梁薛峰，孫錦怡，王成，曹彬，倪子薇，段偉，阮彩蓮

1延安大學醫(yī)學院，延安 716000；2延安大學附屬醫(yī)院腫瘤科，延安 716000

苦苣菜（Sonchus oleraceus L.）又名苦菜、滇苦菜、苦荬菜等等，是一種藥食同源類中草藥，屬菊科苦苣菜屬，為一年生或二年生草本植物[1]。其主要活性成分是倍半萜類、黃酮類和酚類化合物等，分別具有抗炎、抗氧化、抗癌、降壓、改善心腦血管疾病、降血脂、降膽固醇、保肝護肝等多種藥理或保健作用[2-4]。早在《嘉祐本草》中就有記載，苦苣用于清熱解毒，主治黃疸、胃炎、痢疾、肺熱咳嗽等疾病，具有保肝護肝的功效。并且苦苣菜有分布廣泛、易于存活、容易獲取等優(yōu)點，這也為其具有較高的藥用價值奠定了基礎[5]。肝臟是人體重要的代謝器官，該器官的損傷會對人體代謝、排毒等功能造成嚴重影響，進一步發(fā)展將會引發(fā)病毒性肝炎、肝纖維化甚至肝癌等疾病，故每年肝損傷患者死亡率很高[6]。肝臟損傷是指由病毒、藥物、酒精、缺氧等因素導致的，與氧化應激、炎癥反應等機制密切相關的肝臟組織病理改變，全球每年有200 萬人死于肝臟疾病，其中100 萬人死于肝硬化并發(fā)癥，100 萬人死于病毒性肝炎和肝癌，肝臟疾病對人類健康的影響巨大[7]。網絡藥理學作為一種基于系統(tǒng)生物學理論以對生物系統(tǒng)多層次分析的交叉新興學科，通過創(chuàng)建多靶點與多疾病間復雜網狀關系，對復雜疾病發(fā)病及治療具有潛在應用價值，近年來已成為中醫(yī)藥學研究中常用的虛擬篩選方法之一，為中藥的治療、應用提供了研究方向[8]。已有研究表明，苦苣菜水醇提取物對小鼠具有明確的抗炎、抗氧化等功效，但其具體作用機制目前并不清楚[3]。并且目前中藥方面對苦苣菜的藥理作用研究較為廣泛，但對疾病的作用機制研究尚有欠缺，這導致臨床中缺乏與中藥成分相關的保肝護肝類藥物[9]。故本研究通過基于網絡藥理學的研究方法，對中藥苦苣菜的天然活性成分及其對人類的關鍵作用靶點進行篩選，并將之與急性肝損傷（acute liver injury，ALI）疾病基因進行對接去重，再對其潛在作用靶標進行蛋白互作網絡構建，所富集的生物過程、通路進行系統(tǒng)分析及可視化，以闡述苦苣菜對ALI 的藥理作用機制，為進一步深入研究苦苣菜對ALI 的治療作用機制奠定了研究基礎，對臨床上治療肝損傷新藥研發(fā)領域具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據庫與軟件 本研究數(shù)據來源于以下數(shù)據庫與軟件。見表1。

表1 數(shù)據庫與軟件

1.2 苦苣菜活性成分的獲取與篩選 通過在中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP 中檢索“苦苣菜”“苦菜”“山苦荬”“Sonchus oleraceus L.”得到苦苣菜的化學成分。發(fā)現(xiàn)苦苣菜及相關名稱沒有收錄在TCMSP 中，在HERB 本草組鑒查詢苦菜的有效成分也未查詢到相關結果。根據超高效液相色譜-質譜數(shù)據，將苦苣菜活性單體成分輸入TCMSP 之中，并篩選口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 的活性單體成分（OB 值意味著該成分可以被人體吸收利用的程度，DL 值意味著該成分可以被用作藥物的可能性大小），獲得苦苣菜有效活性成分。

1.3 苦苣菜活性成分潛在靶點獲取及成分-靶點網絡圖的構建 在Pubchem 中獲取苦苣菜活性成分的SMILES 號，并將其輸入至Swiss Target Prediction 基因庫中進行靶基因預測，選取HOMO SAPIENS 人類基因庫進行檢索，將得到的各種活性成分對應的靶基因導出，并刪除無對應基因名的靶點，篩選靶基因可信度（P ≥0.01）或者目標可信度等級排名前15 個的靶點并進行合并去重，借助使用Uniprot 將所有靶點基因全稱轉變?yōu)楹喎Q，將其與苦苣菜活性有效成分相關聯(lián)，使用Cytoscape 3.9.1 構建出苦苣菜活性成分-靶點網絡圖。

