裴佳, 梁瑾, 金夏煥, 夏麗娜, 賀曉斌, 王艷紅

兩種叢枝菌根真菌和黃瓜花葉病毒復(fù)合作用對煙草生長和光合特性的影響

裴佳, 梁瑾, 金夏煥, 夏麗娜, 賀曉斌, 王艷紅*

浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室, 杭州 311300

為研究叢枝菌根真菌(AM真菌)和黃瓜花葉病毒(virus, CMV)的復(fù)合作用對煙草生長的影響, 在大棚控制試驗中, 通過設(shè)置4個AM真菌處理水平(接種滅菌混合AM真菌、、和兩者混合菌種)和2個CMV處理水平(不接種和接種), 從生理生態(tài)學(xué)角度來研究其調(diào)控作用。結(jié)果表明: 接種CMV顯著降低了未接種AM真菌煙草植株的總干重、凈光合速率()和瞬時水分利用效率(); 接種AM真菌顯著提高煙草植株的菌根侵染率、菌絲酶活性、總干重、n和。無論接種CMV與否, AM真菌的菌根效應(yīng)均為正值且存在菌種間的差異, 以的菌根效應(yīng)最為顯著?？梢? 接種AM真菌對煙草抗CMV能力具有一定的促進作用, 增加煙草植株的光合能力可能是AM真菌增強煙草植株抗CMV能力的主要作用機理。

AM真菌; 黃瓜花葉病毒; 煙草; 光合能力; 生物量積累

0 前言

煙草(L.)是當(dāng)今世界上重要的經(jīng)濟作物, 我國現(xiàn)已成為世界煙草生產(chǎn)第一大國[1]。黃瓜花葉病是煙草最主要的病害之一, 在我國各省煙區(qū)均有發(fā)生, 嚴重影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì), 導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟損失[2–3]。黃瓜花葉病是由黃瓜花葉病毒(, CMV)侵染寄主植物引起, CMV寄主范圍極廣, 能侵染1000多種單、雙子葉植物, 在自然界主要通過寄主植物種子或繁殖材料、汁液摩擦及昆蟲傳播, 是目前已知的世界性分布范圍最廣、最具經(jīng)濟危害的植物病毒[4–6]。以往的研究表明, CMV侵染導(dǎo)致絕大多數(shù)寄主植物表現(xiàn)出各種典型癥狀, 例如, 葉片斑駁畸形、某些代謝平衡和酶活性受到抑制, 同時光合作用受到抑制, 導(dǎo)致植物生長遲緩, 使植物減產(chǎn)甚至死亡[5,7–10]。目前CMV的防治措施主要有化學(xué)防治、物理防治、生物制劑防治以及利用基因工程技術(shù)等培育抗病新品種, 這些方法雖然在一定程度上可以限制或減少CMV在田間的傳播, 但往往會造成二次污染或成本較高, 尋求安全、高效、穩(wěn)定的病毒防控技術(shù)勢在必行[5,11–13]。其中, 利用有益微生物, 例如接種叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, 簡稱AM真菌)來提高宿主植物對病毒的抗性, 越來越引起廣泛關(guān)注[14–16]。

AM真菌是土壤中分布最為廣泛的微生物類群, 與農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)最為密切, 能與陸地上80%以上的植物根系建立共生關(guān)系, 形成菌根結(jié)構(gòu), 促進宿主植物的生長和發(fā)育, 并提高植物對生物或非生物脅迫的抗逆性[16–19]。光合作用是植物最重要的代謝活動, 植物感染病毒后其光合性狀一般都會受到影響[8, 20], 然而, 接種AM真菌能否調(diào)控CMV對煙草光合生理生長的抑制作用則相對較為缺乏。為此, 本實驗通過大棚控制實驗, 研究AM真菌對CMV感染的煙草光合生理生長的調(diào)控機理, 以期為煙草的大面積栽培和產(chǎn)業(yè)化管理提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)基質(zhì)

