范彩霞 張宗林 伏瑤 姜紅 （.臨沂市人民醫(yī)院臨床藥理研究中心，臨沂 76000；.臨沂市人民醫(yī)院藥學(xué)部，臨沂 76000； .臨沂市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，臨沂 76000）

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia，SP）是定植于人體上呼吸道的革蘭陽性雙球菌，人體免疫力減退時(shí)可感染肺泡上皮細(xì)胞，導(dǎo)致其損傷凋亡，是引發(fā)社區(qū)獲得性肺炎的主要致病原因，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起敗血癥［1-2］。機(jī)體免疫系統(tǒng)參與介導(dǎo)SP對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的感染過程，免疫細(xì)胞活化引發(fā)促炎因子與抗炎因子表達(dá)失衡，導(dǎo)致持續(xù)性炎癥和高水平氧化應(yīng)激，是肺泡上皮細(xì)胞受損的主要病理基礎(chǔ)，抗炎、抗氧化治療是減輕肺泡上皮細(xì)胞損傷，改善SP所致肺炎的有效方法［3-4］。沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1（sirtuin 1，Sirt1）生物學(xué)作用廣泛，與細(xì)胞衰老、自噬、增殖、凋亡等密切相關(guān)，可通過激活5'-磷酸腺苷激活的蛋白激酶（5'-AMP activated protein kinase，AMPK）信號(hào)促進(jìn)自噬，降低氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制炎癥，減輕糖尿病引發(fā)的腎損傷，還可激活核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）信號(hào)減輕肺組織炎癥和氧化應(yīng)激，緩解過敏性氣道炎癥，因此Sirt1與AMPK/Nrf2是防治SP所致肺炎的潛在作用靶點(diǎn)［5-6］。金合歡素是廣泛存在于天然植物的黃酮類化合物，具有多重藥理功效，如廣譜抗菌消炎、減輕過氧化與應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)免疫功能等，是治療新冠肺炎中藥方劑黃芪六君子湯的關(guān)鍵成分，可通過激活Sirt1/AMPK信號(hào)減輕氧化應(yīng)激、凋亡和炎癥反應(yīng)，治療心肌肥厚，可作為防治SP所致肺炎的潛在藥物［7-9］。本研究通過SP感染體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞，探討金合歡素通過調(diào)節(jié)Sirt1介導(dǎo)的AMPK/Nrf2信號(hào)通路對(duì)SP感染引起的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺泡上皮細(xì)胞A549（STR鑒定正確，貨號(hào)：CL-0016）、胎牛血清（貨號(hào)：164210-500）、Ham's F-12K（貨號(hào)：PM150910）、青-鏈霉素（貨號(hào)：PB180120）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；SP（貨號(hào)：6978）購自寧波明舟生物科技有限公司；SOD活性檢測試劑盒（貨號(hào)：ab65354）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（貨號(hào)：ab238537）、兔源Ki-67一抗（貨號(hào)：ab92742）、CCK-8檢測試劑盒（貨號(hào)：ab228554）、兔源Bax一抗（貨號(hào)：ab32503）、兔源caspase-9一抗（貨號(hào)：ab32539）、BCA試劑盒（貨號(hào)：ab102536）、人IL-1β、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒（貨號(hào)：ab214025、ab229436、ab181421）購自美國Abcam公司；兔源Sirt1一抗（貨號(hào)：2496T）、兔源PCNA一抗（貨號(hào)：13110T）、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（貨號(hào)：V13242）購自美國Cell Signaling Technology公司；ROS檢測試劑盒（貨號(hào)：S0033S）、兔源GAPDH一抗（貨號(hào)：AF1186）、RIPA裂解液（貨號(hào)：P0013K）、兔源AMPK一抗（貨號(hào)：AF6195）、兔源p-AMPK一抗（貨號(hào)：AF5908）、兔源Nrf2一抗（貨號(hào)：AF7623）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（貨號(hào)：A0208）購自上海碧云天公司；SpectraMaxM5多功能酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器有限公司；DYCZ-24KF電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；MiniBlotTM蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自上海碧云天公司；MoFlo AstriosEQ流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞損傷模型構(gòu)建及金合歡素最佳作用濃度篩選 37 ℃水浴快速融化A549細(xì)胞，培養(yǎng)基（Ham's F-12K+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素）復(fù)蘇培養(yǎng)，SP菌株以血平板培養(yǎng)，制成1×108CFU/ml菌液，傳代后的A549細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)12 h，以終濃度0、5、25、50、100、150、200 μmol/L的金合歡素處理細(xì)胞48 h［10］，每個(gè)濃度設(shè)6孔，并選6孔不接種細(xì)胞做空白對(duì)照，未以金合歡素處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，以終濃度1×108CFU/ml SP菌液感染細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞損傷模型［11］，24 h后加入CCK-8處理1 h，酶標(biāo)儀測量450 nm波長下各孔吸光度（A），細(xì)胞活力（%）=（A藥物處理組-A空白對(duì)照組）（/A對(duì)照組-A空白對(duì)照組）×100%，篩選金合歡素最佳作用濃度。

