孫源 ，王丹陽(yáng)，孫晶，范蓓，宋洪波，劉新民，盧聰*，王鳳忠*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193

2.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002

3.寧波大學(xué) 新藥技術(shù)研究院，浙江 寧波 315000

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥參與了多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，如抑郁癥、帕金森綜合征、阿爾茨海默病等[1]。研究證明，神經(jīng)炎癥是神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的重要因素之一[2]。大量研究表明，當(dāng)免疫細(xì)胞被激活后，可產(chǎn)生多種致炎因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、一氧化氮（NO）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等，炎癥因子在腦內(nèi)堆積過(guò)多則能引起腦內(nèi)神經(jīng)元死亡，造成不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)炎癥[3-4]。由此可見，致炎細(xì)胞因子對(duì)激活免疫細(xì)胞以及正反饋調(diào)控炎癥介質(zhì)的分泌是必不可少的，而這些作用又與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。因此，如何有效控制神經(jīng)炎癥的發(fā)生或是減輕神經(jīng)炎癥能夠?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)疾病提供有效的改善方法。BV2小膠質(zhì)細(xì)胞是一類先天固有的免疫細(xì)胞，占腦細(xì)胞總數(shù)的10%～15%，與外周巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞作用類似，能夠作為腦的免疫屏障抵抗疾病和外界刺激[5]。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著核心作用[6]。正常狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，當(dāng)腦內(nèi)產(chǎn)生感染或損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，啟動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的自我修復(fù)，感染及損傷恢復(fù)后小膠質(zhì)細(xì)胞又處于靜息狀態(tài)[7]。如果外界刺激因子及腦感染、損傷不斷激活小膠質(zhì)細(xì)胞，則會(huì)打破免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[8]，釋放出TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS等炎性因子，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷，產(chǎn)生神經(jīng)炎癥。脂多糖（LPS）是革蘭陰性細(xì)菌外膜的中心組分，LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活是常用的一種體外神經(jīng)炎癥模型[9]，常用于天然活性成分的篩選及基于抗炎發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功效有效組分的機(jī)制探索。

檳榔具有驅(qū)蟲、改善消化功能、神經(jīng)保護(hù)、改善心血管系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗菌等作用[10]，其中檳榔堿被視為檳榔發(fā)揮生物活性的主要活性成分，在檳榔果中占比0.3%～0.6%[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，檳榔堿具有抗炎[12]、抗抑郁[13]、改善神經(jīng)系統(tǒng)[14-16]、抑制病毒蛋白活性[17]等多種功效。張偉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，檳榔堿能抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、細(xì)胞間黏附分子1（ICM-1）mRNA的表達(dá)，減輕細(xì)胞炎癥。吳江濤[19]在研究中指出，檳榔堿的抗炎機(jī)制與阻礙核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路、抑制細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子有關(guān)。為充分揭示檳榔堿對(duì)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的改善效果及調(diào)控機(jī)制，本研究采用LPS誘導(dǎo)小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞所致神經(jīng)炎癥模型探究檳榔堿的神經(jīng)保護(hù)作用及分子機(jī)制，以期為檳榔堿這一活性組分的藥用價(jià)值提供數(shù)據(jù)支持，并為檳榔的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑

BV2完全培養(yǎng)基（武漢尚恩生物技術(shù)有限公司）；檳榔堿（上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，貨號(hào)B74705-50 mg）；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)于Hyclone；BCA試劑盒（貨號(hào)P0012）、RIPA裂解液（貨號(hào)G2002）購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；DMSO（貨號(hào)D8371-50 mL）、CCK-8（貨號(hào)CA1210-500）細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于索萊寶科技有限公司；PVDF膜0.45 μm（貨號(hào)IPVH00010）購(gòu)于Millipore公司、Trizol美國(guó)Invitrogen公司；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP（10 mmol/L）、Premix Taq?、TB Green?Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）、DL2000 DNA Marker、RNase-free H2O、50×TAE購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；DNase I、6×Loading Dye、RNase Inhibitor、RL 6 000 RNA購(gòu)于Marker美國(guó)Fermentas公司；瓊脂糖購(gòu)于西班牙Biowest公司；甲醛（分析純）、異丙醇（分析純）、氯仿（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、10×MOPS購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司；GelRed染色試劑購(gòu)于美國(guó)Biotium公司；Real Time PCR 384孔板購(gòu)于瑞士Roche公司。