本實驗所用煙草種子購買自海洪種業(yè)(濰坊, 山東), 1% NaClO溶液滅菌消毒處理后, 播種至塑料花盆(18 cm×16.5 cm×12 cm)中, 每盆播種4粒種子, 待種子萌發(fā)后間苗至每盆1株。培養(yǎng)基質(zhì)為當(dāng)?shù)丶t黃壤與泥炭土按3: 1體積比混合, 過2 mm土壤篩, 后經(jīng)25 KGy輻照滅菌處理[21], 每個花盆中裝入混合基質(zhì)2 kg。培養(yǎng)基質(zhì)的基本性質(zhì)為: 有機質(zhì)23.14 mg·g–1, 全氮0.82 mg·g–1, 全磷0.28 mg·g–1, pH 5.85 (水︰土= 5︰1)。供試菌種為摩西斗管囊霉((T. H. Nicolson & Gerd.) C. Walker & A. Schü?ler) (BGC HUN03B) (簡寫為Fm)和地表球囊霉((P. Karst.) Oehl, G. A. Silva and Sieverd) (BGC GD01C) (簡寫為Dv), 這兩種菌種均由北京市農(nóng)林科學(xué)研究院植物營養(yǎng)與資源研究所“叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(BGC)”提供。CMV由浙江農(nóng)林大學(xué)微生物實驗室提供。

1.2 實驗處理

本試驗是二因素完全隨機試驗設(shè)計, 因素1為AM真菌接種處理, 因素2為CMV接種處理。其中, AM真菌接種處理設(shè)置4個AM真菌處理水平(接種滅菌混合AM真菌, NM; 接種摩西斗管囊霉, Fm; 接種地表球囊霉, Dv; 接種混合AM真菌, Fm+Dv); CMV處理設(shè)置2個處理水平(不接種, CK; 接種, CMV), 共計8個處理組合, 每個處理組合重復(fù)10次。AM真菌接種處理與煙草種子播種同時進行, 接種時將各菌種在土壤基質(zhì)表層1—2 cm深處平鋪一層, 然后覆上1—2 cm的滅菌基質(zhì)。每盆加入AM菌種的量為20 g(含有217±50個真菌孢子/10 g土), 其中滅菌菌種和混合菌種中Fm菌種和Dv菌種的量按1: 1質(zhì)量比。本實驗接種菌劑為經(jīng)高粱擴繁后獲得含菌絲、孢子和侵染根段的接種物[22]。接種滅菌混合AM真菌為經(jīng)121 ℃、0.11 MPa高壓蒸汽滅菌2 h, 連續(xù)2次, 中間間隔24 h, 放置1周后使用的混合菌劑, 同時在接種后澆入20 mL菌劑濾液, 以保持微生物區(qū)系的一致性[23]。CMV的接種方法為傷口接種法: 幼苗長至3—4片葉時頂上兩片葉用金鋼砂紙將葉面擦傷, 然后在擦傷處涂上含病毒的磷酸緩沖液(pH 6.5), 健康對照以接種不含病毒的緩沖液處理[8]。為避免由昆蟲傳播導(dǎo)致的交叉感染, 接種CMV和作為對照的煙草植株分別放置在人工搭置的紗網(wǎng)內(nèi)進行隔離。實驗期間, 適時澆水, 常規(guī)管理。實驗處理時間為2019年4月至2019年9月, 其中, 2019年4月25日開始煙草種子播種和AM真菌接種, 為減少CMV對菌絲生長的抑制作用, 2019年5月20日開始CMV接種處理, 2019年9月25日開始實驗收獲。實驗期間, 塑料大棚內(nèi)平均溫度為29.2 ℃, 平均濕度為60% (Thermo Datalogger, Cambell Inc, USA)。

