趙雨欣,張哲文,考惠霞,孫永江,辛智鳴,趙 喆,董樹斌①,程 瑾② (.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/ 林木育種與生態(tài)修復(fù)國(guó)家工程中心/ 花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 0008;.北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院/ 森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 0008;.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院沙漠林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心,內(nèi)蒙古 磴口 0500)

我國(guó)沙棘(Hippophaerhamnoides)天然資源和人工種植面積均居世界首位,截至2018年我國(guó)沙棘種植總面積約占全球沙棘種植總面積的93%,截至2022年我國(guó)83%的人工沙棘林分布于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、青海和陜西5個(gè)省(區(qū))[1-2]。沙棘具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐寒、耐旱、耐風(fēng)蝕、抗鹽堿、防病蟲害和根系較發(fā)達(dá)等特性,常被視為水土保持、氣候調(diào)節(jié)和沙漠治理的重要先鋒樹種,在我國(guó)三北地區(qū)得到大范圍推廣和種植[3]。此外,沙棘為藥食同源植物,其各個(gè)器官,尤其是果實(shí)、根、莖、葉中都富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì)等[4],如維生素、類胡蘿卜素、有機(jī)酸、不飽和脂肪酸和一些必需氨基酸等,在飲食品、醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域得到廣泛利用,具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益[5]。

近幾年,隨著我國(guó)對(duì)沙棘價(jià)值的持續(xù)關(guān)注,雜交育種、分子育種等技術(shù)在沙棘品種選育中得到了廣泛應(yīng)用,再加上國(guó)外優(yōu)良沙棘種質(zhì)資源的不斷引進(jìn),出現(xiàn)了一大批親緣關(guān)系較近,生物學(xué)特性、生態(tài)適應(yīng)性、品質(zhì)性狀良莠不齊的品系,給沙棘的良種鑒定和審定,種苗的保存、生產(chǎn)和管理,沙棘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和水土保持重要品種的選擇帶來了困擾。鑒于上述情況,傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)鑒定方法已不能很好滿足對(duì)沙棘品種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定和研究的需求,孫燕琳等[6]通過篩選葡萄的SSR引物對(duì)沙棘遺傳多樣性進(jìn)行分析,趙春娥等[7]利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)進(jìn)行沙棘聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)程序的優(yōu)化和引物篩選,但這兩種標(biāo)記都存在引物挑選和組合的局限性;邵珊珊[8]利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(random amplified polymorphic,RAPD)對(duì)沙棘品種進(jìn)行鑒定,但RAPD由于沒有DNA探針等原因造成結(jié)果穩(wěn)定性差,可重復(fù)率較低。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)又稱微衛(wèi)星序列標(biāo)記(MS)或短串聯(lián)重復(fù)標(biāo)記(STR),是以PCR為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)[9]。SSR具有高度重復(fù)性、豐富多態(tài)性、共顯性和高度可靠性等優(yōu)點(diǎn)[10],被廣泛應(yīng)用于梨[11]、楊樹[12]和建蘭[13]等植物品種鑒定、遺傳多樣性研究及核心種質(zhì)評(píng)價(jià)等相關(guān)領(lǐng)域。SSR可分為兩類:分布在整個(gè)基因組序列中的基因組SSR(gSSR)和嵌入轉(zhuǎn)錄序列中的表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(EST-SSR)[14]。EST-SSR具有易操作、易重復(fù)、準(zhǔn)確度較高和變異較豐富的優(yōu)點(diǎn),具有很好的種間傳遞性,且出現(xiàn)無效等位基因的概率小[15-16]。不僅如此,由于EST-SSR是在基因組的編碼區(qū)域中被識(shí)別的,與gSSR相比,EST-SSR的使用成本相對(duì)較低,已廣泛應(yīng)用于很多無參考基因組的物種[17]。目前,EST-SSR多用于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和品種鑒定等研究工作。

