郇 靖 苗德光 陸玉成 鄭 昊

（1.臨沂市人民醫(yī)院針灸科，山東 臨沂 276003；2.臨沂市人民醫(yī)院中醫(yī)門診，山東 臨沂 276003；3.臨沂市人民醫(yī)院生物標(biāo)本庫，山東 臨沂 276003；4.臨沂市人民醫(yī)院康復(fù)科，山東 臨沂 276003）

功能性消化不良（Functional dyspepsia，F(xiàn)D）是臨床常見的功能性胃腸疾病，具有起病緩慢、時(shí)輕時(shí)重、反復(fù)發(fā)作、病程纏綿等特點(diǎn)，多表現(xiàn)為餐后飽脹、早飽感、上腹部疼痛、上腹部燒灼感等癥狀，無生化異常，且不能用器質(zhì)性、系統(tǒng)性或代謝性疾病等來解釋，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］。本病歸屬于中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“痞滿”等范疇，世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)消化病專業(yè)委員會(huì)在痞滿中醫(yī)臨床實(shí)踐指南中推薦使用的柴胡舒肝散起主要作用的是柴胡-枳殼（CH-ZQ）。據(jù)《中華人民共和國藥典》［2］記載，柴胡味辛、苦，性微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，能疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣，用于感冒發(fā)熱、寒熱往來、胸脅苦滿等病證；枳殼味苦、辛、酸，性微寒，歸脾、胃經(jīng)，能理氣寬中、行滯消脹，用于胸脅苦滿、食積不化、痰飲內(nèi)停等病證，二者共用治療肝氣郁滯的慢性胃炎、FD［3］等脾胃病，效果確切。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上的一種新方法，為預(yù)測(cè)藥物作用于疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路提供了可靠的研究平臺(tái)［4］。文章擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法預(yù)測(cè)柴胡-枳殼藥對(duì)治療FD的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫本研究主要采用Cytoscape 3.7.1 軟件及插件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)可視化圖和數(shù)據(jù)分析，主要使用數(shù)據(jù)庫包括TCMSP、GeneCards、STRING等。

1.2 柴胡-枳殼藥對(duì)活性成分篩選通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫搜集柴胡-枳殼藥對(duì)的所有化學(xué)成分，時(shí)間截至2022年4月，篩選OB≥30%、DL≥0.18，得到有效活性成分。

1.3 柴胡-枳殼活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過GeneCards 以“Functional dyspepsia”為關(guān)鍵詞檢索收集疾病相關(guān)的基因。運(yùn)用韋恩圖進(jìn)行疾病靶點(diǎn)與中藥活性成分作用靶點(diǎn)交集，然后運(yùn)用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建柴胡-枳殼活性成分-靶點(diǎn)和疾病-靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)圖。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將獲得的靶點(diǎn)基因上傳至在線STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫，蛋白質(zhì)參數(shù)評(píng)分值＞0.57，根據(jù)結(jié)果對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分析。

1.5 富集分析本研究將已經(jīng)獲得的柴胡-枳殼與疾病共有的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行功能注釋和富集分析，進(jìn)一步探討藥物治療FD的作用靶點(diǎn)及其信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 柴胡-枳殼活性成分篩選獲得主要化學(xué)成分柴胡349 個(gè)、枳殼17 個(gè)。篩選后得到22 個(gè)有效活性成分，藥物靶點(diǎn)蛋白471個(gè)。

2.2 柴胡-枳殼活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建FD的相關(guān)靶點(diǎn)1561 個(gè)，通過韋恩圖獲得柴胡-枳殼藥對(duì)與疾病共有靶點(diǎn)59個(gè)，運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建柴胡-枳殼活性成分-疾病-靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)圖，見圖1。

圖1 柴胡-枳殼活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將獲得的59 個(gè)共有靶點(diǎn)上傳至在線STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，設(shè)置蛋白質(zhì)參數(shù)評(píng)分值＞0.57，獲得55個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，具體作用關(guān)聯(lián)見圖2。

