王慧娟，王二強(qiáng)，符真珠，李艷敏，王曉暉，袁 欣，高 杰，王利民，張和臣

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002；2.洛陽市農(nóng)林科學(xué)院，河南 洛陽 471023）

芍藥（Paonia lactifloraPall.）是我國(guó)的傳統(tǒng)名花，具有悠久的栽培歷史，近年來更成為切花市場(chǎng)的熱銷種類。目前芍藥切花市場(chǎng)幾乎被國(guó)外品種占據(jù)，我國(guó)芍藥新品種的培育則剛剛起步[1-2]。芍藥是一種典型的多年生地下芽植物，其位于地下的根莖是連通芍藥地上莖枝與地下肉質(zhì)塊根的“樞紐”[3]，是芍藥植株能夠自然更新、分株繁殖的前提和基礎(chǔ)，研究根莖的初始發(fā)生、發(fā)育及其更新具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。地下芽植物的儲(chǔ)藏器官通常位于地下，由根、葉、莖或下胚軸進(jìn)化而來，根據(jù)形態(tài)學(xué)分為鱗莖、球莖、塊莖、根莖和塊根[4]。植物激素在儲(chǔ)藏器官的形成和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。郁金香和百合的更新鱗莖中GA3/ABA 出現(xiàn)較高比值，表明內(nèi)源激素的平衡是更新鱗莖發(fā)生和發(fā)育的調(diào)節(jié)因子[5-6]；唐菖蒲、番紅花、香雪蘭等球莖花卉球莖發(fā)育進(jìn)程均與內(nèi)源激素ABA、GA3、IAA水平以及激素之間的動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)[7-9]；馬鈴薯、菊芋等塊莖的形成與GA3和ABA 關(guān)系最為密切，GA3抑制塊莖形成，ABA 具有促進(jìn)作用[10-12]；在多花黃精和滇重樓等根莖植物中也發(fā)現(xiàn)ABA 對(duì)新生根莖的形成和膨大具有促進(jìn)作用[13-14]；甘薯、地黃等塊根產(chǎn)量的形成和提高也是內(nèi)源激素協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，其中細(xì)胞分裂素類以及ABA、IAA、GA3等內(nèi)源激素的作用最為突出[15-16]。淀粉和蔗糖等碳水化合物是儲(chǔ)藏器官積累的主要物質(zhì)，例如馬鈴薯塊莖發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)是淀粉和蔗糖[17]；山葵根莖生長(zhǎng)旺盛期可溶性糖含量較高，淀粉一直保持上升趨勢(shì)[18]；百合芽到小球的轉(zhuǎn)變過程中淀粉是基本的碳水化合物[19]；蓮藕根莖的膨大是葡萄糖和淀粉的相對(duì)平衡導(dǎo)致的[20]。

關(guān)于芍藥根莖的研究目前只涉及根莖解剖結(jié)構(gòu)特征、根莖發(fā)育形態(tài)變化和更新規(guī)律以及根莖芽休眠越冬等方面[21-22]，對(duì)于芍藥根莖的初始形成及發(fā)育過程中內(nèi)源激素及碳水化合物的動(dòng)態(tài)變化則未見相關(guān)報(bào)道。鑒于此，以芍藥實(shí)生苗為試驗(yàn)材料，研究其根莖形成和膨大過程中ABA、赤霉素類、生長(zhǎng)素類、細(xì)胞分裂素類等內(nèi)源激素含量的動(dòng)態(tài)變化，并結(jié)合淀粉、可溶性糖等碳水化合物含量的變化，解析芍藥根莖形成和發(fā)育的生理機(jī)制，從而對(duì)芍藥種苗的培育、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)以及進(jìn)一步挖掘芍藥根莖形成和發(fā)育的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試芍藥品種為杭白芍。于2021 年8 月采集完全成熟的種子，常溫沙藏，待種子下胚軸長(zhǎng)度大于1 cm 時(shí)于4 ℃沙藏35 d，然后種植于人工氣候室。跟蹤根莖發(fā)育，根據(jù)形態(tài)分別選取定植后30、60、75、90 d 的時(shí)間節(jié)點(diǎn)截取根莖，混合取樣，每個(gè)時(shí)期設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

