趙鵬 楊尚 張慧玲 溫倫軍 胡霞 孫海鵬 崔自學 侯啟瑞

摘要 以β-環(huán)糊精為壁材，桑多酚提取液為芯材，采用冷凍干燥法制備桑多酚微囊，并對其特性進行研究。結果表明，桑多酚微囊包埋率隨β-環(huán)糊精的增加而提高，二者比值≤1∶3時多酚含量和包埋率趨于穩(wěn)定；掃描電鏡觀察，桑多酚微囊分散效果較好；微囊化可以顯著改善桑多酚在貯藏期間的穩(wěn)定性，減少多酚在胃液中的損耗，增加其在腸液中的釋放量；桑多酚微囊對·OH、DPPH·和O-2 ·的清除率與桑多酚相當，說明微囊化未影響其抗氧化活性。

關鍵詞 桑多酚；微囊；制備；冷凍干燥；特性；抗氧化

中圖分類號 R285? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）06-0166-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.036

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study of Preparation and Characterization of Mulberry Polyphenol Microcapsules

ZHAO Peng1， YANG Shang1， ZHANG Hui-ling2 et al

（1. Sericulture Research Institute of Henan Province， Zhengzhou， Henan 450007;2. Jiangsu University of Science and Technology， Zhenjiang， Jiangsu 212100）

Abstract The microcapsules of mulberry polyphenol were prepared by freeze-drying method with β-cyclodextrin as wall material and mulberry polyphenol extract as core material， and their characteristics were studied. The results showed that the embedding rate of mulberry polyphenol microcapsules increased with the increase of β-cyclodextrin， and the polyphenol content and embedding rate tended to be stable when the ratio ≤ 1∶3. Scanning electron microscopy showed that the dispersion effect of mulberry polyphenol microcapsules was good. Microencapsulation significantly improved the stability of mulberry polyphenol during storage， reduced the loss of that in gastric fluid and increased the release in intestinal fluid. The clearance rate of ·OH，DPPH· and O-2 · in mulberry polyphenol microcapsules was like that of mulberry polyphenol， indicating that the microencapsulation did not affect its antioxidant activity.

Key words Mulberry polyphenols;Microcapsules;Preparation;Freeze drying;Characteristics;Antioxidation

桑（Morus alba L．）是多年生葉用經濟作物，具有耐貧瘠、耐干旱、適應性強等特點，在我國有較廣的栽培范圍。據估計，我國桑樹的種植面積超過106 hm2，鮮桑葉的生物質產量每年25～30 t/hm2，是目前木本葉用植物中產量最高的樹種之一［1］。幾百年來，桑葉一直被用作蠶的飼料。基于其抗氧化、抗菌和降血脂的特性，桑葉也被用于中草藥。近年來，人們對桑葉的營養(yǎng)價值和治療功效有了新的認識，桑葉及其提取物正被廣泛應用于飼料和動物養(yǎng)殖，在提高動物生產性能、飼料轉化效率和畜產品品質等方面效果顯著［2-3］。

多酚是植物中的酚類次生代謝產物，在植物葉、果、皮、根中廣泛存在。桑多酚占桑葉干重的l％～3％，具有較強的清除羥自由基和氧自由基活性，是亟待開發(fā)的蘊藏在我國總量較大的一種植物天然抗氧化劑［4］。植物多酚苯環(huán)上有多個羥基，可發(fā)生消去、取代、置換和顯色等化學反應，在自然界中具有高度不穩(wěn)定性，儲存過程還會受到氧化劑、熱、光和酶反應的影響，降低多酚化合物的生物利用度［5］。微囊技術是以天然或人工合成的高分子材料為壁材，以所保護的物質為芯材，通過微囊化減少芯材與外界環(huán)境接觸，使其免遭光照、溫度或氧化物的破壞，提高穩(wěn)定性［6］。研究顯示，微囊技術可以顯著改善多酚的穩(wěn)定性和貯藏性，且微囊有緩釋作用，可防止多酚被消化液破壞而吸收不完全［7］。微囊化常用的壁材有麥芽糊精、普魯蘭、凝乳素、海藻酸鈉、果膠、β-環(huán)糊精等。Hamid 等［8］以麥芽糊精為壁材，通過冷凍干燥進行微囊化，克服了野生石榴黃酮不穩(wěn)定的缺點，提高了其生物利用度。徐冉等［9］采用微囊技術將天然除蟲菊酯包埋在β-環(huán)糊精的中空疏水區(qū)，結果表明微囊相對原材料具有較好的熱穩(wěn)定性和緩釋性能。β-環(huán)糊精分子為立體結構，環(huán)中間有空洞，邊緣具有親水性或極性，能溶于水，不溶于乙醇和其他有機溶劑［10］。該研究以β-環(huán)糊精為壁材，桑多酚為芯材，通過冷凍干燥的方法制備桑多酚微囊，并對其緩釋特性、穩(wěn)定性和抗氧化性能進行檢測，以期獲得較好的桑多酚微囊產品，促進桑葉資源在食品、飼料添加劑等方面的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。