圖2 柴胡-枳殼治療FD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 富集分析在2.3 步驟中得到關(guān)鍵靶蛋白以后，利用在線STRING 11.0 對(duì)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO）功能富集分析，在GO富集分析中，確定了生物過程（BP）1052 個(gè)、細(xì)胞組分（CC）71 個(gè)、分子功能（MF）134 個(gè)，確定了149 條相關(guān)信號(hào)通路，涉及抗癌、炎癥、細(xì)胞凋亡、內(nèi)分泌、免疫調(diào)節(jié)等方面，主要有PI3K-AKT、AGE-RAGE、HIF-1等經(jīng)典信號(hào)通路，列舉了前20個(gè)條目，見圖3。

3 討論

FD 是一種臨床常見病，其診斷采用羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）餐后飽脹不適、早飽感、上腹痛、上腹部燒灼感；（2）無可以解釋上述癥狀的結(jié)構(gòu)性疾病的證據(jù)（包括胃鏡檢查等），必須滿足餐后不適或上腹痛綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。符合以上標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)，且診斷前癥狀出現(xiàn)至少6 個(gè)月，近3 個(gè)月符合診斷標(biāo)準(zhǔn)。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常采用促胃動(dòng)力藥、抑酸劑、抗抑郁藥對(duì)癥治療FD，但不良作用較多，并且容易復(fù)發(fā)?！吨T病源候論》認(rèn)為本病“由憂恚所致，憂恚則氣結(jié)，氣結(jié)則不宣流”，病機(jī)以脾虛肝郁氣滯為主。中醫(yī)臨床常采用理氣解郁補(bǔ)脾的治法，代表方為柴胡疏肝散。管春林［6］通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散治療肝郁氣滯型FD 效果顯著，且安全性高，無明顯不良反應(yīng)。但未闡明柴胡-枳殼藥對(duì)治療此病的靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科［7］。PPI 網(wǎng)絡(luò)表明，柴胡-枳殼可能通過VEGFA、MAPK8、EGFR、CCND1、MYC、IL6、CASP3 等59 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)治療FD。GO 和KEGG 富集分析表明，柴胡-枳殼治療FD 涉及多方面生物學(xué)過程和多條中藥信號(hào)通路參與，尤其在酶的活性、蛋白質(zhì)合成調(diào)控、受體活性、細(xì)胞因子活性、生物合成過程的調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控等方面。FD 的發(fā)生與細(xì)胞的自噬與凋亡或許存在關(guān)系，有研究［8］表明，過度自噬可能是胃腸動(dòng)力障礙疾病發(fā)生的機(jī)制之一。在柴胡-枳殼與FD 的KEGG 富集分析中相關(guān)度最高的前10 條，除了多通路抗癌效果明顯之外，PI3K-AKT 信號(hào)通路的下游mTOR 信號(hào)通路被抑制后可通過調(diào)控細(xì)胞周期、核糖體蛋白合成等，抑制細(xì)胞自噬及增強(qiáng)細(xì)胞間縫隙連接治療FD［9］。最近的研究［10］表明，發(fā)生在細(xì)胞中的生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子和活性氧平衡的改變，可能是造成FD 的原因之一。這表明柴胡-枳殼也可能通過該途徑作用于FD。

柴胡-枳殼藥對(duì)在消化系統(tǒng)臨床應(yīng)用中非常廣泛，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)以及方法進(jìn)行探討，盡管存在一定的局限性，但是從藥物成分靶標(biāo)以及疾病靶標(biāo)的關(guān)系入手，初步預(yù)測(cè)了柴胡-枳殼治療FD 的關(guān)鍵作用蛋白，探討了其治療FD 的可能作用機(jī)制，為接下來進(jìn)一步用分子生物學(xué)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了參考和依據(jù)。