1.4 急性肝損傷靶點獲取 使用OMIM 及GeneCards基因庫獲取疾病目的基因，以“acute liver injury”為關鍵詞進行搜索，獲取急性肝損傷疾病靶點，按相關性分數(shù)由高到低排序，以分值＞2 倍中位數(shù)為篩選條件篩選疾病靶點，所得結果合并之后去除重復靶點，將其作為急性肝損傷的疾病靶點信息。

1.5 苦苣菜活性成分與急性肝損傷交集靶點的獲取 將得到的苦苣菜活性成分潛在靶點和急性肝損傷疾病靶點共同導入微生信平臺的Venn 圖繪制工具，兩者取交集并導出交集靶點，獲取中藥活性成分與疾病的交集靶點，即視為苦苣菜治療急性肝損傷的潛在作用靶點。

1.6 苦苣菜治療急性肝損傷核心靶點的篩選及PPI 網絡圖構建 將獲得的苦苣菜-急性肝損傷的潛在共同靶點輸入STRING 進行PPI 蛋白互作分析，導出原圖及數(shù)據，利用Cytoscape 3.9.1 軟件構建PPI 網絡圖，計算參數(shù)閾值，通過篩選BC（betweenness centrality，介數(shù)中心性度）、Degree（DC，結點中心度）、CC（closeness centrality，緊密中心度）值，篩選出關鍵靶點，將其視為苦苣菜治療急性肝損傷發(fā)揮藥效的關鍵靶點。

1.7 苦苣菜治療急性肝損傷的GO 及KEGG 富集分析 將中藥成分-疾病交集靶點導入DAVID 2022[10]，進行基因本體（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，選擇生物過程（biological process，BP）、細胞組 成（cellular components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）三個條目，設定分析物種為“HOMO SAPIENS”，設置P ＜0.01，GO 富集分析選擇排名前10 條的BP、CC、MF 條目和KEGG 富集分析排名前20 條條目，最后利用微生信進行GO 富集柱狀圖及KEGG 富集氣泡圖的制作。

1.8 KEGG 通路可視化處理 在從DAVID 導出KEGG 通路富集分析數(shù)據后，利用微生信平臺對通路進行初步可視化分析，選擇相對重要的一條通路圖，再使用Adobe Illustrator 2022，對其進行進一步可視化處理，更加直觀。

2 結果

2.1 苦苣菜活性成分的獲取與篩選 根據超高效液相色譜-質譜數(shù)據，獲得苦苣菜成分共304 種，將其輸入TCMSP 中，最終篩選出蘆薈大黃素等21 種有效活性成分并進行列表。見表2。

表2 苦苣菜有效成分信息表

2.2 苦苣菜活性成分潛在靶點篩選及成分-靶點網絡圖的構建 將21 種苦苣菜有效活性成分輸入Swiss Target Prediction 基因庫中，得到潛在靶點共314 個，去重后得到潛在靶點共174 個，并使用Uniprot 將所有基因轉變?yōu)楹喎Q，將其與苦苣菜活性成分相關聯(lián)，Cytoscape 3.9.1 構建苦苣菜活性成分-靶點網絡圖。見圖1。

圖1 苦苣菜活性成分-靶點網絡圖

2.3 急性肝損傷靶點獲取及苦苣菜-急性肝損傷共同靶點獲取 在OMIM、Genecards 基因庫中共獲取8868 個急性肝損傷靶點，按條件篩選后，所得結果合并、去重得到2842 個肝損傷靶點。將苦苣菜活性成分靶點與急性肝損傷靶點共同導入微生信平臺，兩者取交集導出85 個交集靶點，作為苦苣菜-急性肝損傷共同靶點，導出Venn 圖。見圖2。

圖2 苦苣菜-急性肝損傷共同靶點venn圖

2.4 苦苣菜治療急性肝損傷關鍵靶點的篩選及蛋白互作網絡圖的構建 將苦苣菜-急性肝損傷共同靶點輸入STRING 獲得PPI 蛋白互作關系、BC、Degree（DC）、CC 值，Cytoscape 3.9.1 軟件構建PPI 網絡，篩選BC ＞24、Degree ＞30、CC ＞0.5，共篩選出22 個關鍵靶點。見圖3。排名前3 的分別為TNF、TP53、PPARG，預測22 個關鍵蛋白在急性肝損傷的發(fā)病中起到關鍵的作用，同時也是苦苣菜發(fā)揮藥效的作用位點。

圖3 苦苣菜治療急性肝損傷PPI網絡

2.5 靶基因的GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 向DAVID 導入苦苣菜-急性肝損傷交集靶點后導出數(shù)據，獲得GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析結果如下，GO 功能富集分析選擇排名前10 條的BP、CC、MF 條目，KEGG 通路富集分析排名前20 條條目，利用微生信制作GO 富集柱狀圖及KEGG 富集氣泡圖導出。

