陳海云，凌偉航，林曉，吳惠文

（南寧壯博生物科技有限公司，廣西 南寧 530007）

1 拉曼技術(shù)檢測(cè)抗原抗體的原理

抗原(antigen,Ag)是指能與T 細(xì)胞、B 細(xì)胞抗原受體或抗體特異性結(jié)合，具有啟動(dòng)免疫應(yīng)答潛能的物質(zhì)，抗體(Ig)是由抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)后產(chǎn)生，并能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。抗原檢測(cè)的是病原體的組成蛋白，如果檢測(cè)結(jié)果為陽性，說明生物體內(nèi)含有病原體的組成成分，可直接確認(rèn)為感染病例?？乖瓩z測(cè)樣本類型一般為感染部位的樣本，例如，口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、血清、血漿等?？贵w檢測(cè)的是生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)為應(yīng)對(duì)病毒感染而產(chǎn)生的抗體，如果檢測(cè)結(jié)果為陽性，說明生物體內(nèi)存在針對(duì)病毒的抗體，生物體正處于感染期或已經(jīng)康復(fù)，可作為輔助手段幫助確診感染，抗體檢測(cè)樣本類型一般為血液，包括血清、血漿和全血。傳統(tǒng)的抗原抗體檢測(cè)方法主要有免疫膠體金技術(shù)、ELISA技術(shù)、表面凝集技術(shù)等，這些技術(shù)操作簡單，不需要額外儀器，反應(yīng)迅速，一般在5min 內(nèi)出結(jié)果，但大多只能定性，僅可判斷陰陽性，無法數(shù)據(jù)化，且質(zhì)量參差不齊，病原檢測(cè)敏感性差。近年來，很多科技工作者研究利用拉曼技術(shù)檢測(cè)抗原抗體，有望應(yīng)用于臨床，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的定性定量的檢測(cè)。拉曼光譜是散射光譜，是一種對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別的檢測(cè)技術(shù),根據(jù)特征峰的位置和強(qiáng)度反映出物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與含量信息。傳統(tǒng)拉曼光譜信號(hào)極弱，必須能排除瑞利散射光，才能高效地收集拉曼光譜，易受熒光干擾,檢測(cè)靈敏度低，限制了其應(yīng)用范圍，而且抗原抗體本身拉曼信號(hào)及其微弱，直接采用拉曼光譜儀照射的方法，并不能檢測(cè)出抗原抗體。為克服這些缺點(diǎn)，科研人員相繼研發(fā)了輔助技術(shù)來增強(qiáng)拉曼信號(hào)強(qiáng)度。目前，在檢測(cè)抗原抗體中最常用的是表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy, SERS）芯片技術(shù)，大多應(yīng)用的原理是利用金屬納米顆粒包裹抗原抗體再與芯片結(jié)合，形成一個(gè)三明治結(jié)構(gòu)，以此提高拉曼圖譜的信噪比，增強(qiáng)不同拉曼峰圖的差異性,合成高靈敏的SERS 標(biāo)記物是提高SERS 靈敏性的關(guān)鍵因素。金/銀納米顆粒是最常用作SERS 標(biāo)記物的材料。SERS 信號(hào)的增強(qiáng)主要依賴電磁場(chǎng)增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)，使其熒光背景低、不受水干擾，可實(shí)現(xiàn)痕量無損檢測(cè)，近年來，隨著研究者不斷的研究與技術(shù)更新，利用SERS 芯片技術(shù)搭配拉曼激光的檢測(cè)手段已成為生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)的最有力技術(shù)之一。

2 基于拉曼技術(shù)檢測(cè)抗原抗體的相關(guān)研究

病毒抗原抗體的快速檢測(cè)對(duì)疾病的診斷與預(yù)防有著重要意義。近年來，不少科研學(xué)者不斷嘗試?yán)美す饨Y(jié)合信號(hào)增強(qiáng)SERS 芯片對(duì)各種病毒的檢測(cè)進(jìn)行研究與優(yōu)化，同時(shí)在醫(yī)學(xué)癌癥和相關(guān)免疫疾病的檢測(cè)中也有大量的研究成果，其中，C 反應(yīng)蛋白（CRP）作為誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期生物指標(biāo)，2018 年，Rong Z 等合成了具有內(nèi)置熱點(diǎn)的拉曼報(bào)告分子，將其嵌入金核-銀殼納米顆粒，然后再與CRP 檢測(cè)抗體綴合，通過金銀顆粒包裹抗體后產(chǎn)生增強(qiáng)的拉曼信號(hào)，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可定量檢測(cè)最低限為0.01ng/mL-1，顯示出了較強(qiáng)的定量檢測(cè)能力。癌胚抗原(carcino-embryonic antigen CEA),是大腸癌組織產(chǎn)生的一種糖蛋白，作為抗原可引起患者的免疫應(yīng)答反應(yīng)，癌胚抗原是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對(duì)大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測(cè)和預(yù)后估計(jì)是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物，但其特異性不強(qiáng)，靈敏度不高，對(duì)腫瘤早期診斷作用不明顯。2014 年，Chunyuan Song，Linghua Min 等人，利用拉曼光譜結(jié)合SERS 芯片標(biāo)記金納米顆粒增強(qiáng)抗原信號(hào)，超靈敏地檢測(cè)癌胚胎抗原。在這項(xiàng)研究中，利用新型金納米作為SERS 標(biāo)記和SERS活性磁性納米顆粒支持底物，開發(fā)出了一種癌癥標(biāo)記物CEA 檢測(cè)方法。在0.01fg/mL 至1ng/mL 濃度范圍內(nèi)，檢測(cè)出的拉曼SERS 信號(hào)強(qiáng)度光譜圖呈良好的線性關(guān)系，可達(dá)到最低檢出限為0.01fg/mL。

