余 歡,李 輝,陳友波,石鈺仕,趙德鵬,龍 霞,譚啟松

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

肌苷酸(inosine monophosphate, IMP)作為眾多畜禽肉質(zhì)風(fēng)味評(píng)價(jià)指標(biāo)之一,其含量是目前衡量肉類新鮮程度的重要指標(biāo),是公認(rèn)的影響肌肉風(fēng)味的重要物質(zhì)。IMP來(lái)源是2個(gè)體內(nèi)合成途徑和三磷酸腺苷的分解過(guò)程,合成途徑包括以氨基酸、磷酸核糖、一碳單位和CO2等原料為主的從頭合成途徑[1]和體內(nèi)嘌呤核苷或游離嘌呤合成IMP的補(bǔ)救途徑[2]。腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase,ADSL)是IMP合成酶系中催化合成嘌呤核苷酸起始合成與循環(huán)中的唯一雙功能酶[3],是畜禽體內(nèi)IMP合成的關(guān)鍵酶。因此,編碼腺苷琥珀酸裂解酶的ADSL基因被認(rèn)為是影響肌肉IMP含量的主效基因[4]。相關(guān)研究表明,ADSL基因與畜禽IMP含量具有顯著相關(guān)性[5-7]。張梅[8]對(duì)玫瑰冠雞的研究結(jié)果表明,ADSL基因的表達(dá)與肌肉的IMP含量呈顯著正相關(guān)。劉長(zhǎng)青等[9]用熒光定量PCR檢測(cè)了ADSL基因在北京油雞的心、肝、脾、肺、腎、腿肌、胸肌和腦等組織的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,ADSL基因在胸肌中表達(dá)水平最高。Yuan等[10]研究顯示,草魚ADSL基因在肌肉中的表達(dá)水平最高,而在魚鰓中表達(dá)量最低。以上研究表明,ADSL基因與畜禽肉質(zhì)相關(guān),其表達(dá)水平在不同組織中均有差異,但是其在肌肉中明顯高表達(dá)。目前,關(guān)于ADSL蛋白對(duì)肌肉風(fēng)味的影響機(jī)制報(bào)道較少。

赤水烏骨雞,又名“竹香雞”,原產(chǎn)于貴州省赤水市,因其肉質(zhì)鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富,受到廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。本研究以赤水烏骨雞為對(duì)象,采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)聯(lián)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析,篩選出與雞ADSL蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白,并進(jìn)行互作蛋白的生物信息學(xué)分析,旨在為進(jìn)一步深入探究雞ADSL基因在肌肉的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

pEGFP-C1質(zhì)粒來(lái)自貴州大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,細(xì)胞來(lái)源為本課題組保存的原代細(xì)胞,大腸埃希菌感受態(tài)TOP10細(xì)胞購(gòu)自貴州宏達(dá)爾生物科技有限公司,ADSL基因的干擾載體為本課題組前期構(gòu)建、保存[11]。

1.2 主要試劑

DNA凝膠回收試劑盒和無(wú)內(nèi)毒素小提中量試劑盒-離心柱型購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司;4%多聚甲醛、1×RIPA裂解液(弱)、TriX-100通透液、蛋白酶抑制劑(PMSF)、1×PBS緩沖液、脫脂奶粉、DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;兔抗綠色熒光蛋白(GFP)單克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司(美國(guó));辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的親和山羊抗兔抗體(H+L)購(gòu)自ABclonal公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、T4 DNA連接酶、DNA Marker、PfuTaqDNA高保真聚合酶、限制性內(nèi)切酶(XhoⅠ和EcoRⅠ)、Pierce經(jīng)典磁珠式免疫沉淀試劑盒、LipofectamineTM 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司;細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑使用Neofect DNA轉(zhuǎn)染試劑盒;細(xì)胞核染料DAPI、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)和ECL發(fā)光顯色液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司;聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司;TRIzol購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Opti-MEMTM購(gòu)自貴州格瑞恩公司;anti-desmin、山羊抗兔IgG-cy3購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 雞ASDL基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

根據(jù)NCBI網(wǎng)站的雞ADSL基因序列(基因登錄號(hào):NM_205529.2),利用primer 5.0軟件篩選出酶切位點(diǎn)(XhoⅠ和EcoRⅠ),根據(jù)ADSL基因的蛋白質(zhì)編碼序列(coding sequence, CDS)和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(上游引物序列5′-TGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAG-GCATGGCGACCCCCTGCGCCGAGGAGGACCCG-C-3′,帶下劃線的序列是XhoⅠ酶切位點(diǎn);下游引物序列5′-GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCGA-CTGCAGAATTCTTAAAGTGTCAGCTCAATTTTC-CCACCCATCAT-3′,帶下劃線的序列是EcoRⅠ酶切位點(diǎn)),由北京擎科生物科技股份有限公司合成相關(guān)引物。