1.3 儀器

Herocell 180細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海潤(rùn)度生物科技有限公司）；低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；spectra MAX190酶標(biāo)儀（Molecular devices）；超微量核酸/蛋白分析儀（英國(guó)BioDrop μLite）；電泳儀（美國(guó)伯樂Bio-Rad）；EUV-LDUV凝膠成像系統(tǒng)（韓國(guó)KoreaBiotech公司）；Mupid 2plus電泳槽（日本TAKARA公司）；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀（Tanon公司）；掃描儀（EPSON公司）。2720型PCR儀（美國(guó)ABI公司）；DHG-9240A鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒公司）；Roche LightCycler?480II實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（瑞士Roche公司）；Olympus BX53倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

BV2細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 模型制備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞進(jìn)行鋪板。以5×104/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)12 h。棄除原有培養(yǎng)基，空白組換上等量培養(yǎng)基，LPS組換上含有LPS對(duì)應(yīng)濃度（0.01、0.1、1、10、20 μg/mL）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[20]。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組

LPS和檳榔堿用細(xì)胞級(jí)DMSO溶解后分裝儲(chǔ)存在-20 ℃，避免反復(fù)凍融。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞進(jìn)行鋪板，將細(xì)胞分為空白組、模型組、檳榔堿（10、20、40 μmol/L）組。鋪板12 h后，棄除原培養(yǎng)基，空白組和模型組換上等量培養(yǎng)基，檳榔堿組則換上含有對(duì)應(yīng)濃度檳榔堿（10、20、40 μmol/L）的培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)保護(hù)，換液2 h后，模型組和檳榔堿組加入含相應(yīng)質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)基，空白組則加入等量培養(yǎng)基，LPS造模濃度從2.2項(xiàng)中得出。

2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞進(jìn)行鋪板。以5×104個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)12 h。分別檢測(cè)LPS、檳榔堿、檳榔堿＋LPS對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響。再每組處理24 h后，每孔加入CCK-8工作液10 μL，繼續(xù)孵育2 h后，450 nm測(cè)定吸光度（A）值。

細(xì)胞存活率＝A加藥－A空白／A對(duì)照－A空白

2.5 分光光度法檢測(cè)NO含量

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞進(jìn)行鋪板。以5×104個(gè)/mL接種于24孔板中，每孔500 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)12 h。按照2.3項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按照試劑盒操作方法，檢測(cè)細(xì)胞中NO含量。

2.6 ELISA檢測(cè)相關(guān)炎癥因子

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞進(jìn)行鋪板。以5×104個(gè)/mL接種于6孔板中，每孔2 000 μL，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)12 h。按2.3項(xiàng)下處理細(xì)胞，離心收集上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平。

2.7 qPCR分析相關(guān)mRNA表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞進(jìn)行鋪板。以5×104個(gè)/mL接種于6孔板中，每孔2 000 μL，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)12 h。按照2.3項(xiàng)下分組處理細(xì)胞，用Trizol提取樣品RNA，最后加入100 μL無(wú)RNase的水，溶解RNA。按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，用NanoDrop定量，并按照說(shuō)明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。后按照文獻(xiàn)報(bào)道方法[20]進(jìn)行處理。使用β-actin作為內(nèi)參基因，采用分析數(shù)據(jù)，qPCR所用引物見表1。

2.8 Western blotting法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

2.8.1 細(xì)胞蛋白提取 按2.3項(xiàng)下分組處理細(xì)胞24 h后，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，使用預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，置于-4 ℃充分裂解30 min，并每隔5 min振蕩30 s。裂解結(jié)束后12 000 r/min，4 ℃，5 min。取上清，進(jìn)行蛋白定量。

2.8.2 蛋白濃度測(cè)定及樣品制備 按照BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明操作，測(cè)定蛋白濃度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并計(jì)算蛋白濃度。（1）根據(jù)所測(cè)目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，配制8%～10%分離膠；（2）將待測(cè)蛋白樣品以30 μg/孔上樣；（3）電泳：濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓120 V，通過(guò)預(yù)染蛋白Marker來(lái)確定電泳停止時(shí)間；（4）轉(zhuǎn)膜：去除濃縮膠、保留分離膠，裁剪合適大小的0.45 μm孔徑的PVDF膜，轉(zhuǎn)膜300 mA恒流，60 min；（5）封閉：取出的PVDF膜完全浸沒于5% BSA-TBST中，水平搖床孵育1 h；（6）一抗孵育：5% BSA-TBST稀釋一抗，磷脂酰肌醇激酶單克隆抗體（PI3KP85）、p-蛋白激酶B（Akt）、Akt、p-p65、環(huán)氧化酶2（COX2）、Toll樣受體4（TLR4）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）稀釋比例1∶1 000，p65、iNOS稀釋比例1∶500，4 ℃水平搖床孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10 min；（7）二抗孵育：5%BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG（H+L）HRP 1∶10 000室溫孵育1 h后TBST洗膜3次，每次10 min；（8）膠片曝光：ECL滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3～5 min后曝光2 min，顯影2 min，定影。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0做數(shù)據(jù)分析及繪圖。Image-PRO做灰度分析。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），LSD法驗(yàn)證兩兩比較的顯著性。