寨卡(Zika)單股正鏈RNA 病毒，和我們平時(shí)熟知的登革熱(dengue fever)、西尼羅病毒病以及丙肝病毒屬于同一類病毒。這些病毒的基因組均是通過蚊蟲叮咬感染和傳播，罕見血液傳播和性傳播。導(dǎo)致的病癥通常是較輕微的。但是，一旦嬰幼兒感染會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的疾病，導(dǎo)致死亡常見癥狀包括輕微發(fā)熱或皮疹，一般在被受感染蚊子叮咬幾天后才出現(xiàn)，利用傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)難以檢測(cè)到如此低濃度的病毒含量。2017 年，S NCHEZ-PURR M，CARR-CAMPS M，PUIG H 利用拉曼激光結(jié)合表面增強(qiáng)SERS 芯片的高靈敏度對(duì)寨卡病毒和登革熱病毒進(jìn)行多重分析，基于這個(gè)技術(shù)區(qū)分出了寨卡和登革熱非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）的生物標(biāo)志物。經(jīng)過SERS 編碼的金納米顆粒能與這兩種疾病的特異性抗體結(jié)合，利用抗原抗體包被金顆粒相結(jié)合的原理檢測(cè)出2 種病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，并利用試紙免疫定性，拉曼儀器定量，其對(duì)寨卡NS1 和登革熱NS1 的檢測(cè)限分別能較傳統(tǒng)膠體金免疫層析技術(shù)，分別提高了感染寨卡病毒和登革熱病毒的陽性檢出率15倍和7 倍，而且可以在感染后生物標(biāo)志物水平較低時(shí)都能盡早檢測(cè)出這兩種病。

在流行病毒方面，2019 年，KUKUSHKIN V I，IVANOV N M 等學(xué)者采用表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)，建立了流感病毒檢測(cè)的適體傳感器。為了獲得高靈敏度，組裝了一級(jí)適體、流感病毒和二級(jí)適體的“三明治”。將一級(jí)適體連接到SERS 底物的金屬顆粒上，捕獲流感病毒并與用拉曼活性分子標(biāo)記的二級(jí)適體結(jié)合。信號(hào)受初級(jí)和次級(jí)適體濃度的影響。檢出限低至10-4，每個(gè)探針4個(gè)血凝單位，用于檢測(cè)H3N2 病毒（A/England/42/72）?；谶m體的傳感器可識(shí)別各種流感病毒株，包括H1、H3和H5 血凝素亞型。SERS 將拉曼信號(hào)放大106 ～109 倍，產(chǎn)生極好的靈敏度。Ralbovsky NM, Halámková L 等利用拉曼高光譜技術(shù)結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)開發(fā)了一種基于唾液分析的阿爾茲海默癥診斷新方法。使用拉曼高光譜技術(shù)分析從正常人、阿爾茲海默癥和輕度認(rèn)知障礙（MCI）個(gè)體收集的唾液樣本。將遺傳算法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)應(yīng)用于拉曼光譜數(shù)據(jù)集以構(gòu)建診斷算法。其研究結(jié)果示，區(qū)分這三類的準(zhǔn)確率達(dá)到99%。

除了可以檢測(cè)以上提到的病毒與疾病，因其利用拉曼技術(shù)可以直接對(duì)生物樣本進(jìn)行檢測(cè)，無須對(duì)組織、唾液、血清等樣本進(jìn)行復(fù)雜的處理，大大提高其檢測(cè)效率與成本，其價(jià)值促使科研學(xué)者對(duì)這項(xiàng)技術(shù)表現(xiàn)出了極高的研發(fā)狂潮，近年來，研究出了利用拉曼技術(shù)快速檢測(cè)鼻咽癌、胰腺癌、胃癌和食管癌等方法。由此可見，拉曼技術(shù)作為一種無創(chuàng)、高效、準(zhǔn)確的診斷方法具有顯著的潛力。

