盧麗君 田輝 鄭洋 胡漢姣 （武漢市中醫(yī)醫(yī)院肺系病科，武漢 430014）

常見的慢性氣道炎癥性疾病主要包括慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）和哮喘，發(fā)病率、病死率和致殘率均較高，給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-2］。COPD多發(fā)于40歲以上人群（發(fā)病率約為10%）［3］。哮喘是世界第二大致殘致死疾病，專家預(yù)測(cè)2025年我國(guó)哮喘患者將達(dá)到4億［4］。慢性氣道炎癥性疾病的病因復(fù)雜，多種細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子和干擾素等相互作用影響參與COPD和哮喘的發(fā)生和發(fā)展，促進(jìn)氣道炎癥反應(yīng)和氣道損傷［5-7］。隨著支氣管擴(kuò)張劑、抗氧化劑、磷酸二酯酶抑制劑和糖皮質(zhì)激素等藥物的使用，病死率和住院率略有下降，但往往會(huì)產(chǎn)生許多副作用，且對(duì)肺功能的衰退沒有效果，因此繼續(xù)尋找更加安全有效的藥物具有重要的意義［8-10］。NF-κB和Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。近來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)蛋白在肺部疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用。異甘草素能夠上調(diào)Nrf2和NF-κB的表達(dá)，抑制COPD小鼠肺部的炎癥和氧化應(yīng)激［11］；補(bǔ)肺健脾益腎方能夠下調(diào)NF-κB的表達(dá)，降低COPD大鼠肺組織中炎癥因子的含量［12］。綜上，NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路在緩解COPD導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥過程中有重要作用。紫花牡荊素（casticin，CAS）是中藥蔓荊子的主要成分，許多研究顯示，CAS具有抗炎和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的作用［13-14］。但CAS是否通過調(diào)節(jié)NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路，進(jìn)而緩解COPD導(dǎo)致的炎癥還未闡明。本研究以BEAS-2B細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型，探討CAS緩解COPD誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑 人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基（Lonza；貨號(hào)：CC3170）；PBS、0.25%胰蛋白酶、十二烷基硫酸銨、TEMED、過硫酸銨、Tween-20、RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Solarbio；貨號(hào)分別為：P1010、T1350、S8010、T8090、A1030-1、T8220-100、R0010、PC0020）；脂多糖（來源于大腸桿菌055：B5）、紫花牡荊素（阿拉丁；貨號(hào)：L118716、V117963）；ML385（Selleck；貨號(hào)：S8790）；人IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ ELISA試劑盒（Bioswamp；貨號(hào)分別為：HM10206、HN10001、HM10205、HM10115）；兔抗NF-κB p65、Keap1、Nrf2、GAPDH、Lamin B1、羊抗兔蛋白二抗（Bioswamp；貨號(hào)分別為：PAB37352、PAB30175、PAB30615、PAB36269、PAB43971、SAB43714）；兔抗p-NF-κB p65（Abcam；貨號(hào)：ab76302）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BD；貨號(hào)：556547）；蛋白質(zhì)（Marker）（Helix；貨號(hào)：P12103）；PVDF轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑（Millipore；貨號(hào)為：IPVH00010、WBKLS0500）。