“實(shí)優(yōu)1號(hào)”是我國(guó)在20世紀(jì)80年代后期從芬蘭引進(jìn)的沙棘中選育的新品種,生長(zhǎng)速度快,產(chǎn)量高,沙棘油含量高,有較好的抗寒、抗旱、耐鹽堿及抗干縮病能力[18-20],在我國(guó)多個(gè)省份得到廣泛栽培。筆者研究對(duì)沙棘品種“實(shí)優(yōu)1號(hào)”的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,挖掘出大量EST-SSR序列,使用微衛(wèi)星識(shí)別軟件(microsatellite identification tool,MISA)識(shí)別SSR序列并根據(jù)其序列特征進(jìn)行引物設(shè)計(jì),結(jié)合TP-M13-SSR毛細(xì)管電泳技術(shù)篩選出一套SSR多態(tài)性較高的引物,對(duì)收集的沙棘材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建,為沙棘優(yōu)良品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料的采集與處理

供試的42份沙棘材料由國(guó)家林業(yè)和草原局國(guó)有林場(chǎng)和種苗管理司、中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院沙漠林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心、山西省林業(yè)和草原科學(xué)研究院、山西省桑干河楊樹豐產(chǎn)林實(shí)驗(yàn)局等多家單位提供(表1[18-31])。試驗(yàn)材料為沙棘的無病蟲害健康葉片、枝條等,以幼嫩葉片為優(yōu)(指位于沙棘植株枝條上部,剛發(fā)育形成、尚未完全開展或剛開展的葉片),每份材料至少隨機(jī)抽取3個(gè)單株,采樣后置于裝有變色硅膠的自封袋中備用(變色硅膠量沒過樣品即可)。

表1 42份沙棘品種信息[18-31]Table 1 Information of 42 Hippophae rhamnoides varieties

1.2 DNA提取

利用自動(dòng)磨樣機(jī)(MiniBeadbeater-96)結(jié)合天根生物公司DP320-02試劑盒提取DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)(NanoDrop 2000,Thermo Scientific)檢測(cè)DNA質(zhì)量、濃度和純度,樣品D260/D280值以1.7～1.9之間為宜,于-20 ℃條件下儲(chǔ)存。

1.3 EST序列來源

采集“實(shí)優(yōu)1號(hào)”新鮮的幼嫩葉片用于RNA提取和cDNA文庫(kù)構(gòu)建。經(jīng)文庫(kù)質(zhì)檢后使用Illumina NovaSeq 6000(Illumina,USA)S4套組組件,利用Illumina Hiseq 2000平臺(tái)(Illumina,USA)進(jìn)行高通量測(cè)序,將所得序列利用Trinity[32]拼接成獨(dú)立基因集,即一個(gè)由EST序列拼接成的轉(zhuǎn)錄組。

1.4 SSR位點(diǎn)識(shí)別及引物合成

利用MISA(http:∥pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html,默認(rèn)參數(shù))查找沙棘EST-SSR位點(diǎn),利用Primer 3(version 2.3.4)設(shè)計(jì)引物。對(duì)原有上游引物5′端進(jìn)行M13(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)修飾,然后合成3′端具有熒光的M13接頭〔6-羧基熒光素(6-carboxy-fluorescein,FAM)、六氯-6-甲基熒光素(6-hexachloro-fluorescein,HEX)、甲基-X-羅丹明(6-carboxy-x-rhodamine,ROX)、6-NED炔烴(6-NED alkyn,NED)〕,通過序列互補(bǔ)進(jìn)行標(biāo)記,檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 PCR擴(kuò)增及SSR基因分型檢測(cè)

25 μL的PCR反應(yīng)體系:2×TaqPCR預(yù)混試劑Ⅱ 17.5 μL,10 μmol·L-1正、反向引物各1.0 μL,10 μmol·L-1M13熒光標(biāo)記引物0.5 μL,基因組DNA 0.8 μL,ddH2O 4.2 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s(每個(gè)循環(huán)降低1 ℃),72 ℃延伸30 s,共6個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,12 ℃保存。采用ABI-3730XL基因分析儀(Applied Biosystems,Foster City,CA)對(duì)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳,檢測(cè)熒光信號(hào)和位點(diǎn)出峰情況。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

