陳 瑞,楊德強(qiáng),趙長(zhǎng)林

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院,昆明 650224;2.云南國(guó)誠(chéng)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,云南 昭通 657000)

【研究意義】天麻(GastrodiaelataBlume)又名定風(fēng)草,為蘭科天麻屬多年生共生草本植物。天麻主產(chǎn)于中國(guó)陜西、四川、云南、貴州、湖南、湖北等省份,其中云南省彝良縣、永善縣等地為公認(rèn)的道地藥材天麻產(chǎn)區(qū)[1-3]。天麻有鎮(zhèn)靜、抗衰老的作用,臨床醫(yī)學(xué)上主治肝陽(yáng)上亢所致的頭痛眩暈、驚厥抽搐等癥[3]。天麻被廣泛用于藥食領(lǐng)域,其塊莖中獨(dú)有的天麻素、香莢蘭醇、酚性化合物等化學(xué)成分具有鎮(zhèn)痛、抗抑郁、抗衰老、增強(qiáng)細(xì)胞免疫力等作用[4-6]。然而,天麻栽培一直受連作障礙的困擾,其機(jī)理與藥用植物連作障礙相似,連作產(chǎn)生的化感自毒物質(zhì)引起土壤微生態(tài)的變化是天麻發(fā)生連作障礙的重要原因[7-9]。藥用植物栽培中的連作障礙問(wèn)題嚴(yán)重影響了中藥材的規(guī)范化種植,隨著天麻栽培面積的不斷擴(kuò)大及中藥材規(guī)范化種植的推行,連作障礙已成為限制天麻高產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)的重要因素[8-14],因此研究消除或減輕天麻連作障礙的方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái),中國(guó)農(nóng)作物與藥用植物連作障礙問(wèn)題備受關(guān)注,其中土壤微生物在連作障礙問(wèn)題中扮演重要角色,更多學(xué)者致力于植物種植土壤微生態(tài)研究,當(dāng)土壤中營(yíng)養(yǎng)成分、微生物組成結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致土壤中病原菌的大量繁殖,有益微生物的生長(zhǎng)受到抑制,植株將無(wú)法正常生長(zhǎng)發(fā)育[13-16]。土壤中微生物生存數(shù)量巨大、種類(lèi)繁多,是土壤生態(tài)系統(tǒng)的組成部分,亦存在緩解作物連作障礙及其他土壤障礙因子的重要因素,如重茬大豆土壤中病原真菌鐮刀菌是導(dǎo)致大豆生長(zhǎng)發(fā)育障礙的主要原因之一,而木霉菌可用作拮抗菌研究[11,17-18]。土壤中微生物的種類(lèi)和數(shù)量受土壤類(lèi)型、季節(jié)變化、土層厚度等因素影響,大量研究結(jié)果表明植株發(fā)病率或發(fā)病指數(shù)與土壤中病原微生物數(shù)量呈正比,在農(nóng)作物重茬種植土壤中,主要病原菌增多[15,18-20]。高通量測(cè)序技術(shù)在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究、土壤微生物多樣性研究及土壤生態(tài)功能研究方面有較大的影響,土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性對(duì)植物根際生態(tài)系統(tǒng)的平衡起著重要作用[21]。崔紀(jì)超等[22]基于高通量測(cè)序技術(shù)分析苧麻根際土壤真菌物種多樣性;勞承英等[23]基于高通量測(cè)序技術(shù)分析黃連病株和健株根際土壤真菌,揭示黃連根際土壤真菌組成關(guān)系;蔣靖怡等[24]基于高通量測(cè)序分析紫花丹參、白花丹參根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與差異物種組成?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)天麻連作障礙研究較少,因此,本研究從天麻種植土壤微生物變化著手,采集天麻種植前后及方竹修復(fù)后的土樣進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于高通量測(cè)序方法揭示天麻種植土壤真菌的群落結(jié)構(gòu),為明晰天麻連作障礙產(chǎn)生的原因及開(kāi)發(fā)解除或減輕天麻連作障礙的生物菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)地點(diǎn)位于云南省彝良縣蕎山鎮(zhèn)(104°16′14′′ E,27°39′33′′ N),為昭通地區(qū)天麻主產(chǎn)地,該鎮(zhèn)平均海拔1650 m,年均氣溫11 ℃,年均降水量860 mm,土壤呈酸性或微酸性,富含腐殖質(zhì),氣候和土壤條件皆適宜天麻生長(zhǎng)[9]。本研究分別于2020年、2021年分批次采樣,每年10月收獲商品麻時(shí)進(jìn)行采樣。分別在種植天麻前和收獲天麻后采集菌塘土壤,樣本以“Z”形狀采集,用取樣鏟將天麻及菌材全部挖出,去除土塊與雜物,使用康寧離心管(50 mL)進(jìn)行分裝,樣本低溫保藏帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃冰箱中保存。采樣區(qū)域?yàn)樘炻樵纪?、天麻一年土和方竹修?fù)土[9],每種土樣設(shè)置3個(gè)重復(fù)(表1)。

