薛俊杰, 孫 慧

(武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,過(guò)敏及免疫相關(guān)疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

糖是重要的生物大分子,其除了與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)等分子復(fù)合構(gòu)成生物結(jié)構(gòu)組分、充當(dāng)細(xì)胞能源物質(zhì)外,還作為蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。蛋白質(zhì)的糖基化修飾是真核細(xì)胞中最為豐富和多樣化的翻譯后修飾,參與影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化[1-4]。根據(jù)糖與蛋白質(zhì)連接方式的不同主要可以分為N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化修飾多發(fā)生在分泌蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的天冬酰胺(Asn,N)殘基上,而O-糖基化修飾通過(guò)絲氨酸(Ser,S)、蘇氨酸(Thr,T)或酪氨酸(Tyr,Y)殘基的羥基末端與糖鏈共價(jià)連接[1]。O連接的α-N-乙酰半乳糖胺(O-linkedα-N-acetylgalactosamine,O-GalNAc)糖基化修飾(O-GalNAcylation)與O連接的β-N-乙酰葡糖胺(O-linkedβ-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)糖基化修飾(O-GlcNAcylation)是2種常見(jiàn)的O-糖基化修飾,二者都因在癌癥、自身免疫失調(diào)等疾病中高度上調(diào)而受到關(guān)注[5-6]。其中,O-GalNAc糖基化修飾廣泛分布在黏蛋白質(zhì)上(故也被稱為黏蛋白型O-糖基化修飾),并被延伸成更為復(fù)雜的糖鏈。與此不同的是,O-GlcNAc糖基化修飾發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)上,靶蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸殘基上僅連接1個(gè)GlcNAc單元后便不再延伸。由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且修飾動(dòng)態(tài)可逆,O-GlcNAc糖基化修飾可以快速響應(yīng)外界信號(hào),靈活地調(diào)控細(xì)胞內(nèi)諸多信號(hào)通路[7]。這與磷酸化修飾類似,因此,2種修飾在靶蛋白質(zhì)同一修飾位點(diǎn)上通常存在潛在的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,二者的相互作用對(duì)于細(xì)胞信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控具有重要意義[8, 9]。值得注意的是,O-GlcNAc糖基化修飾在真核細(xì)胞內(nèi)分布廣泛,大約有數(shù)千乃至上萬(wàn)種蛋白質(zhì)上存在該修飾,包括轉(zhuǎn)錄因子、激酶和磷酸酶等[7]。由于O-GlcNAc糖基化修飾深度參與了細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)代謝和機(jī)體免疫反應(yīng)等諸多基礎(chǔ)性的生理過(guò)程,細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化修飾水平的異常變化通常與癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等[10-13]病理狀態(tài)密切關(guān)聯(lián)。

免疫系統(tǒng)是維護(hù)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、對(duì)抗感染和疾病的重要組成部分。越來(lái)越多的證據(jù)表明,O-GlcNAc糖基化修飾水平的紊亂會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失調(diào),免疫細(xì)胞的生理功能普遍受到該修飾的調(diào)控。本文為此綜述了O-GlcNAc糖基化修飾在免疫系統(tǒng)以及相關(guān)疾病中的調(diào)控作用,重點(diǎn)介紹O-GlcNAc糖基化修飾影響巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、分化以及功能發(fā)揮的分子機(jī)制,以期更為系統(tǒng)且深入地理解O-GlcNAc糖基化修飾對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。

1 O-GlcNAc糖基化修飾的動(dòng)態(tài)調(diào)控

O-GlcNAc糖基化修飾水平的穩(wěn)態(tài)對(duì)于細(xì)胞維持正常的生理功能至關(guān)重要。這種平衡的維持受到葡萄糖代謝、可變剪切、酶的協(xié)調(diào)表達(dá)、底物識(shí)別等多種方式調(diào)控。