根莖直徑：每個(gè)時(shí)期隨機(jī)選取10 株實(shí)生苗，用游標(biāo)卡尺量取根莖部位的最大直徑，計(jì)算平均值。

激素含量：將芍藥根莖用液氮研磨成粉末，用于赤霉素類檢測(cè)的加入10 μL 100 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)混合工作液，用500 μL 乙腈/水（90∶10，體積比）溶液渦旋15 min 進(jìn)行提取，并在提取液中加入10 μL 三乙醇胺（TEA）和10 μL 3-溴丙基三甲基溴化銨（BPTAB），90 ℃反應(yīng)1 h 后，氮?dú)獯蹈?，然后?fù)溶、過濾；用于其他內(nèi)源激素檢測(cè)的加入100 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)混合溶液及1 mL 提取劑[V（甲醇）∶V（水）∶V（甲酸）=15∶4∶1]，混勻、離心，提取上清液，然后復(fù)溶、過濾。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）平臺(tái)，定量檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期ABA 以及赤霉素類、生長(zhǎng)素類、細(xì)胞分裂素類的含量。

碳水化合物含量：利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）平臺(tái)定量檢測(cè)樣品中葡萄糖、蔗糖、果糖等主要可溶性糖含量；采用蒽酮法測(cè)定淀粉含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel和SPSS軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)內(nèi)源激素含量數(shù)據(jù)進(jìn)行UV（Unit variance scaling）處理，使用R程序腳本繪制聚類熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育時(shí)期芍藥根莖形態(tài)和直徑的變化

根據(jù)形態(tài)將芍藥實(shí)生苗根莖的形成和發(fā)育劃分為4 個(gè)時(shí)期（圖1）：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（Ⅰ）、根莖轉(zhuǎn)換期（Ⅱ）、膨大期（Ⅲ）、膨大后期（Ⅳ）。從圖1 可以看出，隨著根莖的發(fā)育，根莖直徑呈逐漸上升的趨勢(shì)。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，上胚軸萌芽生長(zhǎng)，下胚軸形成根系，二者之間沒有明顯的根莖部位，上下胚軸結(jié)合部位的直徑只有2.46 mm（定植后30 d）；根莖轉(zhuǎn)換期，胚根上部開始膨大，地下根系和胚芽之間開始增粗，形成與根、莖形態(tài)明顯不同的根莖部位，直徑增加到2.84 mm（定植后60 d），較營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期增加15.45%；膨大期，根莖部位繼續(xù)發(fā)育增粗，較前期有明顯的膨大，根莖直徑3.04 mm（定植后75 d），其上根莖芽也開始形成和發(fā)育；膨大后期，根莖部位繼續(xù)膨大增粗，且根莖直徑增加速度較快，達(dá)到3.97 mm（定植后90 d），較膨大期增加30.59%，同時(shí)表皮顏色加深，根莖芽進(jìn)一步發(fā)育，芽體開始變得飽滿。

圖1 不同發(fā)育時(shí)期芍藥根莖形態(tài)的變化Fig.1 Changes of herbaceous peony rhizome morphology at different developmental stages

2.2 不同發(fā)育時(shí)期芍藥根莖內(nèi)源激素含量的變化

通過比較不同發(fā)育時(shí)期的差異激素（圖2）可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)育前期（Ⅰvs Ⅱ）差異激素最多，共有39 種差異激素，其中19 種上調(diào)，20 種下調(diào)；發(fā)育中期（Ⅱvs Ⅲ）也有35 種激素被顯著調(diào)節(jié)，19 種上調(diào)，16種下調(diào)；發(fā)育后期（Ⅲvs Ⅳ）差異激素顯著減少，只有21 種，且大部分顯著下調(diào)，只有4 種激素上調(diào)；總體來看，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（Ⅰ）和膨大后期（Ⅳ）相比共有36種激素被調(diào)節(jié)，其中23種上調(diào)，13種下調(diào)。

圖2 不同發(fā)育時(shí)期芍藥根莖內(nèi)源激素差異韋恩圖Fig.2 The venn diagram of endogenous hormone differences in herbaceous peony rhizome at different developmental stages