表1 采集土壤樣品編號(hào)及分組Table 1 Soil sample number and assigned group

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 使用TGrinder H24組織研磨均質(zhì)儀 (OSE-TH-01,6 m/s的速度振蕩30 s,間隔30 s,共2個(gè)循環(huán))將樣本與緩沖液充分混勻,用特定的DNA提取試劑盒 (Magnetic Soil And Stool DNA Kit)提取樣本的總基因組,用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)、純化和定量 采用通用引物ITS1-1F-F和ITS1-1F-R對(duì)樣本真菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16],具體擴(kuò)增區(qū)域如表2所示。

表2 PCR擴(kuò)增引物信息Table 2 Primer information amplified by PCR

1.2.3 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 首先使用 Trimmomatic v0.33軟件對(duì)測(cè)序得到的 Raw reads進(jìn)行過(guò)濾[25];然后使用cutadapt 1.9.1軟件進(jìn)行引物序列的識(shí)別與去除,得到不包含引物序列的Clean reads;使用 Usearch v10軟件,通過(guò)overlap對(duì)每個(gè)樣品的Clean reads 進(jìn)行拼接[26],然后根據(jù)不同區(qū)域的長(zhǎng)度范圍對(duì)拼接后數(shù)據(jù)進(jìn)行長(zhǎng)度過(guò)濾[27];使用 QIIME2 2020.6軟件中的dada2方法進(jìn)行去噪并去除嵌合體序列[28],得到最終有效數(shù)據(jù)(Non-chimeric reads),用于后續(xù)的ASVs (Amplicon sequence variants)劃分、多樣性分析以及差異分析[29-33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土樣真菌OTU組成與分析

通過(guò)去噪得到的各個(gè)樣本真菌ASV,由圖1可知,一麻壤樣本Zhaochangl 017真菌ASV最大,為312,原壤樣本Zhaochangl 019真菌ASV最小,為132,樣本的真菌總ASV為720。

圖1 各樣本ASVFig.1 ASV number of each sample

將豐度小于0.001的ASV過(guò)濾后,比較3組樣本真菌ASV (圖2),3組樣本共含真菌ASV 49個(gè),基于3組特有真菌ASV分析結(jié)果顯示,一麻壤charlle002特有真菌數(shù)量最多,達(dá)28個(gè);其次是方壤charlle006,有20個(gè),二者均高于原壤charlle001特有真菌數(shù)量。上述研究結(jié)果表明:一麻壤中特有真菌數(shù)目明顯高于原壤,且方壤特有真菌數(shù)量高于原壤低于一麻壤;經(jīng)天麻種植后,一麻壤真菌ASV明顯上升,然而一麻壤經(jīng)種植方竹后,方壤真菌ASV數(shù)量高于原壤,但低于一麻壤。

圖2 3組樣本ASV花瓣圖Fig.2 ASV petal maps of three groups

3組樣本真菌系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)階元上相對(duì)豐度分析表明 (圖3),3組樣本真菌按門(mén)分為Ascomycota、Basidiomycota、Mortierellomycota;按綱分為Agaricomycetes、Eurotiomycetes、Leotiomycetes、Mortierellomy-cetes、Sordariomycetes和Tremellomycetes;按目分為Agaricales、Chaetothyriales、Filobasidiales、Helotiales、Hypocreales、Mortierellales、Polyporales、Sordariales和Xylariales;按科分為Bolbitiaceae、Ceratobasidiaceae、Clavicipitaceae、Herpotrichiellaceae、Hyaloscyphaceae、Hydnangiaceae、Hypocreaceae、Leotiaceae、Meruliaceae、Mortierellaceae、Sordariaceae、Strophsrisceae、Tricholomataceae和Xylariaceae;按屬分為Cadophora、Camarophyllopsis、Cladophialophora、Clavaria、Clavulinopsis、Conocybe、Deconica、Gorgomyces、Hyaloscypha、Laccaria、Metapochonia、Neurospora、Rosellinia、Scopuloides、Thanatephorus和Trichoderma。