不同于蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化由多種激酶和磷酸酶參與,胞內(nèi)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾的添加和去除分別由O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和O-GlcNAc糖苷酶(O-GlcNAcase,OGA)2個(gè)酶完成[14]。這對(duì)酶在從線蟲(chóng)到人類等高等真核生物中高度保守,OGT的基因敲除和OGA功能喪失在小鼠中均會(huì)產(chǎn)生胚胎致死性表型[15, 16]。OGT通過(guò)催化底物尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)與靶蛋白質(zhì)特定絲氨酸/蘇氨酸上的羥基發(fā)生酰胺結(jié)合而實(shí)現(xiàn)O-GlcNAc糖基化修飾。UDP-GlcNAc是己糖胺生物合成途徑(hexosamine biosynthesis pathway,HBP)的終產(chǎn)物,其含量與葡萄糖代謝水平相關(guān)聯(lián),進(jìn)入細(xì)胞的葡萄糖大約有2%-5%會(huì)通過(guò)HBP途徑代謝[17]。高糖條件下,細(xì)胞內(nèi)UDP-GlcNAc含量上升,對(duì)應(yīng)于高水平的O-GlcNAc糖基化修飾[18]。因此,細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化修飾水平受環(huán)境營(yíng)養(yǎng)水平影響較大,可以作為細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的感受器。此外,O-GlcNAc糖基化修飾可與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex1,mTORC1)的葡萄糖感知和激活機(jī)制偶聯(lián),復(fù)合物的Raptor蛋白亞基上T700位點(diǎn)的O-GlcNAc糖基化修飾促使mTORC1向溶酶體募集,從而激活mTORC1介導(dǎo)的細(xì)胞代謝通路,促進(jìn)細(xì)胞增殖[19]。

除了受葡萄糖代謝影響外,細(xì)胞通過(guò)多條途徑協(xié)調(diào)OGT與OGA的表達(dá)和活性,維持細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化修飾水平。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞采用內(nèi)含子保留的剪接方式?jīng)Q定是否產(chǎn)生功能性的轉(zhuǎn)錄本,進(jìn)而從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控OGT與OGA的相對(duì)表達(dá)量,以應(yīng)對(duì)O-GlcNAc糖基化修飾水平的急劇變化[20]。也有研究指出,在肺癌細(xì)胞中,OGA的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,而OGT的表達(dá)調(diào)控主要受翻譯控制[21]。目前,我們對(duì)于OGT識(shí)別數(shù)量龐大的底物的具體機(jī)制仍不明確。一些結(jié)構(gòu)分析表明,OGT識(shí)別底物蛋白質(zhì)依賴其含有34肽重復(fù)序列(tetratricopeptide repeat,TPR)的N端結(jié)構(gòu)域[22-24],并且催化的O-GlcNAc糖基化修飾傾向于發(fā)生在底物蛋白質(zhì)S/T富集的區(qū)域[25]。值得注意的是,OGT與OGA也會(huì)被O-GlcNAc糖基化修飾,這暗示兩者可能在翻譯后層面上相互調(diào)控各自的活性和穩(wěn)定性。在兩者形成的OGT-OGA復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)中,OGT形成了剪刀形二聚體,一個(gè)長(zhǎng)而靈活的OGA片段占據(jù)了OGT的底物結(jié)合槽,從而阻止OGT修飾其他底物。同時(shí),OGT破壞OGA的功能性二聚化并阻斷其活性位點(diǎn),導(dǎo)致其他底物無(wú)法進(jìn)入。這種OGT和OGA之間的相互抑制可能限制了無(wú)效的O-GlcNAc糖基化循環(huán),并有助于維持O-GlcNAc糖基化修飾水平的穩(wěn)態(tài)[26]?？傊?為了微調(diào)細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化修飾水平以維持穩(wěn)態(tài),OGT與OGA的功能效應(yīng)可能受多層反饋機(jī)制控制。

2 O-GlcNAc糖基化修飾與先天免疫

先天免疫的主要功能為抗感染,其構(gòu)成了抵御入侵病原體的第一道防線。當(dāng)宿主受到感染,先天免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),啟動(dòng)一系列的炎癥反應(yīng)。參與先天免疫反應(yīng)的細(xì)胞主要包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK cell)和樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)等[27]。O-GlcNAc糖基化修飾通過(guò)葡萄糖代謝,修飾轉(zhuǎn)錄因子以及影響重要信號(hào)通路等途徑發(fā)揮作用,介導(dǎo)先天免疫細(xì)胞的分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)以及炎癥反應(yīng)的調(diào)控。O-GlcNAc糖基化修飾參與先天免疫在巨噬細(xì)胞中已有較好的闡釋,下文將主要對(duì)此進(jìn)行概述。