利用28對(duì)引物對(duì)42份沙棘材料進(jìn)行多態(tài)性分析,用GeneMarker(version 2.2.0)(SoftGenetics,USA)讀取毛細(xì)管電泳產(chǎn)物大小,根據(jù)產(chǎn)物大小對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行判讀和整理,記錄結(jié)果時(shí),純合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/X,其中X為該位點(diǎn)等位變異的大小;雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y,其中X、Y分別為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異,小片段數(shù)據(jù)在前,大片段數(shù)據(jù)在后,采用Excel對(duì)相關(guān)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì);利用Convert(version 1.31)進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換,再利用Popgene(version 1.32)和Cervus(version 3.0.7)計(jì)算每對(duì)引物的遺傳多樣性參數(shù),比較引物多態(tài)性;利用OriginPro 2010(version 9.8.0.200)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析;利用NTSYSpc(version 2.10e)分析遺傳相似性系數(shù),繪制UPGMA聚類樹狀圖[33],并基于NTSYSpc(version 2.10e)軟件中的MxComp功能分析相似性系數(shù)間的相關(guān)性,評(píng)價(jià)系統(tǒng)樹狀圖的質(zhì)量,分析品種間的親緣關(guān)系;最后優(yōu)選引物組合鑒定所有品種,將所選引物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(n)代入公式(P=1/2n)計(jì)算相同指紋圖譜出現(xiàn)的概率(P)[34]。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘轉(zhuǎn)錄組的產(chǎn)出及質(zhì)量檢測(cè)

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示,“實(shí)優(yōu)1號(hào)”獲得的原始序列數(shù)(raw reads)為22 456 907條,對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、質(zhì)控后獲得高質(zhì)量干凈讀長(zhǎng)(clean reads)為21 738 111條,占原始序列的96.80%;堿基質(zhì)量值Q20為97.46%,堿基質(zhì)量值Q30為92.91%;序列拼接后GC含量為41.87%。以上數(shù)據(jù)表明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠,品質(zhì)較好,可進(jìn)行下一步分析。

2.2 沙棘轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)信息及組成

利用MISA識(shí)別“實(shí)優(yōu)1號(hào)”轉(zhuǎn)錄本的unigene序列,檢測(cè)到總序列數(shù)為25 286條,總序列長(zhǎng)度為33 604 162 bp;對(duì)SSR位點(diǎn)進(jìn)行搜索發(fā)現(xiàn)含SSR的序列為5 205條,SSR位點(diǎn)總數(shù)為6 196個(gè),其中復(fù)合型(C型)SSR位點(diǎn)僅為447個(gè),占位點(diǎn)總數(shù)的7.21%;完全重復(fù)型(P型)SSR位點(diǎn)為5 749(92.79%)個(gè)。

沙棘轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)信息見表2。

表2 沙棘轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)信息Table 2 Information of SSR loci in transcriptome of Hippophae rhamnoides

表2顯示,在沙棘P型SSR位點(diǎn)中,單核苷酸重復(fù)型、二核苷酸重復(fù)型和三核苷酸重復(fù)型為主要重復(fù)類型,其中單核苷酸重復(fù)型基序?yàn)? 019個(gè),在總位點(diǎn)數(shù)中占比最高,為48.72%。對(duì)P型SSR位點(diǎn)進(jìn)行搜索共發(fā)現(xiàn)182種基序,(A/T)n占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),共3 003個(gè),占此重復(fù)基序的99.47%,占總位點(diǎn)數(shù)的48.47%;二核苷酸重復(fù)型中(AC/GT)n最少,僅占總位點(diǎn)數(shù)的0.44%;三核苷酸和四核苷酸重復(fù)型中,(GAA/TTC)n和(AAAG/CTTT)n出現(xiàn)頻率較高;五核苷酸和六核苷酸重復(fù)型中,主要基序分別為(AAAAG/CTTTT)n和(TCTGCT/AGCAGA)n。

2.3 沙棘轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)基序重復(fù)次數(shù)