圖3 樣本真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree of the sample fungi

由圖3中餅圖色塊和大小可知隸屬于Mortierellomycota的Mortierellomycetes、Mortierellales、Mortierellaceae和Mortierella真菌在charlle001 (原壤)中占比極高,隸屬于子囊菌門(mén) (Ascomycota)的Eurotiomycetes、Chaetothyriales和Sordariomycetes、Xylariales真菌在charlle002 (一麻壤)中占比極高,隸屬于擔(dān)子菌門(mén) (Basidiomycota)的Tremellomycetes在charlle006 (方壤)中占比極高?？扑较?Tricholomataceae、Sordariaceae在charlle001中豐度極大,在charlle002和charlle006中豐度極小;Bolbitiaceae、Xylariaceae在charlle002中豐度極大,在charlle001和charlle006中豐度極小;Hydnangiaceae、Meruliaceae在charlle006中豐度極大,在charlle001和charlle002中豐度極小。屬水平下:Camarophyllopsis、Clavaria、Deconica和Neurospora在charlle001中豐度極大;Conocybe、Metapochonia和Rosellinia在charlle002中豐度極大;Laccaria、Thanatephorus和Trichoderma在charlle006中豐度極大。

2.2 土樣真菌群落結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度

將豐度低的樣本合并為Others作單個(gè)樣本在科水平及種水平的樣本豐度 (圖4～5),分析結(jié)果表明,樣本豐度按科等級(jí),除未注釋到科的類(lèi)群外,樣本真菌主要隸屬于Clavicipitaceae、Xylariaceae、Leotiacene、Hydnangiaceae、Tricholomataceae、Ceratobasidiaceae、Hyaloscyphaceae、Herpotrichiellacene、Hypocreacene、Piskurezymaceae、Mortierellaceac、Clavariaceae和Helotiales fam Incertae sedis,其中每組土樣的優(yōu)勢(shì)菌科有所差異。注釋到種水平的真菌主要隸屬于Clavulinopsis、Hyaloscypha、Mortierella、Spirosphaera、Cadophora、Trichoderma、Rosellinia、Clitocybe和Solicoccozyma屬,各樣本中優(yōu)勢(shì)菌存在差異,原壤中Clitorybetrulliformis在Zhaochangl 021組占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位,一麻壤中Rosellinienecatrix、Spirospheeracaricigraminis和Solicoccozymaterricola分別在Zhaochangl 015、Zhaochangl 016和Zhaochangl 017 3個(gè)樣本中明顯占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位,Trichodermarifaii在方壤的Zhaochangl 032樣本中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

圖4 科水平單個(gè)樣本相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of a single sample(family)

圖5 種水平單個(gè)樣本相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of a single sample (species)

物種豐度與樣本相互關(guān)系圖通過(guò)Circos繪制[33],其篩選相對(duì)豐度大于1%的物種以family水平繪圖,揭示各分組樣本中不同物種所占的比例及物種在不同分組中的比例關(guān)系。由圖6可知,3組土樣優(yōu)勢(shì)菌組成較為相似,均以Agaricales、Cantharellales、Chaetothyriales、Filobasidiales、Helotiales、Hyporeales、Mortierellales、Pezizales、Polyporales、Sordariales、Trechisporales和Xylariales為優(yōu)勢(shì)菌,且各優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度存在差異。charlle001科水平相對(duì)豐度較大優(yōu)勢(shì)菌有8類(lèi),依次為Helotiales>Agaricales>Mortierellales>Sordariales>Chaetothyriales>Filobasidiales>Hyporeales>Pezizales;charlle002科水平相對(duì)豐度較大優(yōu)勢(shì)菌有11類(lèi),依次為Helotiales>Agaricales>Trechisporales>Chaetothyriales>Filobasidiales>Xylariales>Hyporeales>Mortierellales>Sordariales>Cantharellales>Pezizales;charlle006科水平相對(duì)豐度較大優(yōu)勢(shì)菌有9類(lèi),依次為Helotiales>Agaricales>Cantharellales>Hyporeales>Polporales>Sordariales>Chaetothyriales>Filobasidiales>Pezizales。Helotiales和Agaricales真菌豐度在3組土樣中占比都較大,在charlle001和charlle006內(nèi)Helotiales真菌豐度均為35%,charlle002為20%;Polyporales真菌為charlle006獨(dú)有,charlle002中真菌種類(lèi)明顯多于charlle001和charlle006,結(jié)合取樣點(diǎn)信息推斷一麻壤charlle002中真菌種類(lèi)變多,且其豐度也有所改變,分析其原因與種植過(guò)一年天麻有直接關(guān)系;一麻壤經(jīng)過(guò)種植方竹后,方壤charlle006比一麻壤charlle002真菌種類(lèi)減少,分析其原因可能種植方竹不利于天麻病原菌生存和生長(zhǎng)。