結(jié)合圖3 和圖4 對(duì)不同發(fā)育時(shí)期激素含量進(jìn)行分析，可以看出，不同發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)不同的激素分布。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，細(xì)胞分裂素類表達(dá)量較高的主要是一些活性不高的物質(zhì)，活性較高的反式玉米素（tZ）、N6-異戊烯腺嘌呤（IP）等細(xì)胞分裂素含量極低；生長(zhǎng)素類主要為色胺（TRA）、吲哚乙酸-天冬氨酸（IAA-Asp）等合成生長(zhǎng)素的前體物質(zhì)，活性形態(tài)的生長(zhǎng)素類如IAA和IBA表達(dá)量極低，只有2.95 ng/g和0.22 ng/g；另 外 表 達(dá) 量 較 高 的GA8、GA19、GA24、GA53等均不屬于赤霉素類的活性形式。因此，說明這個(gè)時(shí)期芍藥實(shí)生苗根莖部位仍然是以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主，還未向膨大階段轉(zhuǎn)換。根莖轉(zhuǎn)換期，占據(jù)主導(dǎo)地位的內(nèi)源激素種類是活性游離的ABA 以及GA1、GA7、GA4、GA3等活性較高的赤霉素類，其中ABA 和GA3含量急劇增加，達(dá)到峰值，分別為94.96、541.53 ng/g，同時(shí)細(xì)胞分裂素類中活性較高的玉米素核苷（tZR）和tZ 表達(dá)量也達(dá)到最高，分別為1.33 ng/g 和0.28 ng/g，說明此時(shí)根莖部位在ABA和GA3的共同調(diào)控下，開始由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向增粗膨大轉(zhuǎn)變，細(xì)胞分裂開始變得比較旺盛。根莖發(fā)育后期，表達(dá)量較高的激素種類以生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類為主。根莖膨大期，ABA 和GA3表達(dá)量顯著降低，其中ABA 降到52.07 ng/g，GA3更是急劇降低到11.84 ng/g，與此同時(shí)主要的生長(zhǎng)素類如IAA（11.75 ng/g）、IBA（1.11 ng/g），活性較高的細(xì)胞分裂素類如tZ（0.28 ng/g）和IP（0.15 ng/g）及順式玉米素（cZ，0.38 ng/g）則呈現(xiàn)較高的表達(dá)趨勢(shì)，表明在前期激素調(diào)控的基礎(chǔ)上，根莖部位處于穩(wěn)定的膨大狀態(tài)，并且這個(gè)時(shí)期根莖芽開始形成并發(fā)育，細(xì)胞分裂及生長(zhǎng)比較旺盛，生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類物質(zhì)對(duì)于根莖的膨大發(fā)育具有積極作用。膨大后期，個(gè)別活性較高的生長(zhǎng)素類物質(zhì)如IAA、細(xì)胞分裂素類物質(zhì)如6-芐氨基嘌呤（BAP）有一定的表達(dá)量，維持根莖部位的繼續(xù)增粗和膨大，其余表達(dá)量較高的激素均不具備較高的活性，大多數(shù)激素的表達(dá)量降至低位。

圖3 不同發(fā)育時(shí)期芍藥根莖內(nèi)源激素差異熱圖Fig.3 The clustering thermogram of endogenous hormone differences in herbaceous peony rhizome at different developmental stages

圖4 不同發(fā)育時(shí)期芍藥根莖主要內(nèi)源激素含量的變化Fig.4 Changes of main endogenous hormones contents in herbaceous peony rhizome at different developmental stages

2.3 不同發(fā)育時(shí)期芍藥根莖碳水化合物含量的變化及其與直徑的相關(guān)性

淀粉和糖類是植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累的主要形式。從圖5可以看出，隨著根莖的形成和膨大，葡萄糖和果糖等還原性糖在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期含量最高，隨后呈逐漸下降的趨勢(shì)，尤其是在根莖轉(zhuǎn)換期急劇下降，下降幅度分別達(dá)到48.91%和93.25%，隨后一直處于較低水平。蔗糖含量呈逐漸上升的趨勢(shì)，前期增長(zhǎng)緩慢，從根莖轉(zhuǎn)換期到膨大期顯著增加，在膨大期達(dá)到峰值（76.64 mg/g），在根莖形態(tài)上體現(xiàn)為根莖部位明顯膨大。與此同時(shí)，淀粉含量總體呈現(xiàn)波動(dòng)上升趨勢(shì)，根莖轉(zhuǎn)換期顯著增加，從107.9 mg/g 增加到199.05 mg/g，增加幅度達(dá)到84.48%，隨后一直保持較高水平，在膨大后期達(dá)到峰值（217.70 mg/g），顯著高于前3個(gè)時(shí)期。

圖5 不同發(fā)育時(shí)期芍藥根莖淀粉和部分糖類含量的變化Fig.5 Changes of starch and some sugars in herbaceous peony rhizome at different development stages