1.3 指標測定

收獲前, 每個處理組合隨機選取4株植株利用Li-6400便攜式光合儀(LI-COR, Lincoln, USA), 選擇晴朗天氣的8: 00—11: 00進行光合生理指標的測定[24]: 測定時將葉面溫度控制為27 oC、葉室相對濕度控制為70%、氣體流速控制為500 umol·s–1、CO2濃度控制為400 μmol·mol–1、光照強度控制為1200 μmol·m–2·s–1; 測定的光合作用參數(shù)為凈光合速率(n)、氣孔導(dǎo)度(s)、胞間CO2(i)和蒸騰速率(r), 利用n/r計算得出瞬時水分利用效率()。

實驗結(jié)束時, 小心將整株植物從基質(zhì)中分離出來, 用水多次沖洗地上部分和根系后, 用吸水紙吸干根系或植株表面多余水分, 記錄根系總鮮重。隨機挑取一部分細根分為三部分, 記錄其鮮重后, 分別用于菌根侵染率和菌絲酶活性的測定。其中, 菌根侵染率的測定方法采用改進的臺盼藍染色法[25]染色30 min, 然后用網(wǎng)格交叉法[26]鏡檢測定侵染率。另外, 菌絲琥鉑酸脫氫酶(SDH)和堿性磷酸酶(ALP)活性的測定是參照Zhao等[27]的方法。煙草地上部分和剩余根系于70 ℃, 72 h烘干至恒重并稱重。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實驗中用菌根依賴性(Mycorrhizal dependence; 簡稱MD)來衡量不同植物對菌根真菌依賴性的大小[28]:

其中,DW是AM真菌接種處理的植物干重,(DW)是未接種AM真菌的植物平均干重。

對所測指標用二元方差分析方法(General Linear Model; GLM過程, SPSS 22.0)研究AM真菌和CMV對煙草生長、光合參數(shù)和AM真菌功能特性等的影響。數(shù)據(jù)分析前, 所有數(shù)據(jù)已經(jīng)過正態(tài)性和齊性檢驗。在交互作用顯著情況下, 用LSD多重比較法分析不同處理組合間植物生理生長指標的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌和CMV復(fù)合作用對煙草根系侵染率、菌絲酶活性及生物量生產(chǎn)的影響

如圖1所示, 與對照相比, 除Dv接種植株外, CMV接種對菌根侵染率、SDH活性和ALP活性均沒有顯著影響; 不論是在對照或CMV接種下, 與未接種AM真菌(簡稱NM植株; 下同)的植株相比, 接種AM真菌植株(簡稱AM植株; 下同)的菌根侵染率、SDH活性和ALP活性均顯著提高。AMF和CMV的交互作用僅對菌根侵染率有顯著影響(表1)。

與對照相比, 接種CMV顯著降低了煙草的總生物量積累; 不論是在對照或接種CMV條件下, AM植株的總干重均顯著高于NM植株, 同時, 接種Dv菌種的植株其總生物量顯著高于其他菌種, 說明不同菌種對煙草植株生物量的促進作用存在差異; 另外, 在CMV接種條件下, 接種Fm菌種、Dv菌種和混合菌種的植株其總干重與對照條件下的相應(yīng)的AM植株相比分別下降了約63.13%、56.37%和61.65%(圖2A), 說明AM真菌對煙草生物量積累的促進效應(yīng)受到CMV的抑制。此外, 與對照相比, 接種CMV顯著提高了煙草的根冠比, 但接種AM真菌與否對煙草的根冠比沒有顯著影響(圖2B)。AMF和CMV的交互作用僅對總干重有顯著影響(表1)。