提取赤水烏骨雞成肌細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,擴(kuò)增ADSL基因。利用無(wú)縫克隆試劑盒將純化后的PCR產(chǎn)物和酶切后的pEGFP-C1表達(dá)載體連接并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸埃希菌感受態(tài)TOP10細(xì)胞中。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性單克隆菌種的質(zhì)粒DNA,進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

復(fù)蘇赤水烏骨雞成肌細(xì)胞,使用Desmin抗體對(duì)成肌細(xì)胞的肌間線蛋白(desmin)進(jìn)行鑒定。在含5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中,用含15%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基(添加1%青霉素和1%鏈霉素)在六孔板中培養(yǎng)赤水烏骨雞成肌細(xì)胞,當(dāng)六孔板中的成肌細(xì)胞密度生長(zhǎng)到80%左右,棄去原有的培養(yǎng)基,加入無(wú)菌1×PBS沖洗3次;每孔加入800 μL預(yù)冷的4%多聚甲醛后固定30 min,清洗3次后加入800 μL 0.2%(體積分?jǐn)?shù))的Triton X-100溶液,室溫孵育15 min;清洗3次后加入200 μL稀釋的山羊血清(稀釋比1∶500,每孔),37 ℃封閉30 min;清洗3次后加入100 μL一抗Desmin(1∶500稀釋),4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜。棄掉一抗清洗3次,在避光的暗室,加入100 μL Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG-Cy3(1∶500稀釋),37 ℃孵育1 h。清洗3次后加入200 μL DAPI細(xì)胞核染料,室溫孵育5～7 min,再次清洗3次,最后加入600 μL抗熒光猝滅劑,在熒光倒置顯微鏡下觀測(cè)。

1.5 轉(zhuǎn)染和融合蛋白的Wester blot檢測(cè)

將成肌細(xì)胞置于細(xì)胞六孔板中,用含15%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基,置于37 ℃,在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右,提前2 h將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基更換成同等濃度不含雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基。將2 μg提取的質(zhì)粒DNA用100 mL OPTI-MEM溶液稀釋,充分混勻;向混合液中加入2 μL Neofect DNA轉(zhuǎn)染試劑,混勻后,室溫靜置15～30 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

將pEGFP-C1和pEGFP-C1-ADSL轉(zhuǎn)染后的成肌細(xì)胞用PBS清洗3次,加入1×RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解,裂解30 min后,使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞,4 ℃、12 000×g離心10 min,收集細(xì)胞總蛋白。加入適量的蛋白上樣緩沖液,煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離。通過(guò)濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(BIO-RAD,美國(guó))將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用含TBST(TBS+Tween)的5%脫脂奶粉封閉2 h;棄掉液體,加入anti-GFP兔單克隆抗體,4 ℃搖床過(guò)夜孵育;用TBST溶液清洗3次后,加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L),室溫孵育1.5 h;用TBST溶液清洗3次后,使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色并拍照。

1.6 重組蛋白的亞細(xì)胞定位分析

將轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1-ADSL的成肌細(xì)胞用PBS洗3次,依次加入預(yù)冷的4%多聚甲醛,室溫固定30 min,然后用3% Triton X-100通透處理10 min,再用PBS清洗3次,加入稀釋后的DAPI細(xì)胞核染料,靜置8 min后用PBS清洗3次,最后置于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。將獲得的熒光圖片用Photoshop CS6進(jìn)行合并(merge)處理,以熒光共定位的方法來(lái)確定重組蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1.7 免疫共沉淀

把成肌細(xì)胞接種于六孔板,待細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí),分別將pEGFP-C1-ADSL和pEGFP-C1轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h,用PBS清洗細(xì)胞3次,然后用免疫沉淀裂解緩沖液裂解細(xì)胞,4 ℃、13 000×g離心10 min后,收集上清液,向每個(gè)樣品中加入10 μg anti-GFP兔單克隆抗體,混合均勻后在4 ℃過(guò)夜。向樣品中加入25 μL Pierce蛋白A/G,混勻后室溫孵育1 h。用磁力架收集磁珠,經(jīng)過(guò)免疫沉淀裂解緩沖液清洗磁珠3次后,加入500 μL超純水輕柔混勻,棄上清液。重復(fù)2次后,向磁珠中加入100 μL蛋白上樣緩沖液,室溫靜置10 min,分離磁珠,保留上清液。