1.1.2 儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州智凈；型號(hào)：SW-CJ-1D）；生物安全柜（Spantech；型號(hào)：BSC-1300IIB2）；CO2恒溫培養(yǎng)箱、移液器（Thermo；型號(hào)分別為：311、F3）；倒置熒光顯微鏡（Lecia；型號(hào)：DMIL LED）；流式細(xì)胞儀（艾森；型號(hào)：NovoCyte）；電泳儀（Bio-Rad；型號(hào)：mini protean 3 cell）；酶標(biāo)儀（雷勃；型號(hào)：MK3）；干式恒溫器（杭州爽盛；型號(hào)：K30）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能；型號(hào)：Tanon-5200）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將BEAS-2B人正常肺上皮細(xì)胞培養(yǎng)于BEGM Bullet Ki（t氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基套裝）中在37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)，按1∶2比例傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建 將細(xì)胞分為對(duì)照組和模型組，對(duì)照組換正常培養(yǎng)基，模型組換含有1 μg/ml脂多糖的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 ELISA檢測(cè)炎癥因子濃度，篩選最佳作用濃度和時(shí)間 利用不同濃度（0.5、1、2、5、10 μmol/L）的CAS分別預(yù)處理1 h、2 h和4 h，然后脂多糖干預(yù)BEAS-2B細(xì)胞損傷24 h。按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)各組細(xì)胞上清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ濃度，得出抑制炎癥的最佳作用濃度A和時(shí)間B。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)照組細(xì)胞分為6組：正常組、模型組、Casticin（A）組、ML385（20 μmol/L）組、Casticin（A）+ML385（20 μmol/L）組、地塞米松（0.2 mol/L）組。正常組正常培養(yǎng)細(xì)胞不做任何處理，模型組按照1.2.2的方法構(gòu)建模型，其他組分別用對(duì)應(yīng)濃度的藥物預(yù)處理B小時(shí)，然后進(jìn)行造模。收集各組細(xì)胞，取1×106個(gè)培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞，400 g、4 ℃ 離心5 min，棄上清；加入1 ml預(yù)冷PBS，輕輕吹打混勻細(xì)胞，400 g、4 ℃ 離心5 min，棄上清；將細(xì)胞重懸于200 μl PBS；加入10 μl Annexin VFITC和 10 μl PI，輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min；加入300 μl PBS，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，使用Novo-Express分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的濃度 按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)各組細(xì)胞上清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ含量。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)CAS對(duì)細(xì)胞NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE通路的影響 將細(xì)胞取出后吸去培養(yǎng)液，適量預(yù)冷的PBS洗滌2次，吸去PBS，按照1×106個(gè)細(xì)胞加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液200 μl，4 ℃充分裂解細(xì)胞，將細(xì)胞刮入1.5 ml EP管中，在4 ℃、12 000 g離心10 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將各組樣品于12%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜。分別加入兔抗NF-κB p65（1∶1 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、Keap1（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）、Lamin B1（1∶1 000）室溫孵育1 h。洗膜3次，孵育山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫1 h。洗膜3次后，將膜放置在暗室中，根據(jù)用量取ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面與之充分接觸。然后將膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布且方差齊性，則多組間比較使用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，若不符合則進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選CAS的最佳作用濃度和時(shí)間 結(jié)果如圖1所示，隨著CAS濃度的升高，炎癥因子的含量逐漸下降，CAS濃度為10 μmol/L時(shí)炎癥因子的含量最低，因此選擇10 μmol/L為CAS的最佳作用濃度；圖中可以看出，當(dāng)CAS的濃度為10 μmol/L時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)TNF-α的含量不斷下降［4 h時(shí)含量為（143.14±5.23） pg/ml］，而IFN-γ［（100.60±0.78） pg/ml、IL-6（60.82±2.24） pg/ml、IL-1β（131.56±2.85） pg/ml］都是在處理2 h時(shí)的含量最低，因此最佳處理時(shí)間為2 h。

圖1 不同濃度CAS對(duì)細(xì)胞炎癥因子的影響Fig.1 Effects of different concentrations of CAS on inflammatory factors

2.2 CAS對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡率的影響 結(jié)果見圖2。與正常組相比，模型組的細(xì)胞凋亡率［（35.79±1.38）%］顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，Casticin組和地塞米松組細(xì)胞凋亡率［（20.43±0.19）%；（20.48±0.41）%］顯著降低（均P＜0.01）；與ML385組相比，Casticin+ML385組的細(xì)胞凋亡率［（28.54±0.67）%］顯著降低（均P＜0.01）。

圖2 CAS對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of CAS on apoptosis rate of BEAS-2B cells induced by lipopolysaccharide

2.3 CAS對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 與正常組相比，模型組IL-1β［（508.02±4.52） pg/ml］、TNF-α［（525.26±1.79） pg/ml］、IL-6［（244.65±1.36） pg/ml］、IFN-γ［（417.63±5.22） pg/ml］的含量均顯著升高（均P＜0.01）；與模型組相比，Casticin組和地塞米松組IL-1β［（341.48±5.00） pg/ml；（242.52±4.39） pg/ml］、TNF-α［（342.27±4.71） pg/ml；（217.95±2.55） pg/ml］、IL-6［（141.41±1.88） pg/ml；（91.54±1.01） pg/ml］、IFN-γ［（259.32±5.74） pg/ml；（190.52±3.44） pg/ml］含量均顯著降低（均P＜0.01）；與ML385組相比，Casticin+ML385組IL-1β［（256.22±6.11） pg/ml］、TNF-α［（188.76±1.81） pg/ml］、IL-6［（111.15±2.02） pg/ml］、IFN-γ［（229.07±1.50） pg/ml］的含量均顯著降低（均P＜0.01）。見圖3。

圖3 CAS對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of CAS on inflammatory response of lipopolysaccharide- induced BEAS-2B cells