3 結(jié)果

3.1 不同質(zhì)量濃度LPS對(duì)BV2細(xì)胞存活率及NO含量的影響

如圖1所示，與空白組相比，在LPS作用BV2細(xì)胞24 h后，LPS各濃度組并未對(duì)BV2細(xì)胞存活率產(chǎn)生影響。而在0.01、0.1 μg/mL LPS作用BV2細(xì)胞24 h后，NO含量顯著下降（P＜0.05、0.01），分析原因可能是LPS濃度過(guò)低或是由于操作誤差空白組細(xì)胞量多于其他組，然而LPS 1、10、20 μg/mL組細(xì)胞中NO含量顯著升高（P＜0.001）。為確保成功建立模型的同時(shí)減少LPS對(duì)細(xì)胞的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1 μg/mL LPS進(jìn)行造模處理。

圖1 LPS對(duì)BV2細(xì)胞存活率和NO含量的影響（，n=5）Fig.1 Effect of LPS on BV2 cell viability rate and NO content (,n=5)

3.2 不同濃度檳榔堿對(duì)BV2細(xì)胞存活率和LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示，與空白組相比，在檳榔堿作用BV2細(xì)胞24 h后，檳榔堿10、20、40 μmol/L組細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異，可見此濃度范圍內(nèi)檳榔堿對(duì)BV2細(xì)胞沒有毒性作用。因此選擇10、20、40 μmol/L的檳榔堿與LPS共同作用對(duì)BV2存活率影響實(shí)驗(yàn)。

圖2 檳榔堿對(duì)BV2細(xì)胞存活率（A）和檳榔堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞存活率（B）的影響（，n=5）Fig.2 Effects of arecoline on BV2 cell viability rate (A) and arecoline on LPS induced BV2 cell viability rate (B) (,n=5)

與模型組相比，檳榔堿10 μmol/L組細(xì)胞存活率呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），而檳榔堿20、40 μmol/L組細(xì)胞存活率并未有顯著性影響。本課題組此前研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿在一定濃度范圍內(nèi)能促進(jìn)細(xì)胞增殖，分析導(dǎo)致檳榔堿10 μmol/L組細(xì)胞存活率顯著上升的原因可能是孔板邊緣效應(yīng)導(dǎo)致培養(yǎng)液揮發(fā)所致。

3.3 檳榔堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞NO含量的影響

如圖3所示，與空白組相比，模型組BV2細(xì)胞中NO含量顯著增加（P＜0.001）。與模型組相比，不同濃度的檳榔堿組預(yù)處理使BV2細(xì)胞NO含量顯著降低（P＜0.001）。結(jié)果表明，檳榔堿可以在一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的NO釋放。

圖3 檳榔堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞NO含量的影響（，n=5）Fig.3 Effect of arecoline on LPS induced content of NO in BV2 cells (,n=5)

3.4 檳榔堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

與空白組相比，BV2細(xì)胞經(jīng)LPS處理后TLR4、p-p65/p65、iNOS、COX2蛋白水平顯著升高（P＜0.001），而檳榔堿組干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)了此現(xiàn)象（P＜0.05、0.01、0.001），且呈濃度相關(guān)性。此結(jié)果表明檳榔堿可能通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)減輕LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥，見圖4。

3.5 檳榔堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

與空白組相比，模型組BV2細(xì)胞PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平顯著升高（P＜0.001）；與空白組相比，檳榔堿10、40 μmol/L組可顯著降低PI3K蛋白水平（P＜0.01、0.001），檳榔堿20、40 μmol/L組p-Akt/Akt蛋白水平出現(xiàn)顯著下降（P＜0.001）。此結(jié)果表明在檳榔堿可能通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)減輕LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥，見圖5。

圖5 檳榔堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響（，n=3）Fig.5 Effect of arecoline on PI3K/Akt signaling pathway-related proteins induced by LPS in BV2 cells (,n=3)