圖6 樣本與物種豐度circos圖 (科)Fig.6 Circos plots of samples and species abundance(family)

基于科水平Heatmap聚類(lèi)分析 (圖7),在熱圖聚類(lèi)結(jié)果中,顏色代表物種豐度;分析結(jié)果顯示,方壤中Hydnangiaceae、Meruliaceae、Rickenellaceae、Psathyrellaceae和Sebacinaceae 5個(gè)科類(lèi)群真菌在Zhaochangl 033樣本中占比極高,Cantharellales fam Incertae sedis、Ceratobasidiaceae、Helotiales fam Incertae sedis和Hypocreaceae 4個(gè)類(lèi)群在Zhaochangl 032樣本中占比極高。一麻壤charlle002組3個(gè)樣本Zhaochangl 015、Zhaochangl 016和Zhaochangl 017占比較高的類(lèi)群不同,分別為Zhaochangl 015:Xylariaceae和Ascobolaceae,Zhaochangl 016:Atheliaceae和Diaporthaceae Chactosphacriaceae;Zhaochangl 017:Bolbitiaceae、Pezizales fam Incertae sedis和Piskurozymaceae。原壤charlle001組Zhaochangl 019占比較高的類(lèi)群有Coniochaetaceae、fam Incertaesedis、Pyronemataceae和Sordariaceae Sordariales,Zhaochangl 020占比較高的類(lèi)群有Entolomataceae、Mortierellaceae、Strophariaceae和Tricholomataceae 4個(gè)類(lèi)群,Hyaloscyphaceae則在Zhaochangl 021中占比較高,上述結(jié)果表明不同土樣的組內(nèi)差異較大。

圖7 物種相對(duì)豐度聚類(lèi)熱圖 (科)Fig.7 Clustering heatmap of relative species abundance(family)

2.3 土樣真菌群落多樣性分析

樣本Alpha多樣性指數(shù)采用Qiime2[25]軟件進(jìn)行評(píng)估。

由表3可知,不同處理土壤真菌多樣性指數(shù)覆蓋率分別在99%以上,說(shuō)明土壤樣本測(cè)序數(shù)據(jù)足夠真實(shí),可反映其真菌群落的多樣性。Observed species結(jié)果顯示原壤charlle001物種數(shù)最少,僅166個(gè),一麻壤charlle002中樣本物種數(shù)最多,分析真菌群落多樣性Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)發(fā)現(xiàn),原壤charlle001和一麻壤charlle002樣本真菌多樣性較高,方壤charlle003多樣性指數(shù)最低,該結(jié)果表明方竹輪作修復(fù)后,土壤真菌多樣性降低。Chao1指數(shù)和Ace1指數(shù)在一麻壤charlle002中表現(xiàn)最高,原壤charlle001中表現(xiàn)最低,該結(jié)果表明天麻種植后真菌物種豐富度會(huì)增加,方竹輪作后會(huì)降低土壤真菌物種豐富度但仍高于原壤。

表3 樣本真菌 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of the fungal Alpha diversity index of the samples

運(yùn)用R語(yǔ)言ggplot2包繪制PCA散點(diǎn)圖(圖8),PCA分析結(jié)果表明,原壤charlle001、一麻壤charlle002和方壤charlle003此3組樣本組內(nèi)土壤真菌差異較小,而組間土壤真菌差異較大。

圖8 樣本PCA散點(diǎn)圖Fig.8 PCA scatter plot of samples

由圖9可知,Ascomycota、Basidiomycota和Mortierellomycota 3門(mén)真菌豐度較大,為所有樣本中的主要優(yōu)勢(shì)菌,其中Ascomycota真菌豐度普遍最大。原壤3個(gè)樣本Zhaochangl 019、Zhaochangl 020、Zhaochangl 021中Mortierellomycota門(mén)真菌豐度明顯高于一麻壤內(nèi)3個(gè)樣本,推測(cè)Mortierellomycota真菌可能是天麻種植土壤中的有益真菌。原壤、一麻壤、方壤各樣本均分別聚為一支,表明各組樣本真菌的組成與豐度較相似;方壤2個(gè)樣本聚一支,其樣本中Ascomycota真菌豐度最大。

