趙璐，張雅琳，劉竹溪

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院重大慢性病精準醫(yī)學協(xié)同創(chuàng)新重點實驗室，沈陽 110004

神經(jīng)管畸形（neural tube defects， NTDs）如脊柱裂、腦膨出、無腦畸形等，是由于胚胎神經(jīng)管閉合障礙引起的一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天畸形，其中脊柱裂最常見，可導致嬰兒嚴重殘疾甚至死亡，給患兒及其家庭以及社會都帶來沉重的負擔［1-2］。研究［3］顯示，胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)管無法閉合是導致NTDs的直接原因，而細胞凋亡是NTDs的發(fā)生機制之一。線粒體是重要的生物能量和信號傳導中樞，線粒體生物發(fā)生對于維持線粒體的生物能量功能非常重要，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的核心［4］。線粒體生物發(fā)生是指通過增加線粒體內(nèi)酶的表達及活性進而形成新的線粒體的復雜過程，是一種線粒體自我更新的途徑［5］，其調(diào)節(jié)因子包括沉默調(diào)節(jié)蛋白1（silent mating type information regulation 2 homolog-1， SIRT1）、氧化物酶體增殖物激活的受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha， PGC-1α）及其下游線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A， TFAM）等。研究［6］顯示，SIRT1廣泛參與代謝控制和線粒體的生物發(fā)生，是線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究［7］顯示，轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）也可以對線粒體生物起源相關(guān)基因（如Ppargc1α和Ppar1α）的表達發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。研究［8］發(fā)現(xiàn)，在NTDs中，神經(jīng)管閉合失敗與神經(jīng)上皮細胞過度凋亡有關(guān)，其中的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax參與調(diào)控細胞凋亡并發(fā)揮重要作用。全反式維甲酸（all-trans retinoic acid， atRA）是維甲酸的衍生物，可作為一種致畸劑影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。研究［9］發(fā)現(xiàn)，對于懷孕的哺乳動物，過量atRA可以引起后代各種NTDs的發(fā)生。白藜蘆醇（resveratrol， RSV）是一種天然植物多酚，在植物中分布廣，在細胞的生物學功能中具有重要作用［14］，也被確定為SIRT1激活劑［10］。有報道［11-12］稱，RSV可預防糖尿病引起的胚胎畸形，減少胚胎發(fā)育不良，RSV還可通過激活SIRT1發(fā)揮對抗細胞凋亡的作用。2021年5月9日—2023年10月30日，我們觀察了RSV腹腔注射對NTDs模型大鼠胚胎脊髓組織中線粒體生物發(fā)生調(diào)節(jié)因子及細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 NTDs模型大鼠制備、分組及RSV給予方法30只雌性Wistar大鼠和10只雄性Wistar大鼠購自北京華阜康生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院SPF級實驗動物房。雌鼠隨機分為對照組、致畸組和RSV組，每組10只。雌雄（比例為3∶1）合籠，第二天清晨陰道涂片，發(fā)現(xiàn)有精子定為胚胎第0天（記為E0）。AtRA（140 mg/kg）購自美國Sigma-Aldrich公司，溶于橄欖油后，在E10給予致畸組和RSV組孕鼠一次灌胃處理，對照組孕鼠注入等量橄欖油。RSV（40 mg/kg）購自美國MedChemExpress公司，溶于50%生理鹽水、5% DMSO、5% Tween80和40% PEG400中，從E8至E17每天腹腔注射一次，對照組給予同體積的溶劑腹膜內(nèi)注射。在E18時，剖宮產(chǎn)取出大鼠胚胎，在體視顯微鏡下觀察并分離新鮮未經(jīng)固定脊髓組織，立即快速冷凍，并在-80 ℃下儲存。

1.2 各組大鼠胚胎脊髓組織中線粒體生物發(fā)生標志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM檢測

1.2.1 各組大鼠胚胎脊髓組織中線粒體生物發(fā)生標志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法。取各組大鼠胚胎脊髓組織，使用TRIzol提取總RNA，用核酸蛋白測定測定樣品的OD260值及OD260/OD280比值，計算RNA總濃度及純度。依照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照TaKaRa公司的試劑盒說明書，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。擴增條件為95 ℃、2 min，95 ℃、5 s，60 ℃、32 s，共40個循環(huán)。引物序列如下：SIRT1正向引物為5′-TGTTTCCTGTGGGATACCTGA-3′，反向引物為5′-TGAAGAATGGTCTTGGGTCTTT-3′；TFEB正向引物為5′-GCGGTCACTGAAGGACAGAG-3′，反向引物為5′-GCAGCAAACTTGTTGCCGTA-3′；PGC-1α正向引物為5′-CACCGTAAATCTGCGGGATG-3′，反向引物為5′-TATCCATTCTCAAGAGCAGCGAAAG-3′；GAPDH正向引物為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，反向引物為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。以2-ΔΔCt法表示組織中目的mRNA的相對表達量。

