牟睿宇，，牛瀟菲，廖洋，賈春鑫，孔凡銘，郭姍琦，賈英杰

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，天津 300381；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381）

近年來，胃癌的發(fā)病率和病死率一直居高不下，中國胃癌發(fā)病率與病死率遠(yuǎn)超過美國[1]。據(jù)2020 年全球癌癥報告[2]顯示，中國胃癌發(fā)病率占全球的43.9%，病死率占全球的48.6%，幾乎達到了全球胃癌患者的半數(shù)。胃癌往往早期癥狀不顯著，多數(shù)患者確診時即為晚期，治療效果差，預(yù)后不佳，手術(shù)、放化療、靶向治療以及免疫治療等西醫(yī)治療手段雖然能在一定程度上改善患者的生存預(yù)后，但仍存在不良反應(yīng)以及耐藥等一系列問題，如何打破目前胃癌臨床治療的瓶頸，提高患者的生存預(yù)后是越來越多學(xué)者密切關(guān)注的問題。中醫(yī)藥作為中華民族的文化瑰寶，在治療胃癌方面顯現(xiàn)出良好的臨床療效及發(fā)展前景，中西醫(yī)相輔相成的綜合治療方式被視為打破胃癌治療困境的一個突破口。

消巖湯作為天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院賈英杰教授的經(jīng)驗方，已在臨床應(yīng)用十余年，長期的臨床實踐顯示其治療氣虛毒瘀的惡性腫瘤患者療效顯著。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[3-6]表明，其可有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥，從而發(fā)揮抗腫瘤療效。本研究團隊前期臨床研究[7]顯示消巖湯聯(lián)合阿帕替尼治療晚期胃癌患者中位生存時間可達6.0 個月，較對照組中位生存時間延長了0.3 個月，在胃癌治療中顯現(xiàn)出良好療效。但消巖湯的抗胃癌作用機制尚未明確，本研究基于血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）/磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶（AKT）通路探討消巖湯聯(lián)合阿帕替尼治療胃癌的作用機制研究，為下一步消巖湯在胃癌領(lǐng)域的應(yīng)用提供了依據(jù)和參考。

1 實驗材料

1.1 實驗細(xì)胞 人胃癌MGC-803 細(xì)胞，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科實驗室凍存。

1.2 實驗藥品 消巖湯（藥物組成：黃芪30 g，郁金10 g，姜黃10 g，太子參15 g，白花蛇舌草10 g，夏枯草10 g，牡蠣15 g）購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國藥堂，嚴(yán)格按照回流提取法進行提取，將其濃縮至生藥濃度為1 g/mL 的水煎液，并依次運用0.45 μm和0.22 μm 的無菌微孔濾膜進行過濾除菌；甲磺酸阿帕替尼購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.3 實驗試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶[不含乙二胺四乙酸（EDTA）]，均購自以色列BI 公司；雙抗、磷酸鹽緩沖液（PBS）、二甲基亞砜（DMSO）、脫氧核糖核酸（DNA）含量檢測試劑盒、蛋白上樣緩沖液、彩虹180 廣譜蛋白Marker、TBST，均購自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（0.25%EDTA），購自美國Gibco 公司；CCK-8 檢測試劑盒，購自日本同仁化學(xué)研究所；AnnexinV-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自美國BD 公司；RAPI 裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、封閉液、一抗二抗稀釋液、一抗二抗去除液，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 凝膠制備試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP）羊抗兔免疫球蛋白G[（IgG），H+L]、HRP 羊抗鼠IgG（H+L）、超特敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物，均購自武漢博士德生物工程有限公司；p-PI3K 抗體、p-AKT 抗體，均購自美國CST 公司；血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）抗體、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2 （VEGFR-2） 抗體、Cleaved Caspase -9 抗體、Bcl -2 抗體、Bax 抗體、GAPDH 抗體，均購自Affinity 公司。

1.4 實驗儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；臺式恒溫?fù)u床（天津歐諾儀器股份有限公司）；電子天平（上海?？惦娮觾x器廠）；多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；臺式高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；干式恒溫金屬?。绹鳷hermo 公司）；小型垂直電泳槽、小型轉(zhuǎn)印槽、電泳儀電源（美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（德國Jena 公司）。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌MGC-803 細(xì)胞使用RPMI 1640 完全培養(yǎng)基[RPMI 1640 培養(yǎng)基+10%胎牛血清（FBS）+1%雙抗]，5%CO2，37 ℃恒溫條件下進行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%密度時，使用胰酶進行消化，并按1∶4 進行細(xì)胞傳代。