新鮮桑葉采摘于鎮(zhèn)江中農蠶桑技術服務有限公司桑園，樣品65 ℃烘至恒重，粉碎后過60目篩。

1.1.2 試劑。β-環(huán)糊精、沒食子酸（純度99%）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、福林-酚試劑、無水乙醇、鎢酸鈉、磷鉬酸、磷酸、碳酸鈉，均為分析純，鎮(zhèn)江華東器化玻有限公司。

1.1.3 儀器與設備。

Beta 2-8 LSC basic凍干機（Christ Sigma儀器設備北京有限公司）；ST16 ST16R高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技中國有限公司）；UV-2401PC紫外可見分光光度計（島津香港有限公司）；MH-1500S 型超聲波清洗器（湖南米函儀器科技有限公司）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（江蘇省常州市國華儀器制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑多酚提取物的制備。

桑葉粉25 g，按1∶25料液比加入0.34%十二烷基硫酸鈉（SDS）、60%乙醇，61 ℃超聲15 min，超聲功率260 W。然后將提取液置于離心管中3 000 r/min離心15 min，上清液在旋轉蒸發(fā)器中50 ℃濃縮至原體積的1/4。

1.2.2 桑多酚微囊的制備。

β-環(huán)糊精按照表1的比例加至濃縮液中，不斷攪拌2 h使其完全均質，然后-80 ℃冷凍24 h。樣品用凍干機在-30 ℃、0.04 hPa真空壓力下冷凍干燥，研缽磨成粉，放入琥珀色瓶中備用。

1.2.3 沒食子酸

標準曲線的繪制。精密稱取沒食子酸標準品0.011 0 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，得濃度為0.11 mg/mL的標準液。準確吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL標準液置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水6.0 mL，然后分別加入福林-酚試劑0.5 mL，混勻，再加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，充分混合后定容。30 ℃避光放置30 min，以不加標準液的6.0 mL蒸餾水為空白對照，760 nm下測定吸光度。以沒食子酸在反應體系中的質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線（圖1）。

1.2.4 桑多酚微囊包埋率的測定。

1.2.4.1 桑多酚微囊表面多酚含量的測定。

桑多酚微囊1.00 g先溶于一定量水中再定容至100 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL定容至25 mL，10 min后以沒食子酸標準溶液為空白對照，760 nm下測定吸光度，根據標準曲線計算出微囊表面多酚含量。

1.2.4.2 桑多酚微囊總多酚含量的測定。

1.00 g桑多酚微囊溶于30 mL無水乙醇，充分攪拌以利于壁材的溶解。用蒸餾水定容至100 mL，61 ℃超聲15 min，超聲功率260 W，取上清液1 mL定容至25 mL，10 min后測吸光度，根據標準曲線計算出微囊總多酚含量。

1.2.4.3 桑多酚微囊包埋率。根據以下公式計算桑多酚微囊包埋率：

包埋率=（1-桑多酚微囊表面多酚含量/桑多酚微囊總多酚含量）×100%。

1.2.5 桑多酚微囊顯微形態(tài)觀察。

少量桑多酚微囊黏附于雙面膠上，鍍金后放入掃描電鏡樣品室，抽真空，觀察微囊結構并拍照留存。

1.2.6 桑多酚微囊在人工胃、腸液中多酚釋放的測定。

1.2.6.1 人工胃、腸液的配制。

人工胃液：800 mL水中加入16.4 mL稀鹽酸和10 g胃蛋白酶，混勻，定容至1 000 mL。

人工腸液：稱取6.8 g KH2PO4加入500 mL水中，攪拌均勻，然后用4% NaOH調節(jié)pH至6.8，再加入10 g胰酶混勻，定容至1 000 mL。

1.2.6.2 模擬胃腸環(huán)境的釋放。

0.5 g T4組桑多酚微囊加入100 mL預熱的（37.5～38.0 ℃）人工胃液或腸液中，300 r/min不斷攪拌，在10、20、30、60、120、180、240、300 min取樣，544 nm 處測定吸光度并計算多酚含量。通過計算累積釋放度觀察桑多酚微囊的緩釋效果：

累積釋放度=（最大釋放時的多酚含量/總多酚含量）×100%。

1.2.7 桑多酚微囊穩(wěn)定性測定。

將3 g桑多酚微囊和桑多酚室溫下敞口放置20 d，每隔5 d取0.5 g樣品測定多酚含量，計算多酚保留率：多酚保留率= 貯藏后樣品中多酚含量/起始樣品中多酚含量×100%。

1.2.8 桑多酚微囊抗氧化性測定。

1.2.8.1 清除羥基自由基（·OH）。

2 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、1 mL鄰二氮菲（1.5 mmol/L）和1 mL FeSO4（1.5 mmol/L）混勻，分別加入1 mL相同質量分數的桑多酚微囊或桑多酚溶液，混勻，然后加入1 mL H2O2（0.02%），補充體積至8 mL，在536 nm處測吸光度，記為A樣品；對照組以蒸餾水代替樣液，空白組以蒸餾水代替 H2O2?！H 清除率的計算公式：清除率=（A對照-A樣品-A空白）/A對照×100%。