對(duì)芍藥根莖直徑與糖、淀粉含量的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，葡萄糖、果糖等還原性糖含量隨著根莖直徑的增加逐漸降低，相關(guān)系數(shù)分別為-0.819 0和-0.668 8，呈顯著負(fù)相關(guān)；蔗糖和淀粉含量隨根莖直徑的增加而逐漸上升，相關(guān)系數(shù)分別為0.780 1和0.802 9，呈顯著正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

芍藥是典型的根莖類多年生草本植物。播種繁殖是芍藥雜交育種的重要環(huán)節(jié)，芍藥種子具有上下胚軸雙重休眠的特性[23]，雜交種子播種后，下胚軸首先突破種皮形成胚根，經(jīng)過低溫環(huán)境后，上胚軸發(fā)育形成胚芽。在實(shí)生苗發(fā)育的過程中，上下胚軸結(jié)合的地下部位逐漸增粗發(fā)育，形成根莖，并在其上著生地下芽，因此，根莖部位對(duì)于芍藥實(shí)生苗是植株更新發(fā)育的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，加快芍藥實(shí)生苗根莖生長(zhǎng)及根莖芽的初始形成和發(fā)育是提高芍藥播種繁殖效率的重要途徑。本研究以芍藥實(shí)生苗為材料，研究了根莖形成和發(fā)育過程中主要內(nèi)源激素及碳水化合物的變化。

一般來說植物儲(chǔ)藏器官的形成和發(fā)育都是在各種激素的相互作用下完成的，并且每類激素所起的作用不同。ABA 和GA3是植物體內(nèi)2 種經(jīng)典的激素，二者在種子休眠與萌發(fā)、根的發(fā)育及開花等方面都表現(xiàn)出拮抗的生物學(xué)效應(yīng)[24]，但是GA3并不總是作為ABA 的拮抗激素發(fā)揮作用，例如在唐菖蒲、百合休眠解除早期GA3抑制休眠解除，與ABA 作用相似[25-26]，本研究中芍藥實(shí)生苗在根莖轉(zhuǎn)換期（Ⅱ）ABA和GA3同時(shí)達(dá)到峰值，隨后同步呈下降趨勢(shì)，說明二者在根莖由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到根莖膨大形成的轉(zhuǎn)換階段共同起到了決定性的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞分裂素類和生長(zhǎng)素類對(duì)儲(chǔ)藏器官的發(fā)育起重要作用，細(xì)胞分裂素類通過促進(jìn)細(xì)胞分裂影響根莖的生長(zhǎng)和膨大，生長(zhǎng)素類通過調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育來促進(jìn)器官的發(fā)育，二者在芍藥根莖轉(zhuǎn)換期和膨大期表達(dá)量較高，也是芍藥根莖膨大發(fā)育的重要激素，這與茭白嫩莖膨大期間細(xì)胞分裂素含量顯著上升，蓮藕根莖膨大與IAA含量呈正相關(guān)的研究結(jié)論相符[27-28]。

碳水化合物是根莖形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中蔗糖和淀粉在高等植物中充當(dāng)主要的儲(chǔ)藏化合物，在庫器官中積累（例如種子、球莖、根和芽），馬鈴薯和百合轉(zhuǎn)錄組分析表明，蔗糖和淀粉代謝參與塊莖轉(zhuǎn)化和芽到小球的轉(zhuǎn)變[29-30]。芍藥根莖在形成發(fā)育過程中葡萄糖和果糖等還原性糖含量顯著下降，被消耗或轉(zhuǎn)化，淀粉和蔗糖含量整體呈上升趨勢(shì)，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存儲(chǔ)的最終形式，對(duì)于根莖的膨大發(fā)育十分重要，這與山藥塊莖發(fā)育過程中蔗糖和淀粉含量逐漸增加的結(jié)果基本一致[31]。

綜合上述，芍藥實(shí)生苗根莖形成和發(fā)育的不同階段內(nèi)源激素及碳水化合物呈現(xiàn)不同的分布，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期各類激素處于前期積累階段，根莖轉(zhuǎn)換期ABA 和GA3含量達(dá)到峰值，決定了芍藥根莖部位由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向根莖形成轉(zhuǎn)換，生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類則對(duì)根莖的膨大發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用，淀粉和蔗糖作為儲(chǔ)藏器官積累的主要碳水化合物，在根莖的形成和膨大過程中呈逐步增加的趨勢(shì)。因此，是否可以通過外施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來調(diào)節(jié)芍藥實(shí)生苗根莖的形成和發(fā)育還有待于進(jìn)一步研究。