1.2.2 分組處理細(xì)胞及標(biāo)本收集 取傳代的A549細(xì)胞接種于24孔板培養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、金合歡素組、EX527組、金合歡素+EX527組。細(xì)胞生長12 h后，金合歡素組以終濃度150 μmol/L金合歡素處理；EX527組細(xì)胞以終濃度40 μmol/L Sirt1抑制劑EX527處理［12］；金合歡素+EX527組細(xì)胞以終濃度150 μmol/L金合歡素處理，同時(shí)以終濃度40 μmol/L EX527處理；對(duì)照組和模型組細(xì)胞不做處理，各組均處理48 h，除對(duì)照組外，其余各組以終濃度1×108CFU/ml SP菌液感染細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，繼續(xù)培養(yǎng)24 h分別收集各組細(xì)胞和各組細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.3 檢測各組細(xì)胞增殖和凋亡 取傳代培養(yǎng)的A549細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)12 h，以1.2.2方法分組處理，CCK-8檢測各組細(xì)胞活力，步驟同1.2.1。取1.2.2收集的各組細(xì)胞，PBS重懸，加入Annexin V-FITC和PI避光孵育，離心后洗滌細(xì)胞沉淀，再次PBS重懸混勻后流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 各組細(xì)胞ROS、MDA、SOD、LDH水平及其產(chǎn)生的IL-10、IL-1β、TNF-α水平檢測 取1.2.2收集的各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰水浴中提取總蛋白，離心，BCA測量上清中總蛋白濃度，各組取0.2 ml，采用試劑盒測定ROS、MDA、SOD、LDH水平，剩余蛋白樣品用于免疫印跡檢測。取1.2.2收集的各組細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后各組取0.2 ml上清，采用試劑盒測定其中IL-10、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.5 測定各組細(xì)胞Sirt1蛋白、增殖、凋亡相關(guān)蛋白、AMPK/Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.2.4中各組剩余的蛋白樣品20 μg，變性（100 ℃煮沸5 min）、電泳（120 V恒壓80 min）、濕轉(zhuǎn)（120 V恒壓90 min）、3%牛血清白蛋白封閉（37.5 ℃孵育2 h），剪下目的蛋白Ki-67、PCNA、caspase-9、Bax、Sirt1、p-AMPK、GAPDH、AMPK、Nrf2，孵育兔源一抗（4 ℃孵育10 h）、洗滌（TBST洗3次，5 min/次）、孵育二抗（37.5 ℃孵育2.5 h）、洗滌（TBST洗3次，5 min/次）、顯影（化學(xué)發(fā)光法）、拍照，Image J軟件定量各蛋白灰度并計(jì)算其與內(nèi)參GAPDH的比值，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可得各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均以±s表示，計(jì)量數(shù)據(jù)利用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較行t檢驗(yàn)；組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金合歡素對(duì)SP感染的A549細(xì)胞增殖的影響 金合歡素可促進(jìn)SP感染的A549細(xì)胞生長增殖，一定濃度范圍內(nèi)，濃度越高，細(xì)胞活力越強(qiáng)，濃度達(dá)到150 μmol/L時(shí)，A549細(xì)胞生長進(jìn)入平臺(tái)期，幾乎不再促進(jìn)其增殖（圖1），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇150 μmol/L金合歡素處理SP感染的A549細(xì)胞。