2.2 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖 消化收集對數(shù)生長期的人胃癌MGC-803 細(xì)胞并進行細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為4×104/mL，并將其按4 000 個細(xì)胞/孔接種至96 孔板中，靜置培養(yǎng)24 h 后分別加入濃度為0、20、40、60、80、100、120 mg/mL 的含藥培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置4 個復(fù)孔，繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h 后加入CCK-8 檢測試劑避光孵育1～4 h，使用酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm 處的吸光度，并計算不同濃度消巖湯對人胃癌MGC-803 細(xì)胞的生長抑制率：細(xì)胞抑制率=[（對照孔吸光度-實驗孔吸光度）/（空白對照組吸光度-空白孔吸光度）]×100%。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 消化收集對數(shù)生長期的人胃癌MGC-803 細(xì)胞并制備細(xì)胞懸液，將其按2×105個細(xì)胞/孔接種至六孔板中，靜置培養(yǎng)24 h 后分別加入濃度為0、20、40、60 mg/mL 的含藥培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置3 個復(fù)孔，繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h，使用不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心3 min，PBS 洗2 次，加入1×Binding Buffer 緩沖液將其制備成1×106個細(xì)胞/mL 的細(xì)胞懸液。在流式管中加入100 μL 的細(xì)胞懸液，加入5 μL 的AnnexinV-FITC 染料和5 μL的PI 染料，混勻，避光反應(yīng)15 min，加入400 μL 1×Binding Buffer 緩沖液，混勻，30 min 內(nèi)上流式細(xì)胞儀進行檢測，并使用FlowJo 軟件對凋亡數(shù)據(jù)進行分析。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 消化收集對數(shù)生長期的人胃癌MGC-803 細(xì)胞并制備細(xì)胞懸液，將其按2×105個細(xì)胞/孔接種至6 孔板中，靜置培養(yǎng)24 h 后分別加入濃度為0、20、40、60 mg/mL 的含藥培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置3 個復(fù)孔，繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h 后消化收集細(xì)胞，1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心3 min，PBS 洗2 次，加入預(yù)冷的70%乙醇，置于-20 ℃冰箱中固定過夜，4 ℃下1 500 r/min，離心半徑20 mm，離心5 min，棄上清液，PBS 洗2 次，徹底去除乙醇，加入100 μL RNaseA 溶液，置于37 ℃恒溫水浴鍋中30 min，再加入400 μL PI 染色液，4 ℃避光染色30 min。將待測樣品轉(zhuǎn)移至流式管中，使用300 目細(xì)胞篩網(wǎng)進行過濾，上流式細(xì)胞儀進行檢測，并使用ModFit 軟件對細(xì)胞周期數(shù)據(jù)進行分析。

2.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測細(xì)胞蛋白表達 分別設(shè)置空白對照組、消巖湯組（XYT 組，60 mg/mL）、阿帕替尼組（Apatinib 組，40 μmol/L）以及聯(lián)合用藥組（XYT，60 mg/mL+Apatinib，40 μmol/L），加藥處理24 h 后收集細(xì)胞，每管中加入200 μL 配制好的裂解液（RIPA 裂解液∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1），置于冰上裂解30 min，4 ℃離心10 min，取上清液，利用BCA 法對蛋白濃度進行檢測，并將各組蛋白樣本調(diào)整為相同濃度，加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液，混勻，95 ℃變性5 min。將蛋白Maker及各組樣品（上樣量為40 μg/孔）進行蛋白上樣，80 V恒壓電泳20～30 min，待溴酚藍(lán)染料跑至分離膠后調(diào)整電壓為120 V 恒壓電泳1.5 h，待溴酚藍(lán)染料跑至凝膠最下緣處停止電泳。按照“三明治”法進行轉(zhuǎn)膜，設(shè)置恒流200 mA，1～2 h，轉(zhuǎn)膜完成后，取出PVDF 膜，根據(jù)目的蛋白的分子量范圍進行剪膜，加入封閉液，封閉30～60 min，1×TBST 洗3 次，加入一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST 洗3 次，加入二抗室溫孵育1 h，1×TBST 洗3 次。利用凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，并使用Image J 軟件對不同條帶進行光密度分析。對于分子量重合的蛋白條帶可利用去除液進行抗體洗脫。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS Statistics 21.0 軟件對實驗結(jié)果進行分析，計量資料數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 消巖湯對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響CCK-8的檢測結(jié)果顯示，消巖湯對人胃癌MGC-803 細(xì)胞活力具有明顯抑制作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。不同濃度消巖湯對MGC-803 細(xì)胞的抑制率顯示，消巖湯呈劑量依賴性抑制MGC-803 細(xì)胞的增殖，通過計算得出消巖湯作用于MGC-803 細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）為63.56 mg/mL。見表1。