3.6 檳榔堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥因子的影響

采用qPCR和ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定檳榔堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥因子的影響。qPCR結(jié)果顯示，模型組BV2細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOSmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.001），檳榔堿各劑量組BV2細(xì)胞中炎癥因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P＜0.05、0.01、0.001）。ELISA結(jié)果顯示，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著增加，IL-10水平顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）；檳榔堿各劑量組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低，IL-10水平顯著升高（P＜0.01、0.001），見圖6。

圖6 檳榔堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥因子的影響（，n=5）Fig.6 Effect of arecoline on LPS induced release of inflammatory factors in BV2 cells (,n=5)

4 討論

本研究結(jié)果表明，檳榔堿可顯著抑制LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞中NO的釋放，降低細(xì)胞中COX2、iNOS、TLR4蛋白及TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表達(dá)，表明檳榔堿具有顯著的抗炎作用，對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞神經(jīng)炎癥具有顯著改善效果，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18-19]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)提高了PI3K與p-Akt蛋白水平，而檳榔堿干預(yù)則能顯著降低PI3K、p-Akt蛋白水平。當(dāng)Akt被激活時(shí)，隨之激活了下游促炎趨化因子NF-κB，大量炎癥因子釋放，聚集于炎癥組織細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)[21]。推測(cè)檳榔堿通過(guò)抑制Akt磷酸化，阻止NF-κB的激活，降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放，發(fā)揮抗炎作用。

TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)[22]，其可通過(guò)外源性和內(nèi)源性受體，結(jié)合相應(yīng)炎癥因子，完成炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)，激發(fā)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。多項(xiàng)研究表明，TLR4在炎癥調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[9,23]。LPS能夠結(jié)合BV2小膠質(zhì)細(xì)胞膜上的TLR4受體，上調(diào)TLR4蛋白表達(dá)，激活下游MyD88依賴性信號(hào)通路傳遞炎癥信號(hào)，進(jìn)一步激活NF-κB，從而誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)[24-25]。激活的NF-κB隨之進(jìn)入細(xì)胞核，與特定DNA有序結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）表達(dá)，加劇炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞組織。此外，分布在神經(jīng)元內(nèi)的NO也是機(jī)體促進(jìn)細(xì)胞炎癥的重要介質(zhì)[26]，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)大量iNOS，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生大量NO，而iNOS和COX2是NF-κB通路下游的2個(gè)靶點(diǎn)，大量游離NO的產(chǎn)生和NF-κB通路的激活也會(huì)使得iNOS和COX2高度表達(dá)，一并加重細(xì)胞炎癥[27]。本研究結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)損傷的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型中，TLR4和p65，炎癥蛋白COX2和iNOS的表達(dá)顯著上升，提示小膠質(zhì)細(xì)胞BV2中p65核轉(zhuǎn)位，下游炎癥通路被激活。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)模型組中TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達(dá)增多，細(xì)胞炎癥加劇。而檳榔堿能夠顯著抑制TLR4和p65，炎癥蛋白COX2和iNOS表達(dá)、抑制了p65的核轉(zhuǎn)位以及下游NF-κB炎癥通路的過(guò)度激活。

此外，PI3K是一種脂質(zhì)激酶，可誘導(dǎo)Akt磷酸化[28]，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞內(nèi)的下游信號(hào)如細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和分化，從而減輕細(xì)胞炎癥[29]。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路可以調(diào)控包括IL-6、IL-1β和TNF-α在內(nèi)的多種炎癥因子[30]。當(dāng)PI3K/Akt信號(hào)通路被激活后，可抑制TLR4的表達(dá)，從而減輕下游NF-κB炎癥通路的激活，下調(diào)炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的釋放，炎癥反應(yīng)得到緩解[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)可明顯促使BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中PI3K與p-Akt過(guò)表達(dá)，提示炎癥通路被激活，與之對(duì)應(yīng)的qPCR結(jié)果中顯示，炎癥因子IL-6、IL-1β、TNFα的釋放增加，細(xì)胞中炎癥反應(yīng)加劇。當(dāng)檳榔堿預(yù)處理后，小膠質(zhì)細(xì)胞BV2中PI3K與p-Akt含量顯著下降，并且通路下游炎性因子IL-6、IL-1β、TNFα的釋放得以抑制，提示炎癥反應(yīng)減弱。結(jié)果表明，檳榔堿可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB、PI3K/Akt信號(hào)通路抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)揮改善功效。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突