1.8 LC-MS/MS分析

蛋白質(zhì)復(fù)合物送至金開(kāi)瑞生物工程有限公司(武漢)用于LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定。將蛋白樣品進(jìn)行還原烷基化和酶解處理,酶解產(chǎn)生的多肽用C18柱子除鹽,抽干后用15 μL上樣緩沖液(含0.1%甲酸和3%乙腈)溶解多肽,上LC-MS/MS(ekspertTM nanoLC,AB Sciex TripleTOF5600-plus)儀器進(jìn)行分析,LC-MS/MS下機(jī)后,將原始下機(jī)數(shù)據(jù)提交到Proteinpilot 5.0 (Applied Biosystems,Sciex)軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。在設(shè)置可信度conf≥95%、unique peptides≥1時(shí),檢測(cè)樣品中所含蛋白質(zhì)的種類與數(shù)量。

1.9 細(xì)胞蛋白的生物信息學(xué)分析

利用維恩圖(Venn圖)在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制C1標(biāo)簽組和C1-ADSL重組蛋白組交集的蛋白數(shù)量;利用在線網(wǎng)站UniProt (https://www.uniprot.org)進(jìn)行蛋白的基因本體(gene ontology, GO)注釋(包含生物學(xué)進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能);利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genom e.jp/kegg/mappe r.html)分析蛋白參與的信號(hào)通路;利用STRING Version 11.0在線網(wǎng)站(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。

1.10 ADSL基因與相關(guān)基因之間的調(diào)控表達(dá)研究

根據(jù)生物信息學(xué)分析,篩選出RPL4、PDLIM5、ACTG1、SRSF10這4個(gè)基因,設(shè)計(jì)這些基因的特異性引物,通過(guò)在成肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ADSL過(guò)表達(dá)載體和用LipofectamineTM 3000 轉(zhuǎn)染ADSL干擾載體后(方法參考說(shuō)明書),檢測(cè)ADSL過(guò)表達(dá)和沉默狀態(tài)下成肌細(xì)胞中RPL4、PDLIM5、ACTG1和SRSF10的表達(dá)情況,探究ADSL基因與它們之間的調(diào)控關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞ADSL基因重組真核表達(dá)載體的鑒定

以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,使用特異性引物PCR擴(kuò)增雞ADSL基因的CDS,利用無(wú)縫克隆技術(shù)導(dǎo)入pEGFP-C1載體質(zhì)粒中。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示,目的片段長(zhǎng)度為1 495 bp(圖1-A),與預(yù)期結(jié)果一致。對(duì)pEGFP-C1-ADSL載體進(jìn)行XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切,結(jié)果顯示,pEGFP-C1-ADSL酶切后分別獲1 495 bp和4 686 bp的目的基因條帶,與預(yù)測(cè)大小一致(圖1-B)。測(cè)序結(jié)果表明,雞ADSL基因重組真核表達(dá)載體pEGFP-C1-ADSL構(gòu)建成功。

A,雞ADSL基因的PCR擴(kuò)增圖;B,重組真核表達(dá)載體雙酶切鑒定圖,其中1號(hào)泳道為pEGFP-C1質(zhì)粒,2號(hào)泳道為重組質(zhì)粒pEGFP-C1-ADSL的雙酶切。M為DNA marker。A, PCR amplification plot of chicken ADSL gene; B, double-enzyme identification plot of recombinant eukaryotic expression vector. In which, lane 1 was tpEGFP-C1 plasmid, lane 2 was the biallelic graph of recombinant plasmid pEGFP-C1-ADSL. M was DNA marker.圖1 雞ADSL基因PCR擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 PCR amplification of chicken ADSL gene and double digestion identification of recombinant plasmids