1.2.8.2 清除二苯基苦基苯肼自由基（DPPH·）。

取2 mL相同質量分數的桑多酚微囊或桑多酚溶液，加入2 mL DPPH溶液（稱取8.05 mg DPPH溶解于無水乙醇，以無水乙醇定于100 mL，即為0.2 mmol/L DPPH溶液），混勻，30 min后在517 nm 處測吸光度，記為A樣品；對照組以乙醇代替樣液，空白組以無水乙醇代替DPPH溶液。DPPH·清除率的計算公式：清除率=（A對照-A樣品-A空白）/A對照×100%。

1.2.8.3 清除超氧陰離子（

O-2 ·）。

4.5 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）分別加入1 mL相同質量分數的桑多酚微囊或桑多酚溶液，25 ℃保溫20 min，然后加入 0.3 mL鄰苯三酚（1 mmol/L），5 min后在325 nm處測吸光度，記為A樣品；對照組以蒸餾水代替樣液，空白組以蒸餾水代替鄰苯三酚溶液。O-2 ·清除率的計算公式：清除率=（A對照-A樣品-A空白）/A對照×100%。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 10.1軟件包進行方差分析（ANOVA）、Duncan檢驗和配對t檢驗，以P<0.05為差異顯著。所有檢測均做3個重復，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 桑多酚微囊包埋率及顯微結構

根據桑多酚提取物的濃度優(yōu)化壁材β-環(huán)糊精的濃度。如表2所示，桑多酚微囊包埋率隨β-環(huán)糊精的增加而提高（最高可達76.97%），桑多酚提取液：β-環(huán)糊精≤1∶3時（T3～T6）表面多酚含量、總多酚含量和包埋率趨于穩(wěn)定。壁材濃度的增加會減少單位質量中多酚的含量，因此隨著β-環(huán)糊精的增加多酚含量相對降低。綜合包埋率和總多酚含量的數據，T4組配比較優(yōu)。選取T4組桑多酚微囊進行顯微結構觀測，結果如圖2所示。未微囊化的桑多酚黏連現象嚴重，微囊化后分散性提高，更加蓬松。

2.2 桑多酚微囊在模擬胃、腸液中多酚釋放

用β-環(huán)糊精將較小尺寸的桑多酚包裹起來，不僅可以增強其對不良環(huán)境的抵抗性，還能使微囊中的桑多酚在腸道適宜條件下快速釋放出來，明顯提高其在腸道中的有效吸收率。T4組桑多酚微囊在人工胃、腸液中的溶出情況如圖3所示。在人工胃液中，120 min左右多酚含量最大（0.45 mg/mL），而在人工腸液中，桑多酚微囊能夠迅速釋放多酚，10 min時多酚含量就迅速上升至1.18 mg/mL，并在之后的2 h內含量維持在1.0 mg/mL 左右（最大值為60 min時1.19 mg/mL）。桑多酚微囊經過人工胃液處理后，仍保持顆粒狀態(tài)，液體清亮，而進入人工腸液后變得松散，并逐漸崩解，液體渾濁，說明所得的微囊產品具有較好的緩釋效果。計算可知桑多酚微囊最大累積釋放度達到 88.37%。

2.3 桑多酚微囊的穩(wěn)定性檢測

由圖4可知，隨著時間的延長，桑多酚微囊和桑多酚樣品中多酚保留率整體呈明顯的下降趨勢，且桑多酚樣品中的多酚含量下降趨勢更為急劇。在放置20 d時，桑多酚微囊所含多酚的保留率為86.22%，而桑多酚樣品中的多酚保留率僅為 42.43%，說明微囊化對內部芯材的保護效果比較理想，能夠有效提升桑多酚在貯藏期間的穩(wěn)定性。

2.4 桑多酚微囊的抗氧化活性檢測

多酚類化合物普遍具

有抗氧化活性，可有效清除體內有害的自由基，發(fā)揮抗氧化損傷作用。從圖5可以看出，桑多酚微囊抗氧化活性與桑多酚相當，清除·OH和O-2 ·的能力呈現明顯的劑量－效應關系，清除DPPH·的能力在低濃度（≤0.5 mg/mL）時有明顯上升趨勢，超過0.5 mg/mL清除率變化不大。隨著樣品濃度的增加，桑多酚微囊中多酚含量低于桑多酚樣品中多酚含量，因此高濃度時桑多酚微囊清除自由基的能力略低于桑多酚。

3 結論

以β-環(huán)糊精為壁材、桑多酚提取液為芯材，通過冷凍干燥法制備桑多酚微囊，包埋率可達76.97%。掃描電鏡觀察，桑多酚微囊分散效果較好。模擬胃腸環(huán)境測得，微囊化可以減少桑多酚在胃液中的損耗，增加其在腸液中的釋放量，最大累積釋放度為88.37%。與未微囊化的桑多酚相比，微囊化可以明顯改善桑多酚在貯藏期間的穩(wěn)定性，貯藏20 d后多酚保留率比未微囊化保留率高43.79百分點。微囊化后，桑多酚抗氧化活性未受影響，·OH、DPPH·和O-2 ·清除率與桑多酚相當。

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