在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡和炎癥損傷［17］。然而，Jiang等［18］研究表明膿毒癥致急性肺損傷中miR-193a-3p表達(dá)增加，并促進(jìn)促炎細(xì)胞因子分泌量、細(xì)胞凋亡增加，降低細(xì)胞活力。表明miR-193a-3p在不同組織損傷中可發(fā)揮不同作用。本研究結(jié)果顯示，缺血性腦卒中病人血清及缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中miR-193a-3p表達(dá)量降低，miR-193a-3p過表達(dá)可抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激、減少凋亡，而下調(diào)miR-193a-3p可降低干擾lncRNA DANCR對細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡的作用，且血清lncRNA DANCR與miR-193a-3p表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，提示lncRNA DANCR/miR-193a-3p可介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷過程，且血清lncRNA DANCR、miR-193a-3p水平對缺血性腦卒中具有預(yù)測價值，且聯(lián)合診斷價值更高。

綜上所述，干擾lncRNA DANCR可通過靶向調(diào)控miR-193a-3p而抑制氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡，從而抵抗缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，lncRNA DANCR對神經(jīng)細(xì)胞的作用與miR-193a-3p密切相關(guān)，為進(jìn)一步闡釋缺血性腦卒中的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，lncRNA DANCR可能是缺血性腦卒中潛在治療靶點(diǎn)。但lncRNA DANCR/miR-193a-3p如何調(diào)控下游靶基因表達(dá)而參與神經(jīng)細(xì)胞損傷過程仍需進(jìn)一步探究。

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（收稿日期：2022-06-13）

（本文編輯王麗）