圖1 不同濃度金合歡素對(duì)SP感染的A549細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of different concentration of acacetin on activity of A549 cells infected by SP

2.2 金合歡素對(duì)各組A549細(xì)胞增殖與凋亡的影響 與對(duì)照組比較，模型組A549細(xì)胞活力降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）。與模型組、金合歡素+EX527組分別比較，金合歡素組A549細(xì)胞活力均升高（P＜0.05），凋亡率均降低（P＜0.05）；EX527組A549細(xì)胞活力均降低（P＜0.05），凋亡率均升高（P＜0.05，圖2、表1）。

表1 各組A549細(xì)胞活力與凋亡率（±s，n=6）Tab.1 Viability and apoptosis rate of A549 cells in each group （±s，n=6）

表1 各組A549細(xì)胞活力與凋亡率（±s，n=6）Tab.1 Viability and apoptosis rate of A549 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with acacetin+EX527 group，3）P＜0.05.

Groups Control Model Acacetin EX527 Acacetin+EX527 Cell viability/%Apoptosis rate/%2.07±0.30 61.48±5.051）12.02±2.622）3）80.79±10.132）3）56.03±7.11 100.00±0.00 40.75±8.021）89.91±10.342）3）21.86±3.522）3）45.14±8.47

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡Fig.2 Apoptosis of A549 cells detected by flow cytometry

2.3 金合歡素對(duì)各組A549細(xì)胞SOD、LDH、ROS水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組A549細(xì)胞SOD水平降低（P＜0.05），MDA、LDH與ROS水平升高（P＜0.05）。與模型組、金合歡素+EX527組分別比較，金合歡素組A549細(xì)胞SOD水平均升高（P＜0.05），MDA、LDH與ROS水平均降低（P＜0.05）；EX527組A549細(xì)胞SOD水平均降低（P＜0.05），MDA、LDH與ROS水平均升高（P＜0.05，表2）。

表2 各組A549細(xì)胞SOD、LDH與ROS水平（±s，n=6）Tab.2 SOD， LDH and ROS levels of A549 cells in each group （±s，n=6）

表2 各組A549細(xì)胞SOD、LDH與ROS水平（±s，n=6）Tab.2 SOD， LDH and ROS levels of A549 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with acacetin+EX527 group，3）P＜0.05.

ROS/（U·kg-1·prot-1）0.74±0.13 7.16±1.311）1.03±0.222）3）11.45±1.522）3）6.72±1.09 Groups Control Model Acacetin EX527 Acacetin+EX527 SOD/（U·kg-1·prot-1）12.71±1.62 4.85±0.411）10.43±1.222）3）1.69±0.532）3）5.56±0.70 MDA（mmol·ml-1）2.26±0.18 6.89±0.271）2.84±0.232）3）8.62±0.312）3）6.02±0.21 LDH/（U·L-1）0.57±0.16 1.43±0.241）0.71±0.202）3）2.12±0.252）3）1.26±0.17

2.4 金合歡素對(duì)各組A549細(xì)胞產(chǎn)生IL-10、IL-1β、TNF-α水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組A549細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的水平降低（P＜0.05），IL-1β與TNF-α水平升高（P＜0.05）。與模型組、金合歡素+EX527組分別比較，金合歡素組A549細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的水平升高（P＜0.05），IL-1β與TNF-α水平均降低（P＜0.05）；EX527組A549細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的水平均降低（P＜0.05），IL-1β與TNF-α水平均升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組A549細(xì)胞產(chǎn)生IL-10、IL-1β、TNF-α的水平（±s，n=6，pg/ml）Tab.3 IL-10， IL-1β and TNF-α levels produced by A549 cells in each group （±s，n=6，pg/ml）

表3 各組A549細(xì)胞產(chǎn)生IL-10、IL-1β、TNF-α的水平（±s，n=6，pg/ml）Tab.3 IL-10， IL-1β and TNF-α levels produced by A549 cells in each group （±s，n=6，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with acacetin+EX527 group，3）P＜0.05.