2.2 雞成肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

對(duì)赤水烏骨雞成肌細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定,結(jié)果如圖2所示:圖2-A是明場(chǎng)下的赤水烏骨雞成肌原代細(xì)胞;圖2-B是使用DAPI進(jìn)行核染后的赤水烏骨雞成肌細(xì)胞,可見(jiàn)細(xì)胞核顏色為明亮的藍(lán)色;圖2-C為使用一抗與成肌細(xì)胞進(jìn)行孵育,一抗與成肌細(xì)胞中的desmin(肌間線蛋白)相結(jié)合,再與二抗(Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG-Cy3)發(fā)生作用后,進(jìn)行熒光檢測(cè)可見(jiàn)成肌細(xì)胞被染為明亮的紅色,圖2-D是圖2-B與圖2-C的疊加圖,可見(jiàn)紅色部分為成肌細(xì)胞中的desmin,表明成功復(fù)蘇赤水烏骨雞成肌細(xì)胞。

A,明場(chǎng)圖;B,DAPI核染圖;C,一抗反應(yīng)熒光圖;D,B與C的疊加。A, Bright-field picture; B, DAPI nuclear staining picture; C, Fluorescence plot of primary antibody reaction; D, Superimposition of B and C.圖2 赤水烏骨雞成肌細(xì)胞鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of myoblasts of Chishui black-bone chicken

2.3 雞ADSL基因在細(xì)胞中的表達(dá)

將pEGFP-C1和pEGFP-C1-ADSL轉(zhuǎn)染赤水烏骨雞成肌細(xì)胞后,對(duì)重組蛋白進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,獲得了大小為82 ku左右的pEGFP-C1-ADSL重組蛋白條帶(圖3),與預(yù)測(cè)大小(81.9 ku)相一致。

M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1、2、3號(hào)泳道為pEGFP-C1蛋白印跡圖;4、5、6泳道為pEGFP-C1-ADSL蛋白印跡圖。M was protein marker; Lanes 1, 2, and 3 were pEGFP-C1 protein blots, and lanes 4, 5 and 6 were pEGFP-C1-ADSL protein blots.圖3 pEGFP-C1和pEGFP-C1-ADSL在成肌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)印跡Fig.3 Western blotting of pEGFP-C1 and pEGFP-C1-ADSL in myoblasts

2.4 雞ADSL的亞細(xì)胞定位

對(duì)pEGFP-C1標(biāo)簽蛋白和pEGFP-C1-ADSL重組蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGFP標(biāo)簽蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì),而ADSL蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均存在(圖4)。

圖A、B、C為pEGFP-C1標(biāo)簽蛋白,圖D、E、F為pEGFP-C1-ADSL重組蛋白。綠色是分別用pEGFP-C1和pEGFP-C1-ADSL轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后的發(fā)光效果圖,藍(lán)色是DAPI核染結(jié)果。Figures A, B and C were pEGFP-C1 tag protein, and Figures D, E and F were pEGFP-C1-ADSL recombinant protein. The green color was the luminescence effect of myoblasts transfected with pEGFP-C1 and pEGFP-C1-ADSL respectively, and the blue color was the DAPI nuclear staining result.圖4 pEGFP-C1和pEGFP-C1-ADSL在成肌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of pEGFP-C1 and pEGFP-C1-ADSL in myoblasts

2.5 互作蛋白鑒定

利用LC-MS/MS技術(shù)把與GFP-ADSL重組蛋白和GFP標(biāo)簽蛋白結(jié)合的蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定,在可信度conf≥95、unique peptides≥1時(shí),樣品ADSL(GFP-ADSL)、C1(GFP-C1)質(zhì)譜產(chǎn)生的二級(jí)譜圖數(shù)分別為16 057、13 090,解析的二級(jí)譜圖數(shù)分別為2 616、1 593,分別鑒定出916、598個(gè)肽段數(shù)。另外,3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中至少出現(xiàn)2次的蛋白被視為存在相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與GFP-C1標(biāo)簽相互作用的蛋白有161個(gè),與GFP-ADSL重組蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白有197個(gè)。使用Venn在線軟件分析發(fā)現(xiàn),有94個(gè)蛋白可能與ADSL蛋白存在相互作用關(guān)系(圖5),部分蛋白信息見(jiàn)表1。

表1 與雞ADSL蛋白相互作用的部分蛋白列表Table 1 List of selected proteins interacting with chicken ADSL protein

圖5 pEGFP-C1-ADSL和pEGFP-C1互作蛋白的Venn圖Fig.5 Venn diagram of pEGFP-C1-ADSL and pEGFP-C1 interacting proteins