2.1 O-GlcNAc糖基化修飾與巨噬細(xì)胞

2.1.1O-GlcNAc糖基化修飾參與巨噬細(xì)胞分化與穩(wěn)態(tài)維持 巨噬細(xì)胞存在兩種不同功能的表型:促進(jìn)炎癥的M1型與抑制炎癥而促進(jìn)組織修復(fù)的M2型[28],巨噬細(xì)胞的分化和表型維持受O-GlcNAc糖基化修飾調(diào)控。對(duì)人單核細(xì)胞白血病(THP-1)細(xì)胞進(jìn)行基因篩選發(fā)現(xiàn),OGT是巨噬細(xì)胞向M2型極化的新介質(zhì),OGT基因敲除后不利于THP-1細(xì)胞向IL4/IL13誘導(dǎo)的M2型極化,與M1型相關(guān)的基因表達(dá)反而上調(diào)[29]。在腫瘤微環(huán)境中,葡萄糖通量的增加通過(guò)上調(diào)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)中O-GlcNAc糖基化修飾水平來(lái)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)變[30]。有研究認(rèn)為,刺猬(Hedgehog,Hh)信號(hào)對(duì)于調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的代謝回路至關(guān)重要。抑制M2型巨噬細(xì)胞中Hh信號(hào)通路降低了UDP-GlcNAc的合成,導(dǎo)致STAT6的O-GlcNAc糖基化修飾減少,從而減輕M2型巨噬細(xì)胞的免疫抑制能力[31]。O-GlcNAc糖基化修飾還可以通過(guò)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性導(dǎo)致IL-1β、IL-6和IL-12等促炎細(xì)胞因子的升高,維持炎性巨噬細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[32]。此外,核糖體蛋白S6激酶β-1(ribosomal protein S6 kinase beta-1,S6K1)能夠作為OGT底物被O-GlcNAc糖基化修飾,該修飾阻礙了其自身的磷酸化激活,進(jìn)而影響mTORC1/S6K1信號(hào)通路活性,抑制巨噬細(xì)胞的活化[33]。

通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等基因的轉(zhuǎn)錄是O-GlcNAc糖基化修飾影響免疫細(xì)胞功能的重要作用形式。核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、活化的T細(xì)胞核內(nèi)因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)和信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)是調(diào)控免疫相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。OGT可與NF-κB共定位在啟動(dòng)子上并催化其RELA原癌基因(RELA proto-oncogene,RelA,即p65)亞基T305位點(diǎn)發(fā)生O-GlcNAc糖基化修飾,繼而增強(qiáng)RelA賴氨酸310位點(diǎn)的乙?；?使NF-κB的轉(zhuǎn)錄能力在腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)刺激下充分發(fā)揮[34]。此外,NF-κB的p65亞基在S536位點(diǎn)附近的O-GlcNAc糖基化修飾可以增強(qiáng)其與核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)的結(jié)合,推動(dòng)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變,減輕炎癥反應(yīng)[35]。STAT3是介導(dǎo)免疫抑制和組織修復(fù)的調(diào)節(jié)因子[36]。STAT3上T717位點(diǎn)的O-GlcNAc糖基化修飾阻礙其再被磷酸化激活,從而降低IL-10的表達(dá),促進(jìn)炎癥的發(fā)生[37]。這些結(jié)果體現(xiàn)出OGT底物選擇的多樣性,既有代謝信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì),也包括酶和多種轉(zhuǎn)錄因子,并且O-GlcNAc糖基化修飾的分布和巨噬細(xì)胞的分化選擇與表型維持很可能受到營(yíng)養(yǎng)條件的影響。