TNF-α 130.52±20.30 494.65±46.181）141.03±24.612）3）675.93±60.352）3）480.74±50.16 Groups Control Model Acacetin EX527 Acacetin+EX527 IL-10 280.73±30.14 52.69±5.211）267.12±32.352）3）18.31±4.232）3）60.45±6.17 IL-1β 23.79±5.14 96.85±11.021）29.83±4.912）3）152.78±17.352）3）87.96±12.03

2.5 金合歡素對(duì)各組A549細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67與PCNA表達(dá)降低（P＜0.05），凋亡相關(guān)蛋白caspase-9與Bax表達(dá)升高（P＜0.05）。與模型組、金合歡素+EX527組分別比較，金合歡素組A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67與PCNA表達(dá)均升高（P＜0.05），凋亡相關(guān)蛋白caspase-9與Bax表達(dá)均降低（P＜0.05）；EX527組A549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67與PCNA表達(dá)均降低（P＜0.05），凋亡相關(guān)蛋白caspase-9與Bax表達(dá)均升高（P＜0.05，圖3、表4）。

表4 各組A549細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（±s，n=6）Tab.4 Proliferation and apoptosis related proteins expressions of A549 cells in each group （±s，n=6）

表4 各組A549細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（±s，n=6）Tab.4 Proliferation and apoptosis related proteins expressions of A549 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with acacetin+EX527 group，3）P＜0.05.

Groups Control Model Acacetin EX527 Acacetin+EX527 Ki-67/GAPDH PCNA/GAPDH caspase-9/GAPDH Bax/GAPDH 0.32±0.05 1.05±0.171）0.41±0.102）3）1.82±0.232）3）0.97±0.14 0.78±0.10 0.39±0.041）0.72±0.122）3）0.11±0.022）3）0.43±0.07 0.94±0.13 0.45±0.091）0.88±0.162）3）0.16±0.042）3）0.50±0.08 0.51±0.07 1.26±0.191）0.60±0.062）3）1.79±0.202）3）1.17±0.18

圖3 免疫印跡檢測各組細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Western blot detects expressions of cell proliferation and apoptosis related proteins in each group

2.6 金合歡素對(duì)各組A549細(xì)胞Sirt1與AMPK/Nrf2信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組A549細(xì)胞p-AMPK/AMPK、Sirt1與Nrf2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組、金合歡素+EX527組分別比較，金合歡素組A549細(xì)胞p-AMPK/AMPK、Sirt1與Nrf2蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）；EX527組A549細(xì)胞p-AMPK/AMPK、Sirt1與Nrf2蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05，圖4、表5）。

表5 各組A549細(xì)胞Sirt1與AMPK/Nrf2信號(hào)通路蛋白表達(dá)（±s，n=6）Tab.5 Sirt1 and AMPK/Nrf2 signaling pathway proteins expressions in A549 cells of each group （±s，n=6）

表5 各組A549細(xì)胞Sirt1與AMPK/Nrf2信號(hào)通路蛋白表達(dá)（±s，n=6）Tab.5 Sirt1 and AMPK/Nrf2 signaling pathway proteins expressions in A549 cells of each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with acacetin+EX527 group，3）P＜0.05.

Nrf2/GAPDH 1.13±0.21 0.52±0.101）1.02±0.172）3）0.22±0.042）3）0.59±0.09 Groups Control Model Acacetin EX527 Acacetin+EX527 Sirt1/GAPDH 0.82±0.10 0.41±0.061）0.77±0.122）3）0.13±0.032）3）0.46±0.05 p-AMPK/AMPK 0.96±0.13 0.47±0.071）0.90±0.142）3）0.15±0.042）3）0.51±0.06

圖4 免疫印跡檢測各組A549細(xì)胞Sirt1與AMPK/Nrf2信號(hào)通路蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot detects expressions of Sirt1 and AMPK/Nrf2 signaling pathway proteins in A549 cells of each group