3 國內(nèi)外制備拉曼相關(guān)產(chǎn)品情況

近年來，為了獲得最優(yōu)的拉曼增強(qiáng)信號(hào)，研究者發(fā)現(xiàn)控制粒子的團(tuán)聚變得非常重要。常用于制備拉曼芯片的剛性基底材料有玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷(POMS)、晶體硅等，其中石英芯片的透光性好、拉曼背景低，但價(jià)格昂貴，玻璃和晶體硅機(jī)械強(qiáng)度大、通道表面易修飾，聚二甲基硅氧烷(POMS)，其成本價(jià)格較低，但針對(duì)病毒檢測(cè)效果不太理想，易產(chǎn)生記憶效應(yīng)。近年來，利用柔性材料替代剛性材料作為芯片基底越來越普遍。楊峰、文枰等人采用滴鑄法來制備柔性的SERS 芯片，發(fā)現(xiàn)了鋁箔在波長為532nm 激發(fā)光具有很高的反射率，選擇了鋁箔作為襯底，使增強(qiáng)效果高至1.32×108。ZengFY 等基于常用濾紙和銀納米顆粒（AgNP）制備了紙基SERS 芯片，成功用于檢測(cè)低濃度的典型SERS 分析物模分子，包括羅丹明6G 和結(jié)晶紫。Reokrungruang P 等研制出了一種簡單且成本效益高的等離子體紙作為拉曼表面增強(qiáng)SERS 柔性基底，將普通濾紙浸入金納米棒溶液中制備等離子體激元紙，結(jié)合磁分離成功用于癌癥的檢測(cè)與篩查。Oliveira M J 等利用兩種不同類型的紙制備SERS 襯底：高孔隙率紙和低孔隙率紙。將含有銀納米星（AgNSs）的溶液滴鑄在紙上圖案化的親水孔上。大多數(shù)納米顆粒保留在辦公紙基材的照明表面。經(jīng)過驗(yàn)證，沉積AgNs 的辦公紙基材，拉曼信號(hào)顯著增強(qiáng)且在儲(chǔ)存5 周后保持穩(wěn)定，但紙張本身的拉曼信號(hào)會(huì)造成干擾。綜上，在工藝簡單和低成本的要求下,制備具有穩(wěn)定、均一、普適性強(qiáng)，能顯著減少咖啡環(huán)效應(yīng)的SERS 基底仍然處于一個(gè)研發(fā)成果全面開花但并未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的狀態(tài)，依舊面臨巨大的挑戰(zhàn)，成功之路道阻且長。

國外的拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)研發(fā)起步較早，技術(shù)方面相對(duì)較成熟，市場(chǎng)已普遍存在滿足科研測(cè)量要求的臺(tái)式拉曼光譜儀器和便攜式的手持拉曼光譜儀，但價(jià)格還相對(duì)昂貴。拉曼光譜儀市場(chǎng)容量近幾年不斷增長，主要市場(chǎng)情況為應(yīng)用在毒品檢測(cè)和藥品檢測(cè)、發(fā)酵工藝實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等方面。應(yīng)用于商業(yè)化檢測(cè)抗原抗體尚未有任何例子，即主要原因即為對(duì)抗原抗體與金銀納米粒子的包被與結(jié)合，包被好的粒子還要考慮拉曼增強(qiáng)芯片的結(jié)合與干擾，雖檢測(cè)這方面快速便捷，但這道前處理的過于復(fù)雜的工序和要搭建的龐大拉曼光譜數(shù)據(jù)庫就讓很多學(xué)者望而卻步。

4 結(jié)語

綜上，拉曼檢測(cè)技術(shù)作為前景廣闊、便利快捷的檢測(cè)技術(shù)，可幫助更快捷便利地檢測(cè)出抗原抗體，并能實(shí)時(shí)定量地檢測(cè)出病毒在生物體內(nèi)的變化過程，然而，拉曼光譜技術(shù)想在檢驗(yàn)行業(yè)真正地、廣泛地應(yīng)用于臨床與商業(yè)化，仍然存在諸多挑戰(zhàn)。其中，研制出能直接不借助輔助芯片就能提高信號(hào)的拉曼光譜儀是走向廣闊市場(chǎng)，走向人民的關(guān)鍵，而且現(xiàn)在的儀器分析圖譜算法過于復(fù)雜，需要配備拉曼檢測(cè)儀器標(biāo)準(zhǔn)化且可靠易操作的數(shù)據(jù)分析方法，將復(fù)雜的拉曼光譜數(shù)據(jù)算法轉(zhuǎn)化為簡單易懂的可視結(jié)果，并且建立其龐大的不同物質(zhì)的全面的拉曼光譜特征峰數(shù)據(jù)庫是一項(xiàng)復(fù)雜且長遠(yuǎn)的工作。當(dāng)然，這個(gè)數(shù)據(jù)庫一旦能建立起來，也將成為一類相當(dāng)寶貴的資源。而對(duì)于最常用的輔助增強(qiáng)芯片SERS 方法來說，目前是仍舊無法獲得具有良好穩(wěn)定性和適用性的SERS基底且前處理過程并不便利。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步以及研究者的不斷努力，拉曼光譜技術(shù)可以在不久的將來廣泛應(yīng)用于生物樣本檢測(cè)，為臨床實(shí)驗(yàn)室和基層現(xiàn)場(chǎng)診斷提供一種顛覆性的前沿技術(shù)。