沙棘轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)中,不同基序類型SSR重復(fù)次數(shù)情況(圖1)顯示,單、二和三核苷酸基序重復(fù)次數(shù)集中在10～15、6～10和5～7次;四、五和六核苷酸基序重復(fù)次數(shù)集中在5～6次。其中,當(dāng)重復(fù)次數(shù)為10時(shí),SSR位點(diǎn)數(shù)為1 726個(gè),占總SSR位點(diǎn)數(shù)比例最高(27.86%);5次和6次重復(fù)次數(shù)的SSR位點(diǎn)數(shù)分別為630(10.17%)和637個(gè)(10.28%);當(dāng)重復(fù)次數(shù)為20時(shí),SSR位點(diǎn)數(shù)占比最少,僅21個(gè)(0.34%)。上述結(jié)果也表明,SSR位點(diǎn)中不同重復(fù)類型的頻率,隨重復(fù)次數(shù)的增加而減小。

圖1 轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的基序重復(fù)次數(shù)分布Fig.1 Distribution of repeat numbers of SSR motifs in transcriptome

2.4 沙棘轉(zhuǎn)錄組SSR序列長(zhǎng)度及變異

沙棘轉(zhuǎn)錄組SSR序列長(zhǎng)度為10～264 bp,平均長(zhǎng)度為19.05 bp。SSR序列中10 bp的序列數(shù)量最多,占總位點(diǎn)數(shù)的25.13%(圖2)。

圖2 沙棘轉(zhuǎn)錄組不同SSR序列長(zhǎng)度的出現(xiàn)頻率Fig.2 Frequency of SSR with different lengths in transcriptome of Hippophae rhamnoides

P型SSR序列中,基序長(zhǎng)度變異情況非常豐富,同時(shí)隨著不同重復(fù)型SSR長(zhǎng)度的增加其序列出現(xiàn)頻率也逐漸降低(圖3)。單核苷酸重復(fù)的長(zhǎng)度變化最大,為81 bp,平均長(zhǎng)度為11.56 bp(表2);(C/G)n與(A/T)n平均長(zhǎng)度分別為12.50和11.55 bp;二核苷酸重復(fù)的各基元類型中,(AC/GT)n平均長(zhǎng)度為14.22 bp(最短),(AG/CT)n平均長(zhǎng)度為18.25 bp(最長(zhǎng))。Pearson相關(guān)分析表明重復(fù)單元長(zhǎng)度與SSR平均長(zhǎng)度呈正相關(guān)(P<0.005)。

圖3 不同重復(fù)單元SSR序列長(zhǎng)度的變異情況Fig.3 Variation in sequence length of different types of SSR

2.5 沙棘SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性及遺傳多樣性參數(shù)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得沙棘SSR位點(diǎn)信息,利用6 196個(gè)SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)出4 681對(duì)SSR引物,設(shè)計(jì)成功率為75.55%。為了驗(yàn)證SSR的有效性,隨機(jī)選取不同類型SSR位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,從擴(kuò)增成功的引物中選取28對(duì)多態(tài)性好的引物。利用這28對(duì)引物在42份沙棘品種中檢測(cè)出193個(gè)等位基因位點(diǎn),每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)為3.000～13.000,均值為6.964。這些沙棘品種的有效等位基因數(shù)(Ne)為1.849～6.380,均值為3.495;多態(tài)性信息含量(PIC)為0.398～0.824,均值為0.623;Shannon信息指數(shù)(I)最大值為2.071,最小值為0.779,均值為1.384;觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.310～0.857和0.459～0.843,均值分別為0.617和0.671(表3)。

表3 28對(duì)SSR引物在42份沙棘品種中的遺傳信息Table 3 Genetic information of 28 pairs of SSR primers in 42 varieties of Hippophae rhamnoides