2.2 AM真菌和CMV復(fù)合作用對煙草葉片光合參數(shù)的影響

如圖3A和3B所示, 與對照相比, 接種CMV均顯著降低了煙草葉片的SPAD值和n; 不論接種CMV與否, AMF均顯著提高了SPAD值和n, 但各菌種之間的效應(yīng)差異不顯著。除混合接種植株外, CMV接種顯著提高了葉片的s, 但AM真菌對s的效應(yīng)隨CMV的接種與否及菌種類型而發(fā)生改變(圖3C)。如圖3D所示, 與對照相比, CMV接種顯著增加了NM植株的r, 但降低了AM植株的r; AM真菌接種顯著降低了r, 尤其是在CMV接種條件下。如圖3E所示, 與對照相比, CMV接種顯著降低了i; 不論CMV接種與否, AM真菌接種均顯著提高了i, 但各菌種之間的效應(yīng)差異不顯著。此外, 與對照相比, CMV接種顯著降低了NM植株的; 不論CMV接種與否, AM真菌接種均顯著提高了(圖3F)。由此可見, AM真菌接種可一定程度上削弱CMV對煙草葉片光合特性的抑制效應(yīng), 但各菌種間效應(yīng)差異不顯著。除SPAD外, AMF和CMV的交互作用對以上光合參數(shù)均具有顯著影響(表1)。

表1 煙草的相應(yīng)參數(shù)對黃瓜花葉病毒(CMV)、AM真菌(AMF)及其兩者交互效應(yīng)二元方差分析的F值及其自由度

注: CK為對照, CMV為接種黃瓜花葉病毒; NM是接種滅菌混合AM真菌, Fm是接種摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae), Dv是接種地表球囊霉(Diversispora versiformis), Fm+Dv是接種兩菌種的混合菌種。每個數(shù)據(jù)代表三個重復(fù)的平均值(±標準誤)。標有相同字母的柱子表示差異不顯著(P > 0.05)。下同。

Figure 1 Interactive effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and(CMV) on root colonization (A), succinate dehydrogenase (B) and alkaline phosphatase (C)of tobacco plants

注: 每個數(shù)據(jù)代表十個重復(fù)的平均值(±標準誤)。標有相同字母的柱子表示差異不顯著(P > 0.05)。

Figure 2 Interactive effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and(CMV) on total dry weight (A) and root: shoot ratio (B) of tobacco plants

注: 每個數(shù)據(jù)代表四個重復(fù)的平均值(±標準誤)。標有相同字母的柱子表示差異不顯著(P > 0.05)。

Figure 3 Interactive effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and(CMV) on relative chlorophyll contents (A), net photosynthetic rate (B), stomatal conductance (C), transpiration rate (D), intercellular CO2concentration (E) and instantaneous water use efficiency (F) of tobacco plants

2.3 AM真菌和CMV復(fù)合作用對菌根效應(yīng)的影響

如圖4所示, 除Dv接種植株外, CMV接種顯著降低了菌根依賴性, 說明CMV對菌根的生長具有一定的抑制作用。同時, 在CMV接種條件下, 不同AM真菌的菌根依賴性間均存在顯著差異, 最大值為Dv接種的植株, 說明Dv菌種對CMV感染植株的調(diào)控效應(yīng)最為顯著。