2.1.2O-GlcNAc糖基化修飾參與巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答 Toll樣、NOD樣等受體介導(dǎo)的信號(hào)通路是先天免疫信號(hào)傳導(dǎo)主要途徑。OGT通過(guò)修飾參與這些通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì),影響免疫細(xì)胞對(duì)病原體的應(yīng)答能力。例如TAK1(TGF-beta activated kinase 1)是若干細(xì)胞因子介導(dǎo)的先天免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中必不可少的激酶。IL-1誘導(dǎo)的TAB1(TGF-beta activated kinase 1 binding protein 1)S395位點(diǎn)上O-GlcNAc糖基化修飾,是TAK1和NF-κB活化以及最終產(chǎn)生IL-6和TNF-α所必需的[38]。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到脂多糖刺激時(shí),OGT被去亞硝基化(OGT的催化活性受S-亞硝基化修飾的抑制),繼而增強(qiáng)p65的O-GlcNAc糖基化修飾,提高一氧化氮和IL-1β水平[39]。但同時(shí)也有研究指出,脂多糖誘導(dǎo)的O-GlcNAc糖基化修飾參與了抗炎信號(hào)通路,OGT對(duì)受體相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)T467的O-GlcNAc糖基化修飾抑制了巨噬細(xì)胞下游先天免疫信號(hào)傳導(dǎo),相反,OGT的缺失會(huì)增強(qiáng)先天免疫和炎癥[40],反映出該修飾系統(tǒng)調(diào)控炎癥反應(yīng)的復(fù)雜性。NOD樣受體X1(NOD-like receptor X1,NLRX1)被OGT催化修飾后會(huì)促使NLRX1被泛素化,從而降低NLRX1的穩(wěn)定性,增強(qiáng)NLRX1競(jìng)爭(zhēng)性地與核因子κB激酶-α抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase-α,IKK-α)結(jié)合,抑制NF-κB信號(hào)和促炎細(xì)胞因子IL-1β的產(chǎn)生[41]。越來(lái)越多的研究表明,O-GlcNAc糖基化修飾在免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染過(guò)程中扮演了重要角色[42]。巨噬細(xì)胞中HBP通路和下游蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾水平會(huì)在受到泡疹性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)攻擊后增強(qiáng),OGT敲低的人和小鼠細(xì)胞,在面對(duì)VSV感染時(shí)則表現(xiàn)出抗病毒免疫反應(yīng)缺陷[43]。此外,在感染甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)的人外周血單核細(xì)胞中檢測(cè)到干擾素調(diào)節(jié)因子-5(interferon regulatory factor 5,IRF5)S430位點(diǎn)發(fā)生O-GlcNAc糖基化修飾,從而激活炎癥因子表達(dá),產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴[44]。線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral signaling proteins,MAVS)是干擾素信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì),在病毒識(shí)別時(shí)迅速產(chǎn)生[45]。MAVS蛋白上O-GlcNAc糖基化修飾是其在病毒誘導(dǎo)條件下發(fā)生泛素化所必需的,由此促進(jìn)IRF3活化和IFN-β的產(chǎn)生,其O-GlcNAc糖基化修飾的缺失使得宿主對(duì)于病毒更為易感[46]。在肺泡巨噬細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn),該過(guò)程還受到泛素E3連接酶重要組分Cullin5(CUL5)的調(diào)節(jié),其促使OGT被泛素化并通過(guò)蛋白酶體途徑降解,進(jìn)而影響MAVS蛋白O-GlcNAc糖基化修飾,損害機(jī)體的抗病毒能力[47]。這些研究提示,O-GlcNAc糖基化修飾能夠通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子和免疫信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)活性調(diào)控炎癥因子的產(chǎn)生,從而在控制炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間上發(fā)揮作用。

2.2 O-GlcNAc糖基化修飾與其他先天性免疫細(xì)胞

O-GlcNAc糖基化修飾在其他先天免疫細(xì)胞,例如中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞中同樣發(fā)揮了重要的免疫調(diào)控作用。例如,細(xì)胞因子IL-2和IL-15刺激的NK細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化修飾水平升高[48]。當(dāng)使用OGT的抑制劑OSMI-1抑制O-GlcNAc糖基化修飾時(shí),NK細(xì)胞中TNF-α、IFN-γ、顆粒蛋白和穿孔素等抗腫瘤蛋白質(zhì)表達(dá)降低,進(jìn)而減弱NK細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性[48]。Zeste增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)上S75位點(diǎn)的O-GlcNAc糖基化修飾,參與調(diào)節(jié)NK細(xì)胞發(fā)育和EZH2蛋白的穩(wěn)定性與功能[49, 50]。O-GlcNAc糖基化修飾水平的升高促進(jìn)中性粒細(xì)胞中p38和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的活化,從而增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的遷移能力[51]。此外,體外研究表明,抑制OGT會(huì)影響單核細(xì)胞來(lái)源的DC細(xì)胞分化和功能發(fā)揮[52]。