2.4 CAS對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞NF-κBKeap1-Nrf2/ARE通路的影響 結(jié)果見圖4。與正常組相比，模型組p-NF-κB p65（0.50±0.01）和Keap1（0.58±0.01）蛋白水平顯著升高（P＜0.01），細(xì)胞和細(xì)胞核中Nrf2（0.32±0.01；0.41±0.02）蛋白水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，Casticin組p-NFκB p65（0.36±0.02）和Keap1（0.42±0.02）蛋白水平顯著降低（P＜0.01），細(xì)胞和細(xì)胞核中Nrf2（0.48±0.02；0.59±0.04）蛋白水平顯著升高（P＜0.01）；與ML385組相比，Casticin+ML385組p-NF-κB p65（0.41±0.02）和Keap1（0.47±0.02）蛋白水平顯著降低（P＜0.01），細(xì)胞和細(xì)胞核中Nrf2（0.41±0.02；0.54±0.01）蛋白水平顯著升高（P＜0.01）。

圖4 CAS對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE 通路的影響Fig.4 Effects of CAS on NF-κB-KEAP1-NRF2/ARE pathway in lipopolysaccharide-induced BEAS-2B cells

3 討論

慢性氣道炎癥性疾病的病死率較高，僅次于心腦血管疾病和惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的生命健康安全［15］。炎癥機(jī)制是引起COPD和哮喘等慢性氣道炎癥性疾病的主要機(jī)制［16-17］。炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的炎癥可影響肺實(shí)質(zhì)和氣道，引起肺組織結(jié)構(gòu)的變化，并使氣道變得狹窄。炎癥細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等參與氣道的慢性炎癥過程，釋放大量的炎癥因子，這些炎癥因子可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的功能，從而影響氣道炎癥反應(yīng)［18］。研究表明，CAS的藥理作用主要有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗催乳素等，可以抑制炎癥因子的釋放從而發(fā)揮抗炎的作用［19］。諸多研究表明CAS在治療肺疾病方面有著一定的作用。WANG等［20］發(fā)現(xiàn)CAS能抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷，LEE等［21］也發(fā)現(xiàn)CAS能改善吸煙導(dǎo)致的小鼠急性肺炎癥狀，但其機(jī)制尚不明確。因此，本研究以BEAS-2B細(xì)胞為研究對(duì)象，利用脂多糖構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型，探究CAS治療慢性氣道炎癥性疾病的可能機(jī)制。

細(xì)胞凋亡是一種非常嚴(yán)格的程序性細(xì)胞死亡，能夠去除機(jī)體不需要的細(xì)胞或者異常細(xì)胞，有重要的生物學(xué)意義。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在COPD等的發(fā)病過程中具有重要的作用［22］。本研究發(fā)現(xiàn)CAS可以降低細(xì)胞凋亡率，提示CAS具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證CAS對(duì)炎癥反應(yīng)的影響，本研究檢測(cè)了CAS對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示CAS能夠降低炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ的含量，表明CAS能夠緩解氣道炎癥反應(yīng)。

NF-κB在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等過程中具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)黨參多糖能夠下調(diào)NFκB mRNA表達(dá)，減輕COPD大鼠氣道炎癥反應(yīng)［23］。核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子-2（Nrf2）廣泛存在于多個(gè)器官和組織，在肺泡巨噬細(xì)胞和肺部上皮細(xì)胞中高表達(dá)。Nrf2信號(hào)通路核心分子包括Nrf2、Kelch樣ECH相關(guān)蛋白-1（Keap1）和抗氧化反應(yīng)元件（ARE）。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的主要機(jī)制，在正常生理狀態(tài)下，Nrf2被Keap1隔離在細(xì)胞質(zhì)中，一旦發(fā)生氧化應(yīng)激，Keap1就會(huì)釋放Nrf2，使其進(jìn)入細(xì)胞核與ARE結(jié)合，發(fā)揮抗氧化和抗炎的作用［24］。近年來發(fā)現(xiàn)多種中醫(yī)藥提取物和方劑能夠通過調(diào)控Nrf2信號(hào)通路達(dá)到緩解COPD過程中炎癥或者氧化應(yīng)激的目的［25-27］。研究表明，Keap1不僅能調(diào)節(jié)Nrf2，還能調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，兩條通路間具有相互作用［28］。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)CAS能夠緩解氣道炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與NF-κB-Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果，又利用ML385（Nrf2抑制劑）處理細(xì)胞，結(jié)果顯示CAS仍能緩解抑制Nrf2所引起損傷，降低細(xì)胞凋亡率和炎癥因子的含量，這表明CAS是通過調(diào)節(jié)Nrf2信號(hào)通路來發(fā)揮緩解氣道炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，CAS可減輕氣道炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與CAS調(diào)控NF-κB-Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路有關(guān)。