2.6 沙棘品種間親緣關(guān)系

遺傳相似性系數(shù)可用于評(píng)估遺傳相似程度,遺傳相似性系數(shù)越大,表明兩者間的相似程度越高,親緣關(guān)系越近。在42份沙棘品種及近緣種中,遺傳相似性系數(shù)最小的為“深秋紅”和“無刺雄”(0.601),說明兩者相似程度低,親緣關(guān)系遠(yuǎn)。遺傳相似性系數(shù)最大的為“狀元黃”和“楚伊”(0.990)、“豐產(chǎn)”和“特豐1號(hào)”(0.990)以及“阿列依”和“烏蘭沙林”(0.990),說明兩者間相似程度高,親緣關(guān)系近。UPGMA聚類結(jié)果顯示,當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.694時(shí),42份材料被分為2組,當(dāng)遺傳相似性系數(shù)約為0.740 2時(shí),所有品種被分為3組(圖4)。基于MxComp功能分析相似性系數(shù)間的相關(guān)系數(shù)為0.782,數(shù)值接近于1,表明聚類分析結(jié)果較好。

圖4 42份沙棘品種的聚類分析Fig.4 Dendrogram of 42 Hippophae rhamnoides varieties

2.7 沙棘品種指紋圖譜

根據(jù)28對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果,綜合分析PIC值、擴(kuò)增片段大小和等位基因數(shù)等指標(biāo),選取SS6、SS13、SS30、SS40、SS62和SS189這6對(duì)引物構(gòu)建沙棘DNA指紋圖譜(表4),表4顯示,“烏蘭沙林”經(jīng)引物SS6擴(kuò)增后有兩個(gè)不同的等位變異,分別為123和125 bp;經(jīng)引物SS13擴(kuò)增后有兩個(gè)不同的等位變異,分別為272和287 bp;經(jīng)引物SS30擴(kuò)增后有一個(gè)等位變異,為257 bp;經(jīng)引物SS40擴(kuò)增后有一個(gè)等位變異,為312 bp;經(jīng)引物SS62擴(kuò)增后有兩個(gè)不同的等位變異,分別為286和292 bp;經(jīng)引物SS189擴(kuò)增后有兩個(gè)不同的等位變異,分別為264和273 bp,表4中其他數(shù)據(jù)同上述意義。這些引物在全部品種中檢測(cè)到的多態(tài)性位點(diǎn)共57個(gè),即兩個(gè)品種之間相同指紋圖譜出現(xiàn)的概率為1/257,表明出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率極低。因此,選用這6對(duì)引物構(gòu)建沙棘DNA指紋圖譜,可以實(shí)現(xiàn)沙棘品種的快速準(zhǔn)確鑒定。

表4 42份沙棘品種指紋圖譜Table 4 Fingerprint of 42 Hippophae rhamnoides varieties

3 討論

筆者對(duì)“實(shí)優(yōu)1號(hào)”轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到的干凈讀長(zhǎng)占原始序列的96.80%;Q30值高達(dá)92.91%;轉(zhuǎn)錄本unigene序列為25 286條;SSR位點(diǎn)總數(shù)為6 196個(gè)。不同植物中主要的SSR重復(fù)類型不同,但大部分為二、三核苷酸重復(fù),如榆樹[35]、大麻[36]。沙棘P型SSR位點(diǎn)重復(fù)類型中,優(yōu)勢(shì)基序分別為(A/T)n、(AT/TA)n和(GAA/TTC)n。影響SSR中短重復(fù)單元含量的因素有物種進(jìn)化時(shí)間、物種變異頻率等[37],沙棘轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)類型較豐富且短重復(fù)單元含量多,這與WANG等[17]的研究結(jié)果一致,除了單核苷酸重復(fù)外,二核苷酸重復(fù)是沙棘EST-SSR中最常見的位點(diǎn),其次是三核苷酸重復(fù),這也與李珊珊等[38]根據(jù)蒙古沙棘轉(zhuǎn)錄組開發(fā)EST-SSR的研究結(jié)果相似。從沙棘SSR重復(fù)基序類型來看,AT含量越高的基序出現(xiàn)的頻率也就越高,而且SSR重復(fù)基序的長(zhǎng)度越長(zhǎng),SSR發(fā)生的頻率越低,這也與戴亞平[39]的研究結(jié)論一致。沙棘基因組的編碼區(qū)域SSR位點(diǎn)豐富多樣,為SSR引物開發(fā)及后續(xù)研究提供可能。