表1 不同濃度消巖湯對MGC-803 細(xì)胞影響抑制率Tab.1 Effect of inhibition rate of different concentration of Xiaoyan Decoction on MGC-803 cells

3.2 消巖湯對人胃癌MGC-803 細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡的流式檢測結(jié)果顯示，隨著消巖湯濃度的增加，人胃癌MGC-803 細(xì)胞的總凋亡率逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)消巖湯濃度為0、20、40 和60 mg/mL 時，MGC-803 細(xì)胞的總凋亡率分別為（4.49 ±0.26）%、（10.26 ±1.32）%、（20.15 ±2.29）% 和（30.01±1.35）%。檢測結(jié)果表明，消巖湯可顯著誘導(dǎo)人胃癌MGC-803 細(xì)胞發(fā)生凋亡。見圖1。

圖1 消巖湯對MGC-803 細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of Xiaoyan Decoction on apoptosis of MGC-803 cells

3.3 消巖湯對人胃癌MGC-803 細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞周期的流式檢測結(jié)果顯示，隨著消巖湯濃度的增加，MGC-803 細(xì)胞的G0/G1 期細(xì)胞所占百分比逐漸降低，S 期細(xì)胞所占百分比逐漸升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），G2/M 期細(xì)胞所占百分比變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。檢測結(jié)果表明，消巖湯可誘導(dǎo)人胃癌MGC-803 細(xì)胞發(fā)生S 期阻滯。見圖2。

圖2 消巖湯對MGC-803 細(xì)胞周期分布的影響Fig.2 Effect of Xiaoyan Decoction on cell cycle distribution of MGC-803

3.4 消巖湯聯(lián)合阿帕替尼對MGC-803 細(xì)胞活力的影響 CCK-8 的結(jié)果顯示，與空白對照組比較，消巖湯單藥組、阿帕替尼單藥組以及聯(lián)合用藥組均可明顯抑制MGC-803 細(xì)胞的活力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.000 1），抑制率分別為（44.918±1.469）%、（37.585±1.869）%和（66.651±1.599）%。與消巖湯單藥組和阿帕替尼單藥組比較，聯(lián)合用藥組對MGC-803 細(xì)胞活力的抑制作用更為明顯，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.000 1）。由此可見，消巖湯、阿帕替尼均可有效抑制MGC-803 細(xì)胞的生長增殖，與單獨用藥比較，二者聯(lián)用的效果更好。見表2。

表2 消巖湯聯(lián)合阿帕替尼對MGC-803 細(xì)胞抑制率的影響Tab.2 Effect of inhibition rate of Xiaoyan Decoction combined with apatinib on MGC-803 cells

3.5 消巖湯聯(lián)合阿帕替尼對人胃癌MGC-803 細(xì)胞PI3K/AKT 信號通路蛋白表達的影響 利用Western Blot 檢測不同藥物組作用于MGC -803 細(xì)胞后PI3K/AKT 信號通路蛋白表達的情況，實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，消巖湯、阿帕替尼及其聯(lián)合用藥組的p-PI3K、p-AKT 以及Bcl-2 蛋白的表達量顯著下調(diào)，Cleaved Caspase-9 以及Bax 蛋白的表達量顯著上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與消巖湯單藥組和阿帕替尼單藥組比較，聯(lián)合用藥組對p-PI3K、p-AKT、Bcl-2 蛋白的表達下調(diào)更為明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；對CleavedCaspase-9蛋白的表達上調(diào)也更為顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組較消巖湯單藥組的Bax 蛋白表達有所上調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；較阿帕替尼單藥組的Bax 蛋白表達上調(diào)顯著，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

圖3 各藥物組對MGC-803 細(xì)胞PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達情況的影響Fig.3 Effects of different drug groups on PI3K/Akt pathway related protein expression in MGC-803 cells

3.6 消巖湯聯(lián)合阿帕替尼對人胃癌MGC-803 細(xì)胞血管生成相關(guān)指標(biāo)蛋白表達的影響 利用Western Blot 檢測不同藥物組作用于MGC-803 細(xì)胞血管生成相關(guān)指標(biāo)的蛋白表達情況。結(jié)果顯示，與空白對照組的VEGFR-2 比較，消巖湯單藥組、阿帕替尼單藥組以及聯(lián)合用藥組的VEGFA 和VEGFR-2 表達均顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組較消巖湯單藥組的VEGFA 下調(diào)水平有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），較阿帕替尼單藥組的VEGFA 下調(diào)水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。相較于兩個單藥組，聯(lián)合用藥組的VEGFR-2 表達量更低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖4。