1.2.2 各組大鼠胚胎脊髓組織中線粒體生物發(fā)生標志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組大鼠胚胎脊髓組織，研磨勻漿后蛋白裂解，BCA法檢測總蛋白濃度。取40 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，將凝膠轉(zhuǎn)至甲醇激活過的PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗。加入一抗（SIRT1抗體1：1000稀釋，購自美國Cell Signaling Technology公司；TFEB抗體1∶1000稀釋，購自中國Proteintech公司；PGC1α抗體1∶1000稀釋，購自中國Proteintech公司；TFAM抗體1∶1000稀釋，購自中國Proteintech公司；β-actin抗體1∶5000稀釋，購自中國Proteintech公司），4 ℃搖床孵育過夜。TBST清洗3次，加入相應(yīng)二抗水平搖床室溫孵育1 h，TBST清洗3次，ECL顯色。Image J圖像分析軟件對條帶進行定量分析比較，以目標蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 各組大鼠胚胎脊髓組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax檢測 采用Western blotting法。檢測方法參照1.2.2，其中Bcl-2抗體1∶1000稀釋，購自美國Cell Signaling Technology公司；Bax抗體1∶1000稀釋，購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體1∶5000稀釋，購自中國Proteintech公司。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料正態(tài)性檢驗采用 Shapiro-Wilk 檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胚胎脊髓組織中線粒體生物發(fā)生標志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM表達比較

2.1.1 各組大鼠胚胎脊髓組織中線粒體生物發(fā)生標志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM mRNA相對表達量比較 對照組大鼠胚胎脊髓組織中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM mRNA相對表達量分別為1.01 ± 0.13、1.01 ± 0.13、1.02 ± 0.24、1.03 ±0.25，致畸組大鼠胚胎脊髓組織中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM mRNA相對表達量分別為0.82 ±0.08、0.71 ± 0.08、0.86 ± 0.14、0.69 ± 0.17，其中致畸組SIRT1、TFEB、TFAM mRNA相對表達量均低于對照組（P均＜0.05）；RSV組大鼠胚胎脊髓組織中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM mRNA相對表達量分別為1.10 ± 0.21、1.90 ± 0.21、1.22 ± 0.37、2.36 ±0.30，相對表達量均高于致畸組（P均＜0.05）。

2.1.2 各組大鼠胚胎脊髓組織中線粒體生物發(fā)生標志物SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM蛋白相對表達量比較 對照組大鼠胚胎脊髓組織中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM蛋白相對表達量為1.00 ±0.18、1.00 ± 0.21、1.00 ± 0.12、1.00 ± 0.12，致畸組大鼠胚胎脊髓組織中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM蛋白相對表達量為0.62 ± 0.19、0.57 ± 0.24、0.65 ± 0.24、0.75 ± 0.13，兩組相比，P均＜0.05；RSV組大鼠胚胎脊髓組織中SIRT1、TFEB、PGC-1α、TFAM蛋白相對表達量為1.10 ± 0.12、1.04 ± 0.12、1.41 ± 0.13和1.14 ± 0.18，兩組相比，P均＜0.05。

2.2 各組大鼠胚胎脊髓組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax相對表達量比較 對照組大鼠胚胎脊髓組織中Bcl-2、Bax蛋白相對表達量為1.00 ± 0.14、0.99 ±0.19，致畸組大鼠胚胎脊髓組織中Bcl-2、Bax蛋白相對表達量為0.56 ± 0.03、1.50 ± 0.32，兩組相比P均＜0.05；RSV組大鼠胚胎脊髓組織中Bcl-2、Bax蛋白相對表達量為0.78 ± 0.18、1.13 ± 0.24，其中RSV組Bcl-2蛋白相對表達量高于致畸組（P＜0.05）。

3 討論

盡管在NTDs的機制和治療方面取得了進展，但目前的研究仍然有限。本研究提供了證據(jù)，在atRA誘導的大鼠NTDs模型中，RSV可上調(diào)線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白的表達，挽救凋亡相關(guān)蛋白的表達。這些結(jié)果強調(diào)了RSV通過靶向激活SIRT1，參與了NTDs中線粒體生物發(fā)生以及凋亡的調(diào)節(jié)。