Fig.1 The regulatory role of O-GlcNAcylation in macrophages (A) The polarization and phenotypic maintenance of macrophages is regulated by O-GlcNAcylation, which is performed by OGT. Diverse substrates are glycosylated, including enzymes (iNOS, S6K1) and transcription factors (NF-κB, STAT3 and p65), resulting in different effects on macrophage activation and inflammation (cytokines production). Meanwhile, O-GlcNAcylation is affected by the hexosamine biosynthesis pathway (HBP) and hedgehog (Hh) signaling pathway, which influence the production of UDP-GlcNAc, the donor of GlcNAc. (B) The immune response of macrophage is also regulated by O-GlcNAcylation. When infected by RNA viruses, the protein that detect viral RNA, MAVS, is glycosylated by OGT, which in turn leads to the activation of transcription factors (NF-κB and IRF3), promoting cytokines production. IRF5 and NLRX1 are also glycosylated. When stimulated by lipopolysaccharide (LSP), OGT is denitrosylated, resulting in the glycosylation of p65 and subsequent cytokines transcription. Meanwhile, O-GlcNAcylation is affected by the HBP. ‘G’ in pink circle stands for O-GlcNAcylation, ‘P’ in orange circle stands for phosphorylation, ‘Ub’ in purple circle stands for ubiquitination and ‘SNO’ in orange oval stands for S-nitrosylation

3 O-GlcNAc糖基化修飾與適應(yīng)性免疫

適應(yīng)性免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫2種方式,主要由T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞承擔(dān)[53]。在T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、分化和功能效應(yīng)的發(fā)揮中,O-GlcNAc糖基化修飾同樣扮演了重要角色。

3.1 O-GlcNAc糖基化修飾與T細(xì)胞

關(guān)于O-GlcNAc糖基化修飾在T細(xì)胞中的功能已有較為全面的報(bào)道[54]。條件性敲除小鼠造血干細(xì)胞中Oga基因?qū)е伦婕?xì)胞顯著減少,干細(xì)胞自我更新受損,再生能力幾乎完全喪失,且早期T細(xì)胞對(duì)Oga缺失尤為敏感[55]。早在1991年,Kearse等發(fā)現(xiàn),T細(xì)胞的活化導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化修飾水平迅速增加,同時(shí)胞質(zhì)蛋白質(zhì)的修飾水平顯著下降,表明O-GlcNAc糖基化修飾參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的早期活化過(guò)程[56]。與此相一致的是,通過(guò)T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)激活人原代T細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致O-GlcNAc水平和OGT表達(dá)的升高,而不影響OGA水平[57]。初始CD4+T細(xì)胞通過(guò)表面受體識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞提呈的抗原肽段后會(huì)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)變,增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)的表達(dá)[58],并提高對(duì)葡萄糖和谷氨酰胺的攝入水平,以維持自身的大量增殖[59]。由于葡萄糖和谷氨酰胺是OGT催化底物UDP-GlcNAc的前體,因而免疫激活的T細(xì)胞含有更高水平的UDP-GlcNAc和O-GlcNAc糖基化修飾。與巨噬細(xì)胞類似,許多轉(zhuǎn)錄因子的O-GlcNAc糖基化修飾也參與了T細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)。NF-κB和NFAT的O-GlcNAc糖基化修飾促使其從胞質(zhì)向細(xì)胞核移位,驅(qū)動(dòng)了T細(xì)胞的增殖[60]。OGT的下調(diào)導(dǎo)致NFAT功能受損并抑制IL-2的產(chǎn)生[60]。NF-κB亞基c-Rel上S350位點(diǎn)的O-GlcNAc糖基化修飾是其DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活所必需的,該位點(diǎn)的突變降低了響應(yīng)TCR活化的NF-κB下游靶標(biāo)(包括細(xì)胞因子IL-2和IFNγ)的表達(dá)[61]。此外,c-Myc是一種與細(xì)胞代謝相關(guān)聯(lián)的重要轉(zhuǎn)錄因子[62],其在T細(xì)胞擴(kuò)增期間被O-GlcNAc糖基化修飾而穩(wěn)定,c-Myc的敲除損害了T細(xì)胞活化后葡萄糖和谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[62],并阻礙細(xì)胞內(nèi)TCR介導(dǎo)的O-GlcNAc糖基化修飾[63]。這些數(shù)據(jù)表明,c-Myc的存在對(duì)于維持T細(xì)胞中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾至關(guān)重要。OGT介導(dǎo)的O-GlcNAc糖基化修飾對(duì)于T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生是必需的。

Fig.2 The regulatory role of O-GlcNAcylation in T cells The activation and differentiation of T cells are regulated by O-GlcNAcylation. Transcription factors such as NF-κB, NFAT and c-Myc are glycosylated, which initiates transcription of cytokines and metabolism-related genes. The differentiation of T cell to Th17 is also regulated by miRNA-15b and RORγt. Meanwhile, O-GlcNAcylation is affected by the hexosamine biosynthesis pathway (HBP).‘G’ in pink circle stands for O-GlcNAcylation, ‘P’ in orange circle stands for phosphorylation