圖4 各藥物組對MGC-803 細(xì)胞VEGFA/VEGFR-2 蛋白表達情況的影響Fig.4 Effects of different drug groups on VEGFA/VEGFR-2 protein expression in MGC-803 cells

4 討論

賈英杰教授認(rèn)為惡性腫瘤的根本病機為“本元虧虛，癌濁叢生”，其中“正虛”為內(nèi)因，“癌濁”為誘因，二者貫穿病程始終?；诖?，賈英杰教授提出“黜濁培本”[8-9]大法治療惡性腫瘤，并在“黜濁培本”的理論基礎(chǔ)之上，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果以及數(shù)年臨證經(jīng)驗，自擬經(jīng)驗方“消巖湯”用于治療氣虛毒瘀的惡性腫瘤患者。方中黃芪、太子參益氣養(yǎng)陰，扶正抗癌；白花蛇舌草、夏枯草、生牡蠣清熱解毒、軟堅散結(jié)；姜黃、郁金化瘀消癥，疏肝行氣，諸藥配伍，共奏黜濁培本之效。本團隊的前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，消巖湯具有明確的抗腫瘤療效，可以通過多通路、多靶點、多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。

胃癌可歸屬于中醫(yī)學(xué) “積聚”“反胃”“胃脘痛”“胃痞”等病范疇?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥具有抗腫瘤作用，其中白花蛇舌草[10]可以降低人胃癌MNK-45 細(xì)胞線粒體膜電位，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；夏枯草[11]可以通過HMGB1 抑制胃癌BGC-823細(xì)胞增殖、侵襲與遷移，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。前期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，消巖湯中的多種活性成分均具有抗胃癌作用，黃芪、白花蛇舌草、夏枯草中含有的活性成分槲皮素[12]可以通過誘導(dǎo)ROS 生成，降低線粒體膜電位，從而誘導(dǎo)人胃癌AGS 細(xì)胞發(fā)生凋亡。黃芪和夏枯草中含有的活性成分山柰酚[13-14]能有效抑制胃癌MKN-28 和SGC-7901 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，并可以通過IRE1-JNK-CHOP途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬。太子參中含有的活性成分木犀草素[15-16]可以通過調(diào)控PI3K-Akt、MAPK、mTOR等多條信號通路，抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及血管生成，促進胃癌細(xì)胞凋亡。

本研究以VEGF/PI3K/AKT 信號通路為切入點，從體外層面探究了消巖湯治療胃癌的機制，研究結(jié)果顯示，消巖湯能有效下調(diào)VEGF/PI3K/AKT信號通路中VEGFA、VEGFR-2、p-PI3K、p-AKT 和Bcl-2 的表達，上調(diào)Cleaved Caspase-9 和Bax 的表達，從而誘導(dǎo)胃癌MGC-803 細(xì)胞凋亡，抑制血管新生，起到抗腫瘤效果。其中VEGFA[17]是常見的血管生成調(diào)控因子，其可與VEGFR-2 受體相結(jié)合，從而激活下游多條信號通路介導(dǎo)血管新生，PI3K/AKT 信號通路[18]就是其中之一。PI3K/AKT 信號通路是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中一條重要的信號通路，其可介導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、周期、侵襲、遷移、免疫微環(huán)境以及血管新生等[19-21]，本研究對其通路介導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其可抑制Bcl-2 的蛋白表達，促進Cleaved Caspase-9 和Bax 的蛋白表達，從而誘導(dǎo)MGC-803 細(xì)胞凋亡。阿帕替尼作為VEGFR-2靶向藥物，與消巖湯聯(lián)用能增加對VEGF/PI3K/AKT信號通路的抑制作用，更好地發(fā)揮抗腫瘤效果。此外，本研究對消巖湯對胃癌MGC-803 細(xì)胞的增殖和周期還進行了檢測，發(fā)現(xiàn)消巖湯能有效抑制MGC-803 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)S 期阻滯，其具體的作用機制還有待進一步挖掘。中藥復(fù)方發(fā)揮抗腫瘤效果的過程往往是通過多通路、多靶點實現(xiàn)的，本研究僅對VEGF/PI3K/AKT 信號通路進行了探討，消巖湯是否可以通過其他信號通路發(fā)揮抗胃癌效果，同樣值得進一步深入研究。