GO-BP 分析顯示有338 條生物學過程與此有關，分別為：對外源性刺激的反應、凋亡過程正向調控、MAPK 級聯(lián)反應正向調控等。GO-CC 分析顯示有51 條細胞組成與此有關，分別為：受體復合物、膜筏、細胞溶質等。GO-MF 分析顯示有103 條分子功能與此有關，分別為：酶結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等。

KEGG 分析顯示有131 條信號通路與此有關，富集最顯著分別為：癌癥信號通路、FcεRI 信號通路、IL-17 信號通路等。見圖4、圖5。

圖4 苦苣菜-急性肝損傷交集靶點GO富集分析柱狀圖

圖5 苦苣菜-急性肝損傷交集靶點KEGG富集分析氣泡圖

2.6 KEGG 富集信號通路可視化處理 將從DAVID獲得的KEGG 通路富集分析數(shù)據導入微生信平臺，獲得所有通路的可視化分析圖。P 值排名第1 的Pathways in cancer，已有張晴晴等眾多學者[11-12]在其網絡藥理學研究中進行闡述或可視化分析，經查閱文獻，最終選擇排名第2 的Fc epsilon RI signaling pathway 進行可視化展示更有意義，并用Adobe Illustrator 2022 進一步展示模式圖，以便查看。見圖6。

圖6 FcεRI-MAPK信號通路模式圖

3 討論

苦苣菜自古以來便是我國傳統(tǒng)的藥食同源類中草藥，分類繁多，最常見的無花苦苣菜即全葉苦苣菜通常作為野菜所食用，早在《神農本草經》中便有記載，其性味苦寒，可治療厭食、血淋和痔瘺，還有養(yǎng)胃、利小便等功能[13]。進入現(xiàn)代醫(yī)學，隨著中藥具體成分被逐漸發(fā)掘以及中藥網絡藥理學、系統(tǒng)生物學等方法的出現(xiàn)，苦苣菜更多的藥效被學者所發(fā)現(xiàn)，進一步被用于治療炎癥、抗菌、降血糖、降血壓、血脂、保肝護肝等藥用方面[9]。網絡藥理學、生信分析的出現(xiàn)將中草藥成分與現(xiàn)代疾病分子機制關聯(lián)起來為中草藥治療現(xiàn)代疾病提供了探索依據[14]。

近年來，關于苦苣菜的藥理作用相關研究越來越多，但大多都停留在藥效層面，對其具體藥效分子機制有待深入研究。隨著臨床藥物的更多使用、飲酒習慣的伴隨，且我國是肝炎病毒大國，藥物性、酒精性、病毒性肝損傷的發(fā)病率逐年上升，臨床目前急需相關藥物[15]。而網絡藥理學的出現(xiàn)，為疾病的靶向治療提供了可能，通過從苦苣菜的活性成分分析、GO、KEGG 富集分析、通路可視化展示等方式，預測苦苣菜對急性肝損傷的具體作用靶點及機制，將對藥物的研發(fā)及疾病的治療提供重要依據。

通過超高效液相色譜-質譜數(shù)據、TCMSP、HERB對苦苣菜活性成分進行查找、篩選，共找到蘆薈大黃素、山柰酚等21 種有效活性成分，將其視為苦苣菜的主要活性成分。蘆薈大黃素屬蒽醌類化合物，譚章斌[16]等發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素可以通過抑制肝癌細胞內Src/STAT3信號通路以及抑制下游相關蛋白的表達來抑制肝癌細胞的增殖，而Src/STAT3 信號通路在炎癥反應及多種腫瘤細胞的增殖反應中起到關鍵作用，提示其可以抑制肝臟的炎癥反應及腫瘤細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素還可通過阻斷iNOS 和COX-2 mRNA 的表達來起到抑制炎癥反應的作用[17]，起到抗炎作用。山柰酚，屬黃酮類化合物，黃酮類化合物為苦苣菜主要活性成分之一，研究表明，山奈酚可以通過抑制CYP2E1 的表達及其活性起到保護肝臟，抵抗酒精性肝損傷的作用，而CYP2E1 是酒精在體內代謝的關鍵酶類，其活性的減低可以有效的減少酒精性肝損傷的損害[18]。綜上，苦苣菜活性成分能夠起到抗炎、抗氧化、抗腫瘤的作用，推測其為苦苣菜發(fā)揮藥效的重要成分，為疾病的研究起到了重要的藥用價值。