除了參與T細(xì)胞的活化,O-GlcNAc糖基化修飾還會(huì)影響T細(xì)胞分化和細(xì)胞亞型的維持。根據(jù)TCR所接收信號(hào)和環(huán)境的不同,初始T細(xì)胞活化后可以分化成相應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞亞群,包括輔助性T細(xì)胞(helper T cell,如Th1、Th2、Th17)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)[53]以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell,CTL)[64]。不同的T細(xì)胞亞型在免疫系統(tǒng)發(fā)揮著特定的功能。例如,輔助性T細(xì)胞Th1、Th2及Th17通過(guò)釋放各類細(xì)胞因子強(qiáng)化免疫反應(yīng)。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的一種主要促炎細(xì)胞因子,使用OGA抑制劑Thiamet G處理脾CD4+T細(xì)胞后,IL-17的分泌水平顯著提升,并且視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γt(retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma-t,RORγt,Th17譜系定型的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[65])與IL-17啟動(dòng)子區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)的結(jié)合增加,進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)[66]。miRNA-15b結(jié)合OGT的mRNA,介導(dǎo)其表達(dá)沉默并抑制Th17分化,這可能是通過(guò)阻斷NF-κB的O-GlcNAc糖基化修飾降低RORγt的表達(dá)所致[67]。另一方面,Treg細(xì)胞負(fù)責(zé)調(diào)控自身免疫耐受和體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài),轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的持續(xù)表達(dá)是此類細(xì)胞的重要標(biāo)志[68],其免疫調(diào)控功能依賴于T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)和IL-2/STAT5信號(hào)通路的激活。研究發(fā)現(xiàn),O-GlcNAc糖基化修飾缺陷導(dǎo)致Treg細(xì)胞中該信號(hào)傳導(dǎo)減弱,FOXP3表達(dá)輕度降低,譜系穩(wěn)定性和效應(yīng)功能卻嚴(yán)重受損,最終使小鼠發(fā)生致命的自身免疫病[69]。O-GlcNAc糖基化修飾是Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化和穩(wěn)態(tài)維持所必須,暗示其對(duì)于T細(xì)胞分化的精細(xì)調(diào)控具有重要意義。

3.2 O-GlcNAc糖基化修飾與B細(xì)胞

相較于T細(xì)胞,O-GlcNAc糖基化修飾在B細(xì)胞中的研究較少。B淋巴細(xì)胞主要通過(guò)分泌抗體參與體液免疫。早期B淋巴細(xì)胞通過(guò)B細(xì)胞受體(B cell receptor,BCR)介導(dǎo)的活化和增殖也需要OGT參與[60]。Src家族酪氨酸激酶LYN上S19的O-GlcNAc糖基化修飾促使該激酶活化,進(jìn)而招募脾酪氨酸激酶SYK傳導(dǎo)BCR信號(hào),OGT的缺失不僅會(huì)導(dǎo)致BCR信號(hào)激活的嚴(yán)重缺陷,而且還會(huì)通過(guò)促進(jìn)成熟B細(xì)胞的凋亡來(lái)擾亂B細(xì)胞穩(wěn)態(tài),最終使抗體水平降低[70]。此外,多種轉(zhuǎn)錄因子的O-GlcNAc糖基化修飾對(duì)B細(xì)胞的活化和免疫穩(wěn)態(tài)維持有重要作用。c-Myc的穩(wěn)定性受O-GlcNAc糖基化修飾調(diào)節(jié),敲低OGT會(huì)伴隨c-Myc水平的下調(diào),進(jìn)而抑制A型和E型細(xì)胞周期蛋白(cyclins)的表達(dá),影響前B細(xì)胞的增殖[71]。在前B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病中,O-GlcNAc糖基化修飾通過(guò)PI3K/Akt/c-Myc途徑促進(jìn)病程發(fā)展[72],而c-Myc的O-GlcNAc糖基化修飾位點(diǎn)T58是人淋巴瘤的突變熱點(diǎn)[73],有望作為前B細(xì)胞白血病的治療靶點(diǎn)。此外,高水平的O-GlcNAc糖基化修飾通過(guò)與磷酸化和乙?；南嗷プ饔没罨疦F-κB信號(hào)通路。p65在T305和S319的O-GlcNAc糖基化修飾可以通過(guò)激活p65在賴氨酸310位點(diǎn)的乙酰化來(lái)增強(qiáng)CREB-結(jié)合蛋白/p300依賴性,并促進(jìn)NF-κB轉(zhuǎn)錄激活[74]。B細(xì)胞中免疫球蛋白基因重排的隨機(jī)性使其具有多達(dá)1011種不同的特異性,從而確保對(duì)多種抗原的反應(yīng)性。然而,如此巨大的多樣性有一定概率會(huì)產(chǎn)生自身抗體,生成自身反應(yīng)性B細(xì)胞。免疫系統(tǒng)采用凋亡機(jī)制在這些自身反應(yīng)性細(xì)胞獲得免疫能力之前使其沉默[75]。淋巴細(xì)胞特異性蛋白1(lymphocyte-specific protein 1,Lsp1)是一種介導(dǎo)抗IgM抗體誘導(dǎo)B細(xì)胞凋亡的磷酸化蛋白質(zhì)[76]。該蛋白質(zhì)上S209位點(diǎn)的O-GlcNAc糖基化修飾促使其激酶PKC-β1募集,并催化Lsp1上S243位點(diǎn)磷酸化,從而導(dǎo)致ERK蛋白活化以及BCL-2、BCL-xL表達(dá)下調(diào),促進(jìn)活化B細(xì)胞凋亡[77]?？偟膩?lái)說(shuō),O-GlcNAc糖基化修飾及與磷酸化之間的動(dòng)態(tài)相互作用參與了B細(xì)胞活化和凋亡的調(diào)控,控制著體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)的維持。