3 討論

3.1 CMV和AM真菌的復(fù)合作用對煙草生長的影響

本實驗中接種CMV顯著降低了煙草的總生物量積累和光合參數(shù)(圖2和圖3), 說明CMV對煙草的生長和光合性能具有抑制作用; 然而接種AM真菌顯著提高了煙草的生物量生產(chǎn)和光合性能, 同時不論接種CMV與否, 煙草的菌根依賴性(MD)均為正值, 說明接種AM真菌可以一定程度上減緩CMV的負效應(yīng), 從而增強宿主植物對CMV的抗性。本實驗中接種AM真菌增強宿主植物對葉際病毒CMV的抗性與番茄接種后增強對(TYLCSV)的抗性[29]以及番茄接種后增強對(TSWV)的抗性是一致的, 但Elsharkawy等[10]對感染CMV的黃瓜接種后發(fā)現(xiàn), 其生物量與未接種AM真菌的黃瓜沒有顯著差異, 接種AM真菌病沒有提高宿主植物對CMV的抗性。另外, Shaul等[30]對感染(TMV)的煙草植株接種菌種后發(fā)現(xiàn), 菌根植株的葉片比非菌根植物表現(xiàn)出更為嚴重的病毒感染癥狀, 這種接種AM真菌后宿主植物對病毒抗性降低的現(xiàn)象在對番茄[31]的研究中也有發(fā)現(xiàn)。這說明, AM真菌的效用及其對宿主植物的生物防護功能不僅依賴于AM真菌的種類、宿主植物、病原菌的種類, 而且依賴于三者之間的相互作用及其與環(huán)境的兼容性[14]。以往的研究表明, AM真菌提高植物抗病毒能力主要表現(xiàn)為以下四個方面: ①AM真菌提高宿主植物光合生理、營養(yǎng)和水分狀況等, 從而增強植物對病原菌等的抵抗能力[14, 32]; ②AM真菌與病原菌對宿主植物根系侵染位點、空間及其碳水化合物利用等存在競爭作用[33–35]; ③AM真菌共生體會誘導(dǎo)宿主植物根系分泌物發(fā)生改變, 并形成獨特的微生物區(qū)系保護層, 成為防御病原菌入侵的重要防御體系[36–37]; ④AM真菌能誘導(dǎo)宿主植物啟動防御機制, 促進可溶性蛋白、SOD和POD等含量的增加, 從而增強宿主植物的抗病毒能力[38–39]。本實驗中煙草光合性能的增強很可能是AM真菌提高宿主植物抗CMV侵染的主要調(diào)控機制。另外, 與未接種CMV的植株相比, 接種CMV后煙草植株的菌絲酶活性沒有顯著降低(圖1), 說明CMV和AM真菌侵染位點間不存在競爭作用。然而, 由于所測指標有限, 在后續(xù)的研究中有必要從多個層面深入探討其內(nèi)在調(diào)控機理。

注: 每個數(shù)據(jù)代表十個重復(fù)的平均值(±標準誤)。標有相同字母的柱子表示差異不顯著(P > 0.05)。

Figure 4 Interactive effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and(CMV) on mycorrhizal dependence of tobacco plants

3.2 不同AM真菌的菌根效應(yīng)差異

本實驗中的菌根效應(yīng)在不同AM真菌間表現(xiàn)出顯著差異,單獨接種的菌根效應(yīng)要高于和混合接種的效應(yīng), 尤其是在CMV接種條件下(圖4)。目前, 關(guān)于AM真菌與病原菌的復(fù)合作用研究大多采用單一AM真菌接種, Berruti等[40]通過整合分析發(fā)現(xiàn)脅迫條件下單一AM真菌對植物生長的促進作用相比于多種AM真菌混合將更為有效。Gosling等[41]進一步通過實驗驗證發(fā)現(xiàn), 對處于磷脅迫下的洋蔥接種1—7種不同多樣性組合的AM真菌后, AM真菌多樣性的提高并沒有顯著提高菌根效應(yīng), 說明對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)來說不同AM真菌間存在功能冗余。然而, Klironomos[42]的研究則發(fā)現(xiàn)AM真菌的多樣性越高越有利于高植物生產(chǎn)力的維持。Jansa等[43]的研究也指出, 接種混合AM真菌比接種單一菌種對植物養(yǎng)分吸收和生長的促進作用更為明顯。這可能是由于混合菌種可實現(xiàn)不同AM真菌功能上的互補, 更有利于促進宿主植物生產(chǎn)力的提高[35, 44]。有研究者指出, 造成這種AM真菌菌根效應(yīng)差異的原因在于所采用的實驗處理[41]: 大多實驗研究中, 宿主植物對AM真菌多樣性的響應(yīng)格局僅關(guān)注一種脅迫因子或病原菌; 實際上, 在自然條件下植物往往受到多種脅迫因子的共同作用, 且這些脅迫因子往往隨季節(jié)或隨機事件影響, 在這種情況下, 宿主植物和多種AM真菌共生無疑是有利的, 這就是所謂的“保底策略”(bet-hedging strategy); 而在宿主植物遭受一種脅迫時, 一種或少數(shù)幾種功能相適應(yīng)的AM真菌就可以減緩脅迫并為宿主植物提供最大收益, 因此, AM真菌多樣性的增加反而導(dǎo)致功能冗余。本實驗中, 以菌種的抗CMV效果最為顯著, 而Veresoglou和Rillig[45]的整合分析發(fā)現(xiàn)在以往的大多數(shù)研究中的抗病原菌效果最好。因此, 在接下來的研究中結(jié)合野外實驗驗證并選擇更為有效的AM真菌株系是非常有必要的。