圖9 UPGMA樣本聚類(lèi)樹(shù)分析 (門(mén))Fig.9 Clustering tree analysis of UPGMA sample(phylum)

2.4 樣本真菌差異分析

基于屬水平組間Welch’st-test檢驗(yàn),原壤(charlle001)、一麻壤(charlle002)、方壤(charlle006)3組樣本兩兩比較做組間物種差異分析圖(圖10～15,圖中左邊為組間差異物種豐度展示,右邊為組間差異置信度展示)。由圖10可知,原壤(charlle001)和一麻壤(charlle002)組間真菌Camarophyllopsis和Conocybe相對(duì)豐度差異顯著,Camarophyllopsis內(nèi)真菌在charlle001中豐度更高,而Conocybe內(nèi)真菌在charlle002中豐度更高。

圖10 樣本微生物群落差異比較charlle001 vs charlle002 (屬)Fig.10 Comparison of microbial community differences between charlle001 and charlle002 (genus)

由圖11可知,原壤(charlle001)和方壤(charlle006)差異物種分析表明,Camarophyllopsis內(nèi)真菌組間相對(duì)豐度差異顯著,在charlle001中豐度極高,兩組樣本均有Trimmatostroma。

圖11 樣本微生物群落差異比較charlle001 vs charlle006 (屬)Fig.11 Comparison of microbial community differences between charlle001 and charlle006 (genus)

由圖12可知,一麻壤charlle002和方壤charlle006組間物種差異分析揭示,Byssonectria和Solicoccozyma內(nèi)真菌相對(duì)豐度差異顯著,Byssonectria在charlle006中豐度更高,而Solicoccozyma在charlle002中豐度更高。

圖12 樣本微生物群落差異比較charlle006 vs charlle002 (屬)Fig.12 Comparison of microbial community differences between charlle006 and charlle002(genus)

基于種水平組間Welch’st-test檢驗(yàn),原壤(charlle001)、一麻壤(charlle002)、方壤(charlle006)3組樣本兩兩比較作組間物種差異分析圖。一麻壤(charlle002)和方壤(charlle006)組間物種差異分析揭示 (圖13),在一麻壤和方壤中均表現(xiàn)為Solicoccozyma>Byssonectria,但Byssonectria和Solicoccozyma在一麻壤和方壤中相對(duì)豐度存在顯著差異,Byssonectria表現(xiàn)為charlle006>charlle002,Solicoccozyma表現(xiàn)為charlle002>charlle006。

圖13 樣本微生物群落差異比較charlle006 vs charlle002 (種)Fig.13 Comparison of microbial community differences between charlle006 and charlle002 (species)

由圖14可知,原壤(charlle001)和一麻壤(charlle002)組間被孢霉屬真菌相對(duì)豐度存在差異,Mortierellaalpina和M.simplex兩組樣本中相對(duì)豐度均表現(xiàn)為charlle001>charlle002,且土壤中高山被孢霉M.alpina相對(duì)豐度高于M.simplex。

圖14 樣本微生物群落差異比較charlle001 vs charlle002 (種)Fig.14 Comparison of microbial community differences between charlle001 and charlle002(species)

由圖15可知,原壤(charlle001)和方壤(char lle006)差異物種分析表明,Mortierella和Penicillium相對(duì)豐度差異顯著,且高山被孢霉M.alpina和M.simplex在charlle001中豐度極高,顯著高于charlle006,而Penicilliumlineatum相對(duì)豐度較其他2種真菌低,在原壤和方壤中表現(xiàn)為charlle006>charlle001。

圖15 樣本微生物群落差異比較charlle001 vs charlle006 (種)Fig.15 Comparison of microbial community differences between charlle001 and charlle006 (species)