Fig.3 The regulatory role of O-GlcNAcylation in B cells The activation and proliferation of B cells are regulated by O-GlcNAcylation. Transcription factors such as NF-κB, NFAT, c-Myc and subunit p65 are glycosylated, which initiate transcription of related genes, thus promoting activation and proliferation of B cells. The progress can be regulated by BCR signaling and affected by hexosamine biosynthesis pathway (HBP). Apoptosis of B cells is also regulated by O-GlcNAcylation as key kinases in the apoptotic pathway are glycosylated by OGT.‘G’ in pink circle stands for O-GlcNAcylation, ‘P’ in orange circle stands for phosphorylation and ‘Ac’ in crimson circle stands for acetylation

4 O-GlcNAc糖基化修飾與免疫相關(guān)疾病

O-GlcNAc糖基化修飾的異常與多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。炎癥反應(yīng)是免疫系統(tǒng)對(duì)外界刺激的一種保護(hù)性反應(yīng),但過(guò)度或長(zhǎng)期的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織損傷和疾病發(fā)展[78]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),O-GlcNAc糖基化修飾扮演著促炎和抗炎的兩面性。異常的O-GlcNAc糖基化修飾水平與炎癥細(xì)胞的活化、細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及免疫耐受的破壞有關(guān)。這些變化可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)過(guò)度激活,攻擊自身組織,引發(fā)疾病。例如骨關(guān)節(jié)炎就與軟骨細(xì)胞中高水平的O-GlcNAc糖基化修飾水平相關(guān),IL-1α刺激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞中O-GlcNAc糖基化修飾以及OGT和OGA合成迅速增加[79]。如前所述,IL-17是由Th17細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子,而IL-17的產(chǎn)生與初始CD4+T細(xì)胞中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾水平的升高相關(guān)聯(lián)[66]。持續(xù)的炎癥可能會(huì)誘導(dǎo)出現(xiàn)自身免疫疾病,這是一種由免疫系統(tǒng)損害自身組織的慢性病癥[80],在系統(tǒng)性紅斑狼瘡女性患者體內(nèi),T細(xì)胞表現(xiàn)出OGT表達(dá)水平升高和OGT基因去甲基化的特點(diǎn)[81]。