筆者研究中沙棘材料主要為國(guó)家林業(yè)和草原局林木品種審定委員會(huì)及地方林業(yè)和草原部門審定的林木良種,生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng),是適用于干旱半干旱廣大區(qū)域種植的主栽品種,基于這些研究材料的SSR引物的篩選和親緣關(guān)系分析具有重要參考價(jià)值。利用28對(duì)多態(tài)性引物對(duì)42個(gè)品種進(jìn)行分析,Na、Ne、Ho、He、PIC和I等遺傳多樣性參數(shù)均明顯高于李賀等[40]利用基于RNA-seq數(shù)據(jù)的17對(duì)引物對(duì)沙棘不同品種進(jìn)行SSR的試驗(yàn)結(jié)果。筆者研究中PIC范圍為0.398～0.824,均值為0.623;而李賀等[40]的試驗(yàn)結(jié)果中PIC為0.150 7～0.588 6,均值為0.271 0,該P(yáng)IC較低的原因可能是供試沙棘材料有多個(gè)雜交品種/品系,親本親緣關(guān)系較近導(dǎo)致多樣性降低。與上述沙棘遺傳多樣性研究相比,筆者研究中沙棘品種來源豐富度高,包括引種、選育和雜交等不同類型,且包括多種不同雜交組合(表1),因此,這些品種的遺傳多樣性更高。PIC可用來衡量微衛(wèi)星DNA的變異程度:0表示無多態(tài)性;PIC值越趨近于1,表示多態(tài)性越高。BOTSTEIN等[41]首次提出:當(dāng)PIC>0.5時(shí),引物具有高度多態(tài)性;當(dāng)0.5

我國(guó)沙棘良種的選育首先集中于對(duì)我國(guó)天然沙棘的研究和篩選,如“無刺雄”“森淼”;隨后開始從國(guó)外引進(jìn)優(yōu)良品種,如俄羅斯大果沙棘“阿列依”“向陽(yáng)”“豐產(chǎn)”“楚伊”“渾金”“橙色”和“阜歐”等,從芬蘭引進(jìn)“實(shí)優(yōu)1號(hào)”“海濱沙棘”等,從蒙古引進(jìn)“烏蘭格木”等。在品種引進(jìn)的基礎(chǔ)上,開始選育或雜交育種工作,如“烏蘭沙林”“草新2號(hào)”是由“烏蘭格木”實(shí)生子代選育的,“棕丘”“遼阜1號(hào)”“白丘”是由“楚伊”實(shí)生子代選育的。雜交組合后代優(yōu)勢(shì)明顯,如“中棘1號(hào)”“中棘2號(hào)”“中棘3號(hào)”“中棘4號(hào)”“中棘25號(hào)”“紅棘1號(hào)”“紅棘2號(hào)”都是以蒙古沙棘亞種優(yōu)良品種“烏蘭格木”為母本,以中國(guó)沙棘優(yōu)良無性系“豐寧”為父本雜交的[42]。UPGMA聚類中,當(dāng)遺傳相似性系數(shù)約為0.740 2時(shí)沙棘品種分為3支,其中“烏蘭格木”“豐寧”和中棘系列分別聚類為一支,且當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.694時(shí)“烏蘭格木”與中棘系列聚為一支,這一結(jié)果與RUAN[43]和李賀等[40]對(duì)蒙古沙棘、中國(guó)沙棘雜交品種/品系的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

該研究分析了沙棘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),挖掘出SSR位點(diǎn)6 196個(gè),篩選出28對(duì)多態(tài)性引物,選用SS6、SS13、SS30、SS40、SS62和SS189這6對(duì)引物,構(gòu)建了沙棘指紋圖譜,對(duì)42份沙棘品種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定,相關(guān)研究結(jié)果能夠?yàn)樯臣姆N質(zhì)鑒定、分類、保護(hù)和利用等提供支撐。