RSV是一種天然的植物多酚，在植物中分布廣，含量較高。RSV是SIRT1的一種有效激活劑，在細胞的生物學功能中具有及其重要的的作用［13］。有報道［11-12］稱，RSV可預防糖尿病引起的胚胎畸形，減少胚胎發(fā)育不良。在神經(jīng)發(fā)育過程中，維持線粒體網(wǎng)絡(luò)的健康和功能至關(guān)重要［14］。我們先前的研究［15］表明，在atRA誘導的NTDs大鼠中，RSV處理增強了線粒體自噬，并在一定程度降低了NTDs發(fā)生率。線粒體是決定神經(jīng)干細胞命運的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細胞器，無論是在初始神經(jīng)發(fā)育還是在成年神經(jīng)發(fā)生中［16］。線粒體生物發(fā)生對于維持線粒體的生物能量功能非常重要。研究［6，17］表明，SIRT1可廣泛參與代謝控制和線粒體的生物發(fā)生，其通過靶向PGC-1α而成為線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。PGC-1α是線粒體生物發(fā)生和呼吸的主要調(diào)節(jié)因子，PGC-1α基因缺失小鼠的組織表現(xiàn)出線粒體基因表達減少、線粒體呼吸減少和線粒體功能受損［18］。已有研究［19-20］表明，在母體糖尿病誘導的胚胎NTDs模型中，PGC-1α的表達被抑制。PGC-1α通過上調(diào)TFAM以啟動線粒體DNA轉(zhuǎn)錄增加線粒體生物發(fā)生，維持細胞存活［21-22］。TFAM是一種被證明可以調(diào)節(jié)體內(nèi)線粒體DNA拷貝數(shù)的哺乳動物蛋白質(zhì)，TFAM和線粒體DNA之間的相互作用參與線粒體生物發(fā)生的調(diào)節(jié)［23］。

本研究中使用atRA造模，誘導NTDs大鼠胚胎模型。研究結(jié)果顯示，相比于對照組，atRA致畸組大鼠胚胎脊髓組織中SIRT1、TFEB、TFAM mRNA相對表達量顯著降低，以及SIRT1、TFEB、PGC-1α和TFAM的蛋白相對表達量均顯著降低。通過RSV給藥后，能顯著性升高atRA致畸組大鼠胚胎脊髓組織中SIRT1、PGC-1α、TFAM mRNA相對表達量以及蛋白相對表達量。此外，我們還發(fā)現(xiàn)給予RSV處理后，胚胎脊髓中TFEB mRNA相對表達量和蛋白相對表達量都顯著上調(diào)。TFEB屬于螺旋—環(huán)—螺旋亮氨酸拉鏈（bHLH-LZ）轉(zhuǎn)錄因子MiTF/TFE家族成員，已被證明是自噬和溶酶體生物發(fā)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。不僅如此，研究［24］發(fā)現(xiàn)TFEB對PGC-1α的表達也具有一定的影響。由此，RSV增強了TFEB和PGC-1α/TFAM通路，從而逆轉(zhuǎn)了atRA誘導的NTDs大鼠胚胎脊髓組織中線粒體生物發(fā)生功能障礙。

在NTDs中，神經(jīng)管閉合失敗與神經(jīng)上皮細胞過度凋亡有關(guān)，其中的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax參與調(diào)控線粒體途徑細胞凋亡并發(fā)揮重要作用［8］。研究［25］顯示，RSV可通過激活SIRT1發(fā)揮對抗細胞凋亡的有益特性。本研究中，我們觀察到相比于對照組，在atRA誘導的NTDs模型大鼠胚胎脊髓組織中，Bcl-2蛋白相對表達量顯著下調(diào)，Bax蛋白相對表達量顯著上調(diào)。通過RSV給藥后，相比于atRA致畸組，Bcl-2蛋白相對表達量顯著上調(diào)，說明RSV可一定程度減輕NTDs大鼠胚胎模型中脊髓組織的凋亡。

綜上所述，RSV能夠恢復atRA誘導NTDs大鼠胚胎線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白表達，逆轉(zhuǎn)NTDs中凋亡相關(guān)蛋白的表達。這些結(jié)果提示，作為一種天然的特異性SIRT1激活劑，RSV對NTDs動物模型具有一定保護作用。然而關(guān)于RSV生物利用度及母胎安全性的問題尚不明確，有待于進一步研究論證。