苦苣菜活性成分對人類的作用靶點眾多，通過OMIM 及GeneCards 基因庫獲取疾病基因，并與苦菜活性成分靶點取交集得到85 個靶點，篩選最終得到苦苣菜治療急性肝損傷關鍵靶點22 個，將其視為苦苣菜發(fā)揮藥效的關鍵靶點，主要為TNF、TP53、PPARG、CASP3 等，其中較多靶點與細胞的炎癥、凋亡、損傷、增殖、分化有著相似的生物學效應及協(xié)同效應。TNF 在腫瘤細胞的損傷、凋亡中起著關鍵作用，其可誘導腫瘤細胞凋亡、參與機體免疫應答、誘導細胞程序性死亡以及影響腫瘤血管功能等方面發(fā)揮作用，對乳腺癌、胃癌、肝癌起到重要的調控作用[19]。TP53為人體的抑癌基因。其突變往往預示著患癌風險，其可以通過促進腫瘤細胞的增殖、遷移、生存等，促進腫瘤的進展及惡變，胃癌、結腸癌、食管癌等都與TP53 的突變息息相關[20]。PPARG 屬于類固醇激素受體，主要起到脂質分化調控的作用，在脂肪組織、血管平滑肌組織中廣泛表達，研究顯示，該基因的激活與缺血性腦卒中、冠心病的發(fā)病密切相關。肝臟脂質的堆積也會引起肝炎、肝硬化導致肝臟損傷[21]。當細胞受損時，CASP3 會起到促進細胞凋亡的作用，其缺失、突變會導致細胞凋亡中斷，導致腫瘤的發(fā)生、惡化，與肝癌的發(fā)生存在關系[22]。綜上，部分關鍵靶點在炎癥反應、腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展中起到了相似的作用，也預示苦苣菜的作用位點很有可能與其相關。

通過對苦苣菜活性成分-急性肝損傷交集靶點進行GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，苦苣菜治療急性肝損傷的生物過程主要富集在對外源性刺激的反應、凋亡過程正向調控、受體復合物、膜筏、細胞溶質、酶結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等生物學過程。通過KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，其主要富集在癌癥信號通路、FcεRI 信號通路、IL-17 信號通路、乙型肝炎等通路。其中癌癥通路為顯著性最高的通路，F(xiàn)cεRI信號通路、IL-17 信號通路等為顯著性較高的通路。TNF、TP53、PPARG、ESR1 等調節(jié)炎癥反應、腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展的關鍵靶點均處于癌癥通路中，對外源性刺激的反應、凋亡過程正向調控、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性的靶點在PPI 網絡中也處于核心地位，說明苦苣菜可能是通過調節(jié)肝臟中這些關鍵靶點、關鍵生物過程來調控癌癥通路等高顯著性通路以起到抗炎、抗腫瘤、抗氧化的關鍵作用，因此可用于治療急性肝損傷。此外，已有研究表明FcεRI 信號通路為免疫炎癥中的關鍵通路，藥物、乙肝丙肝病毒可以通過外源性刺激肝臟肥大細胞釋放IgE 介質，激活該通路引起TNF-α 的釋放，誘發(fā)炎癥導致肝纖維化乃至肝癌[23]。結果提示，苦苣菜還可調節(jié)FcεRI 信號通路中相關聯(lián)的MAPK 信號通路、TNF-α等關鍵靶點起到拮抗藥物、病毒性肝損傷的重要作用。TNF-α 是極其重要的系統(tǒng)性炎癥因子，同時也是屬于引起急相反應的眾多細胞因子中的一員，與急性肝損傷的發(fā)病息息相關[24]，而其余高顯著性通路如IL-17信號通路、乙型肝炎等炎癥通路，IL-17 通過激活IL-17RA、RC 受體間接激活MAPKs，進而激活核內TNF-α 的轉錄、翻譯引發(fā)急性炎癥及損傷。苦苣菜的施加可以作用于IL-17、MAPKs、TNF-α 等關鍵靶點，調節(jié)該通路?？梢娍嘬牟嘶钚猿煞挚梢酝ㄟ^抑制急性炎癥通路，起到治療急性肝損傷的作用。

綜上所述，本研究通過應用網絡藥理學的方法對苦苣菜治療急性肝損傷的活性成分、關鍵靶點、關鍵通路等進行探究，從分子學水平對其治療機制進行系統(tǒng)分析，苦苣菜中蘆薈大黃素、積雪草酸、山柰酚等活性成分可以作用于TNF、TP53、PPARG、CASP3 等關鍵靶點，通過調控癌癥通路等多生物學過程、通路起到治療急性肝損傷的作用，進一步驗證了苦苣菜作為藥物治療多種疾病的可能性，為探究苦苣菜治療急性肝損傷的具體作用機制及新藥開發(fā)提供了依據。