2.6 GO功能注釋

GO功能注釋表明,大部分互作細(xì)胞蛋白具有多種功能,參與多種細(xì)胞內(nèi)生物反應(yīng)。生物過(guò)程富集結(jié)果表明,它們主要參與細(xì)胞進(jìn)程、生物調(diào)節(jié)和刺激反應(yīng)等生物過(guò)程;細(xì)胞組分分析顯示,這些蛋白主要定位于細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、胞內(nèi)和含蛋白質(zhì)的復(fù)合物上;雞ADSL蛋白富集的分子主要發(fā)揮結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性和催化活性的分子功能(圖6)。

2.7 與雞ADSL蛋白互作的蛋白的KEGG通路分析

利用KEGG信號(hào)通路對(duì)質(zhì)譜鑒定到的互作蛋白進(jìn)行通路富集,獲得的信號(hào)通路見(jiàn)圖7。與雞ADSL蛋白互作的蛋白同時(shí)參與多條信號(hào)通路,主要參與代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程、有機(jī)系統(tǒng)和疾病等信號(hào)通路。

Metabolism,代謝;Genetic information processing,遺傳信息處理;Environmental information processing,環(huán)境信息處理;Cellular processes,細(xì)胞過(guò)程;Organismal systems,有機(jī)系統(tǒng);Human diseases,人類疾病。圖7 與雞ADSL蛋白互作的蛋白的KEGG通路分析Fig.7 KEGG pathway analysis of proteins interacting with chicken ADSL protein

2.8 雞ADSL蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

為研究雞ADSL蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)信息,利用在線軟件STRING繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將上文得到的94個(gè)蛋白導(dǎo)入STRING軟件,發(fā)現(xiàn)有9個(gè)蛋白沒(méi)有相關(guān)信息(圖8-A)。通過(guò)知網(wǎng)查詢與ADSL相關(guān)的基因,引入61個(gè)不在質(zhì)譜數(shù)據(jù)的蛋白,得到由146個(gè)蛋白構(gòu)成的共1 261個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)蛋白互作圖(圖8-B)。為得到更清晰的蛋白信息圖,利用Cytoscape對(duì)該結(jié)果進(jìn)行cytoHubba數(shù)據(jù)優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)圖8-C,圓圈越往內(nèi)表示這些蛋白互作關(guān)系越強(qiáng)烈,顏色越深表示相關(guān)性越強(qiáng)。

A,引入61個(gè)蛋白前;B,引入61蛋白后;C,Cytoscape優(yōu)化后。A, Before the introduction of 61 proteins; B, After the introduction of 61 proteins; C, Cytoscape optimized.圖8 雞ADSL蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 PPI network diagram of chicken ADSL protein

2.9 ADSL基因表達(dá)對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

ADSL基因過(guò)表達(dá)時(shí),成肌細(xì)胞內(nèi)RPL4、PDLIM5基因表達(dá)水平顯著(P<0.05)降低,ACTG1、SRSF10基因表達(dá)水平極顯著(P<0.01)升高(圖9-A);當(dāng)ADSL基因沉默后,成肌細(xì)胞內(nèi)RPL4和ACTG1基因的表達(dá)水平極顯著(P<0.01)上調(diào),PDLIM5、SRSF10基因表達(dá)水平無(wú)顯著變化(圖9-B)。

*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。* and ** meant significant differences at the levels of P<0.05 and P<0.01, respectively.圖9 ADSL基因過(guò)表達(dá)(A)和沉默(B)對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.9 Effect of ADSL gene overexpression (A) and silencing (B) on the expression of related genes

3 討論

ADSL作為調(diào)控家禽IMP的重要候選基因,對(duì)家禽肉質(zhì)品質(zhì)的改良有著重要參考價(jià)值[12]。目前關(guān)于ADSL基因的研究多集中在單核苷酸多態(tài)性和IMP相關(guān)性的研究上,欒德琴[13]的研究表明,雞ADSL基因表達(dá)水平較高,屬于影響IMP沉積的重要基因。ADSL基因主要在肌肉中,尤其是家禽胸肌中高表達(dá)。本研究以赤水烏骨雞成肌細(xì)胞為研究對(duì)象,利用Co-IP聯(lián)合LC-MS/MS的方法,檢測(cè)與雞ADSL相互作用的蛋白,進(jìn)而研究其在胸肌中高表達(dá)的原因與機(jī)制。