3 討論

SP感染所致肺炎發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響患者的工作和日常活動(dòng)，降低其生活質(zhì)量，已成為我國急需解決的公共衛(wèi)生問題，抗生素治療是臨床常選策略，但因抗藥性對(duì)部分患者療效不佳，研發(fā)非抗生素類藥物更有臨床價(jià)值［13-14］。作為人類呼吸道的天然定植菌，SP感染上皮細(xì)胞可激活機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥基因表達(dá)，打破氧化還原穩(wěn)態(tài)，引發(fā)持續(xù)炎癥與氧化應(yīng)激，損傷肺泡上皮細(xì)胞，是造成肺炎的主要病理基礎(chǔ)，抑制SP感染的肺泡上皮細(xì)胞炎癥和凋亡是防治SP肺炎的良好途徑［15-16］。本文以SP感染A549細(xì)胞模擬以上病理過程，結(jié)果顯示A549細(xì)胞被SP感染后，產(chǎn)生的抗炎因子IL-10及抗氧化酶SOD水平明顯降低，促炎因子IL-1β、TNF-α水平與ROS水平明顯升高，引發(fā)強(qiáng)烈炎癥及高水平氧化應(yīng)激，導(dǎo)致MDA、LDH水平升高，最終造成細(xì)胞活力降低、損傷凋亡，揭示細(xì)胞損傷模型建立成功，可在細(xì)胞水平模擬SP肺炎病理過程。

金合歡素是金合歡樹、黃芩、菊花等天然植物中提取純化的化合物，是一種天然抗炎抗氧化劑，在柴胡-黃芩治療COVID-19所致肺炎過程中發(fā)揮重要作用，可通過調(diào)控TNF、IL-17等炎癥信號(hào)抑制炎癥和細(xì)胞凋亡、減輕肺損傷［7，17］。本實(shí)驗(yàn)以金合歡素處理SP感染的A549細(xì)胞，可提高細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎因子IL-10及抗氧化酶SOD水平，降低促炎因子IL-1β、TNF-α、MDA水平與ROS水平，拮抗炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生發(fā)展，增強(qiáng)細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，改善細(xì)胞損傷，提示金合歡素可通過抗炎與抗氧化功效減輕SP感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷。

AMPK/Nrf2是調(diào)控機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)與炎癥基因表達(dá)的重要信號(hào)途徑，促進(jìn)其傳導(dǎo)可減少促炎因子釋放、降低氧化應(yīng)激和炎癥水平，抑制肺細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕鉛誘導(dǎo)的肺損傷［18］。Sirt1也是一種重要的炎癥調(diào)控分子，可通過抑制NF-κB信號(hào)減輕神經(jīng)炎癥，還可激活A(yù)MPK和Nrf2信號(hào)清除ROS，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用［19-20］。本研究結(jié)果顯示，SP感染的A549細(xì)胞p-AMPK/AMPK、Sirt1、Nrf2蛋白表達(dá)均明顯降低，Sirt1抑制劑EX527處理可促進(jìn)炎癥與氧化應(yīng)激發(fā)展，加重細(xì)胞損傷，說明Sirt1通過調(diào)控AMPK/Nrf2信號(hào)介導(dǎo)SP感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金合歡素可提高SP感染的A549細(xì)胞p-AMPK/AMPK、Sirt1、Nrf2蛋白表達(dá)，金合歡素與EX527聯(lián)合處理SP感染的A549細(xì)胞可降低金合歡素的抗炎、抗氧化功效，減弱其對(duì)A549細(xì)胞凋亡的抑制作用，逆轉(zhuǎn)金合歡素的細(xì)胞保護(hù)作用，揭示金合歡素減輕SP感染引發(fā)的A549細(xì)胞損傷是通過上調(diào)Sirt1表達(dá)，激活A(yù)MPK/Nrf2信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。

總之，本實(shí)驗(yàn)證明金合歡素可通過上調(diào)Sirt1表達(dá)促進(jìn)AMPK/Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而提高抗炎因子及抗氧化酶水平，降低促炎因子水平，減弱氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，最終增強(qiáng)肺泡上皮細(xì)胞活力，抑制其損傷凋亡，通過介導(dǎo)Sirt1激活A(yù)MPK/Nrf2信號(hào)是其分子機(jī)制之一。本研究揭示金合歡素可作為防治SP肺炎的候選藥物，在臨床治療中具有很好的發(fā)展前景。