慢性炎癥是癌癥發(fā)生的重要誘因之一。值得注意的是,腫瘤細(xì)胞通常表現(xiàn)出異常高水平的O-GlcNAc糖基化修飾,以此增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和免疫逃逸[82]。例如,O-GlcNAc糖基化修飾通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),阻礙PD-L1的溶酶體途徑降解,以此增強(qiáng)腫瘤免疫逃逸[83]。另一方面,腫瘤細(xì)胞主動(dòng)釋放包含OGT的外泌體,提高鄰近CD8+T細(xì)胞中OGT含量,促進(jìn)CD8+T細(xì)胞上程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death 1,PD-1)的表達(dá),從而使自身免于CD8+T細(xì)胞毒性傷害[84]。一些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子上O-GlcNAc糖基化修飾狀態(tài)的改變往往促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。例如轉(zhuǎn)錄因子叉頭框A1(forkhead box A1,FOXA1)上的O-GlcNAc糖基化修飾促進(jìn)了其與染色質(zhì)的組裝,通過(guò)協(xié)調(diào)多種轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[85]。腫瘤細(xì)胞還會(huì)在特定細(xì)胞因子刺激下改變自身代謝狀態(tài),以維持自身增殖或?qū)崿F(xiàn)遷移。IL-8刺激的結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3、葡萄糖胺果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶(fructose-6-phosphate aminotransferase,GFAT)的表達(dá)相應(yīng)增強(qiáng),從而提高腫瘤干細(xì)胞中的O-GlcNAc糖基化修飾水平,維持其干性[86]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1通過(guò)增強(qiáng)GFAT的穩(wěn)定性誘導(dǎo)染色質(zhì)重塑酶MORC家族CW鋅指蛋白2(MORC family CW-type zinc finger 2,MORC2)被O-GlcNAc糖基化修飾,介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[87]。此外,腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞,也會(huì)受到O-GlcNAc糖基化修飾的調(diào)控,進(jìn)而影響它們對(duì)腫瘤的識(shí)別和清除[88]。高糖條件下,巨噬細(xì)胞中O-GlcNAc糖基化修飾水平的增加驅(qū)動(dòng)其極化為支持腫瘤發(fā)展的M2樣表型[30],并促進(jìn)組織蛋白酶B(cathepsin B)在溶酶體中的成熟,從巨噬細(xì)胞釋放到腫瘤微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[89]。這些結(jié)果表明,腫瘤細(xì)胞利用O-GlcNAc糖基化修飾作為免疫逃避的直接手段,腫瘤微環(huán)境中的高O-GlcNAc糖基化水平對(duì)免疫細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)是明顯不利的。

5 問(wèn)題與展望

O-GlcNAc糖基化修飾在免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化過(guò)程中,以及在腫瘤免疫和炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié),仍使我們對(duì)此缺乏系統(tǒng)性的認(rèn)識(shí),有些關(guān)鍵問(wèn)題值得深入探究:(1)該修飾在不同細(xì)胞類型及環(huán)境刺激下表現(xiàn)出多樣的調(diào)控效果,表明O-GlcNAc糖基化修飾可能是一種組織和細(xì)胞特異性的修飾形式。在以往的研究中,研究人員多從OGT催化底物的O-GlcNAc糖基化修飾,進(jìn)而影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度解釋了許多免疫響應(yīng)的分子機(jī)制,而對(duì)于OGT/OGA自身表達(dá)和活性的調(diào)控缺乏認(rèn)識(shí)。面對(duì)不同的免疫信號(hào)分子,O-GlcNAc糖基化修飾的蛋白質(zhì)組發(fā)生怎樣的動(dòng)態(tài)變化,以及細(xì)胞如何協(xié)調(diào)OGT/OGA表達(dá)或酶活以維持O-GlcNAc糖基化修飾水平的穩(wěn)態(tài);(2)OGT/OGA在不同時(shí)空靶向眾多蛋白質(zhì)底物的識(shí)別機(jī)制;(3)O-GlcNAc糖基化修飾與其他蛋白質(zhì)翻譯后修飾之間的相互串?dāng)_對(duì)于調(diào)控免疫反應(yīng)具有重要意義,這些串?dāng)_的潛在機(jī)制有待探索。例如O-GlcNAc糖基化修飾何時(shí)占據(jù)主導(dǎo),如何調(diào)節(jié)與磷酸化、泛素化等修飾的平衡等。

由于O-GlcNAc糖基化修飾本身分子量小且不帶電荷,在質(zhì)譜檢測(cè)中容易被打斷導(dǎo)致信號(hào)丟失,而且O-GlcNAc糖基化修飾具有瞬時(shí)性和動(dòng)態(tài)性,致使其更加難以富集和捕捉。近年來(lái)發(fā)展出的一些有效的O-GlcNAc糖基化修飾富集和鑒定方法[90-92],將有助于我們對(duì)于O-GlcNAc糖基化修飾在免疫系統(tǒng)中的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。總而言之,O-GlcNAc糖基化修飾作為一種重要的翻譯后修飾,其廣泛參與到了免疫反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)。深入研究O-GlcNAc糖基化修飾與免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系,將有助于揭示機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)機(jī)制,并為相關(guān)疾病的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和策略。