3 討 論

連作障礙在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的無(wú)形障礙,研究表明農(nóng)作物連作障礙會(huì)提升致病真菌數(shù)量和使真菌群落發(fā)生顯著增加,如豌豆[34]、大蒜[35]、大豆[36]、黃瓜[37-38]、燕麥[39]、馬鈴薯[40]等;藥用植物連作障礙導(dǎo)致真菌數(shù)量顯著增加,如人參[41]、西洋參[42]、太子參[43]、丹參[44]、半夏[45-46]、三七[47-48]、白術(shù)[49]、地黃[50-52]等,因此搞清天麻種植土壤微生物變化,是破除天麻連作障礙基礎(chǔ)且必要的前提工作,本研究旨在揭示天麻種植土壤真菌群落組成結(jié)構(gòu),天麻種植前后土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化及種完天麻種方竹后土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化,為研究天麻根際土壤微生態(tài)提供理論依據(jù)并為解決天麻連作障礙提供技術(shù)支持。李自博[41]基于高通量測(cè)序技術(shù)研究人參根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性,人參根際真菌群落以子囊菌門(mén) (Ascomycota),接合菌門(mén) (Zygomycota)和擔(dān)子菌門(mén) (Basidiomycota)為主要群體,在人參連作土壤中,病原真菌顯著增加,被孢霉屬M(fèi)ortierellasp.和鐮刀菌Fusariumsp.成為優(yōu)勢(shì)真菌。太子參連作土壤微生物研究結(jié)果顯示連作土壤中有益細(xì)菌數(shù)量減少,真菌數(shù)量增多,其中具有致病作用或?qū)儆诓≡w的真菌種 (屬)隨太子參連作年限增加而增加[43]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)揭示3種類(lèi)型天麻土壤 (原壤、一麻壤、方壤)真菌在種群組成、數(shù)量和分布上存在差異,一麻壤中真菌種類(lèi)、數(shù)量明顯多于原壤和方壤,即種過(guò)一茬天麻后土壤中真菌數(shù)量增多。孫雪婷等[47]基于前人研究探討三七連作障礙研究進(jìn)展,證明三七連作障礙產(chǎn)生的原因并非單一,主要與根際土壤微生物群落變化有關(guān),此外還與土傳病蟲(chóng)害的增加、化感物質(zhì)的積累和三七本身的自毒物質(zhì)有關(guān),本研究主要聚焦天麻不同種植土壤的真菌群落結(jié)構(gòu),種過(guò)一年天麻后土壤中病原菌增多,再種植方竹呈現(xiàn)修復(fù)作用,但具體修復(fù)機(jī)制還有待后續(xù)深入研究。柏秋月[53]基于高通量測(cè)序技術(shù)研究病害天麻內(nèi)生真菌群落變化,病株天麻的真菌OTU數(shù)量增多,主要為子囊菌門(mén) (Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén) (Basidiomycota)類(lèi)群,病株天麻內(nèi)致病真菌增加,而本研究通過(guò)開(kāi)展天麻種植前后土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化,表明3組土樣中真菌主要類(lèi)群為Ascomycota、Basidiomycota和Mortierellomycota 3門(mén)真菌,其中Ascomycota真菌豐度普遍最大,一麻壤、方竹壤和原壤3組樣本特有真菌OUT依次降低。大量中草藥連作土壤微生物研究顯示,病原菌增殖是導(dǎo)致作物連作障礙的主要元兇[41-52]。本研究中3組樣本真菌在門(mén)、綱、目分類(lèi)水平下相對(duì)豐度差異較小,在科、屬分類(lèi)水平下相對(duì)豐度差異較大,屬分類(lèi)水平下天麻種植土壤原壤中優(yōu)勢(shì)菌屬為Clitocybe、Solicoccozyma和Spirosphaera,一麻壤中優(yōu)勢(shì)菌屬為Clavulinopsis和Rosellinia,方壤中優(yōu)勢(shì)菌屬為T(mén)richoderma;前人研究表明部分Rosellinia真菌易引起植物病害[54-55],而Trichoderma多用于生防菌株篩選,可有效抑制病原真菌的增殖[56],故推測(cè)種植天麻后種方竹有改善土壤病原菌增多的作用。

4 結(jié) 論

天麻土壤樣品中優(yōu)勢(shì)真菌主要是子囊菌門(mén) (Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén) (Basidiomycota)和被孢霉門(mén) (Mortierellomycota)3門(mén)真菌。對(duì)比3組樣本特有真菌OTU從大到小排序?yàn)橐宦槿?方竹壤>原壤。各組樣本中優(yōu)勢(shì)真菌存在差異,原壤中主要優(yōu)勢(shì)菌為Clitocybesp.、Solicoccozymasp.和Spirosphaerasp.,一麻壤中主要優(yōu)勢(shì)菌為Clavulinopsissp.和Roselliniasp.,方壤中主要優(yōu)勢(shì)菌為T(mén)richodermasp.。種植天麻后的土壤與原壤相比病原真菌成為優(yōu)勢(shì)菌,且真菌種類(lèi)及OTUs顯著高于原壤。