4 結(jié)論

綜上所述, 本實驗中CMV顯著抑制了煙草的生長和光合性能, 雖然CMV對AM真菌的效應(yīng)具有一定的抑制作用, 接種AM真菌顯著提高了煙草的生物量積累和光合性能, 說明接種AM真菌可以一定程度上減緩CMV對煙草生長的抑制作用, 從而增強宿主植物對CMV的抗性, 其中, 光合能力的提高有可能是感染CMV情況下菌根化煙草抗性提高的主要作用機理, 但還需要進一步的深入研究以揭示AM真菌對CMV的調(diào)控機理。相對于其他AM真菌,菌種的抗CMV效果最為顯著, 但還需要結(jié)合野外實驗, 進一步驗證和篩選有效的煙草抗CMV菌種。

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Interactive effects of two arbuscular mycorrhizal fungi andon the growth and photosynthetic capabilities of tobacco

Pei jia, LIANG Jin, JIN Xiahuan, XIA Lina, HE Xiaobin, WANG Yanhong*

State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, China

In order to elucidate the interactive effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) andvirus (CMV) on the growth and photosynthetic capabilities of tobacco, a greenhouse experiment was conducted. During the experiment, inoculated (inoculation with,, either alone or their combination) and non-inoculated (inoculation with sterilized AM fungi) tobacco seedlings were randomly subjected to two CMV regimes (inoculated with or without CMV). The results showed that CMV significantly decreased the total dry weight, net photosynthetic rate () and instantaneous water use efficiency (), whereas Mycorrhizal inoculation significantly improved root colonization rate, fungal activities of succinate dehydrogenase and alkaline phosphatase, total dry weight,andof tobacco plants. Furthermore, whether inoculation with CMV or not, mycorrhizal inoculation conferred positive effects on the growth of tobacco plants especially with the inoculation of, and there were differences in mycorrhizal benefits between AM fungi species. In conclusion, mycorrhizal inoculation promoted the resistance of tobacco to CMV, and the enhancement in photosynthetic capabilities might be the underlying mechanism for mycorrhizal efficiency.

arbuscular mycorrhizal fungi;; tobacco; photosynthetic capability; biomass accumulation

10.14108/j.cnki.1008-8873.2024.01.007

R282.4

A

1008-8873(2024)01-055-08

2021-07-28;

2021-09-28基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(No. 31400366; 32071644); 中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)項目(XDB 31030000); 浙江省“尖兵”“翎雁”研發(fā)攻關(guān)計劃項目(2022C02019)

裴佳(1995—), 女, 江蘇人, 碩士研究生, 主要研究方向為菌根生態(tài)學(xué)和植物生態(tài)學(xué), E–mail: 2019602042032@stu.zafu.edu.cn

通信作者:王艷紅, 女, 博士, 副教授, 主要研究方向為恢復(fù)生態(tài)學(xué)和菌根生態(tài)學(xué), E–mail: wangyanhong@zafu.edu.cn

裴佳, 梁瑾, 金夏煥, 等. 兩種叢枝菌根真菌和黃瓜花葉病毒復(fù)合作用對煙草生長和光合特性的影響[J]. 生態(tài)科學(xué), 2024, 43(1): 55–62.

PEIJia, LIANG Jin, JIN Xiahuan, et al. Interactive effects of two arbuscular mycorrhizal fungi andon the growth and photosynthetic capabilities of tobacco[J]. Ecological Science, 2024, 43(1): 55–62.