真核表達(dá)載體pEGFP-C1是一種自帶綠色熒光的蛋白,可以與目的基因形成融合蛋白,并在真核細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)[14],利用pEGFP-C1來(lái)研究目的基因編碼的蛋白的生物學(xué)功能是現(xiàn)在常用的一種實(shí)驗(yàn)手段。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,赤水烏骨雞pEGFP-C1-ADSL融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。Zhou等[15]通過(guò)在DF-1細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)GFP和GFP-CHBRD2,利用Co-IP聯(lián)合LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定技術(shù),鑒定到233個(gè)與GFP互作的蛋白,414個(gè)與GFP-CHBRD2互作的蛋白;Venn分析發(fā)現(xiàn)只有225個(gè)蛋白與GFP-CHBRD2有互作關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Co-IP聯(lián)合LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定技術(shù),在pEGFP-C1蛋白樣品中鑒定到161個(gè)蛋白,pEGFP-C1-ADSL樣品中鑒定到197個(gè)蛋白,二者之間有103個(gè)共有蛋白,Venn結(jié)果顯示,只有94個(gè)蛋白與pEGFP-C1-ADSL有互作關(guān)系。蛋白質(zhì)之間通過(guò)形成蛋白復(fù)合物在特定的時(shí)空內(nèi)完成特定的功能,研究蛋白質(zhì)相互作用對(duì)于全面揭示蛋白質(zhì)的功能是必要的[16]。這些互作蛋白主要參與代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程、有機(jī)系統(tǒng)和疾病等幾種信號(hào)通路,這些蛋白大部分具有復(fù)合功能,參與多條通路,在多種生物功能中都在發(fā)揮作用。

本次鑒定到12個(gè)蛋白屬于核糖體蛋白家族的成員,它們分別是Rps5、Rps19、Rps20、Rps28、Rps29,以及Rpl4、Rpl5、Rpl21、Rpl26、Rpl31、Rpl18a和Rplp2,它們不但參與蛋白質(zhì)的生物合成,同時(shí)參與細(xì)胞的分裂與分化,對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡也起到重要的調(diào)節(jié)作用[17],對(duì)基因的表達(dá)發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控功能。其次,Actg1、Actn1、Arpc1a、Fn1和Iqgap1參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)。SRSF10能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化,在橫紋肌發(fā)育、成肌細(xì)胞分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用[18],對(duì)肌肉的發(fā)育有著重要意義。在這些蛋白中,Gars[19]、Rap1b[20]、Srsf10[21-22]、Acta1[23-24]、Rpl26[25]、Pdlim5[26]、Actg1[27]、Copb1[28]等蛋白都與畜禽肉質(zhì)風(fēng)味等相關(guān),以上8個(gè)蛋白可能與雞ADSL蛋白存在互作關(guān)系。ADSL基因過(guò)表達(dá)時(shí),RPL4的表達(dá)受到了抑制,將ADSL進(jìn)行沉默以后,RPL4的表達(dá)水平顯著上升,這可能與RPL4的高度保守性有關(guān),表明ADSL與RPL4在赤水烏骨雞成肌細(xì)胞中可能存在反向調(diào)控的關(guān)系。ACTG1不僅位于肌細(xì)胞,也存在在非肌細(xì)胞內(nèi),它不僅參與細(xì)胞分裂,還在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移等活動(dòng)中發(fā)揮功能。ADSL處于過(guò)表達(dá)和沉默時(shí),ACTG1的表達(dá)均表現(xiàn)為上調(diào),ADSL作為調(diào)控風(fēng)味的主效基因在肌肉中出現(xiàn)了高表達(dá)的現(xiàn)象,當(dāng)ADSL過(guò)表達(dá)時(shí),ACTG1表達(dá)上調(diào),當(dāng)ADSL沉默時(shí),ACTG1表達(dá)依舊上調(diào),可能是因?yàn)锳CTG1是一類作為細(xì)胞骨架成分而存在的蛋白質(zhì),具有高度保守性,它作為內(nèi)部細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的介質(zhì)而存在,對(duì)維持細(xì)胞骨架和肌細(xì)胞的正常發(fā)育均起到重要作用。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了雞ADSL基因的重組真核表達(dá)載體pEGFP-C1-ADSL,并將該載體轉(zhuǎn)入赤水烏骨雞的成肌細(xì)胞,隨后利用Co-IP聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)鑒定到94個(gè)與雞ADSL存在互作的蛋白。pEGFP-C1-ADSL重組蛋白于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。GO功能注釋表明,這些蛋白在細(xì)胞進(jìn)程、生物調(diào)節(jié)和刺激反應(yīng)等生物過(guò)程中發(fā)揮作用;KEGG信號(hào)通路分析顯示,這些蛋白主要參與代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程、有機(jī)系統(tǒng)和疾病等通路。