毛昀，蔡亞芳，褚雪鐳，薛鵬，曹文，朱世杰，仇永妹

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤血液科，長(zhǎng)沙 410005；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院；3 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院腫瘤科；4 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院互聯(lián)網(wǎng)醫(yī)院

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病死率居女性癌癥首位。骨轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤常見(jiàn)并發(fā)癥，65%～75%的進(jìn)展期乳腺癌患者可出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移，常發(fā)生于脊柱、骨盆和長(zhǎng)骨干骺端等部位，伴有病理性骨折、高鈣血癥、脊髓壓迫等骨相關(guān)事件［1］。骨轉(zhuǎn)移的治療策略包括骨保護(hù)劑、化療、放療、中醫(yī)藥等，雖然能夠在一定程度上緩解疼痛、延緩進(jìn)展，但效果有限。目前對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確，尋找早期預(yù)防、干預(yù)骨轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)和有效藥物是骨轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型是研究乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，建立可重復(fù)的、與臨床密切相關(guān)的動(dòng)物模型至關(guān)重要，亦能評(píng)估和檢測(cè)相關(guān)藥物的可靠性和安全性［2］。2022 年10 月—2023年9月，我們利用人源性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-luc和鼠源性乳腺癌細(xì)胞4T1-luc分別以左心室注射、脛骨骨髓腔注射、尾動(dòng)脈注射三種方式構(gòu)建乳腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型，評(píng)價(jià)造模成功率、腫瘤轉(zhuǎn)移變化過(guò)程，尋找最佳造模方式來(lái)模擬乳腺癌細(xì)胞從原發(fā)病灶轉(zhuǎn)移至骨組織的過(guò)程，旨在為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)選擇合理的動(dòng)物模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及細(xì)胞 SPF 級(jí)6 周齡BALC/c 裸小鼠24 只，體質(zhì)量16～18 g；SPF 級(jí)6 周齡BALC/c 普通小鼠16 只，體質(zhì)量18～20 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院動(dòng)物房，溫度（25 ± 3）℃，相對(duì)濕度55% ± 10%，12 h光暗交替，自由攝食飲水，每周更換2 次墊料，實(shí)驗(yàn)操作遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則。MDA-MB-231-luc 細(xì)胞、4T1-luc 細(xì)胞購(gòu)自國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)。

1.1.2 主要試劑與儀器 D-Luciferin 熒光素鈉鹽（廣州嘉美生物），異氟烷（深圳瑞沃德），EDTA（北京拜爾迪生物），蘇木素溶液、伊紅溶液（北京索萊寶），胎牛血清（美國(guó)Hyclone），4%多聚甲醛固定液（武漢博士德）。小動(dòng)物活體成像儀（美國(guó)Molecular Devices），倒置顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將MDA-MB-231-luc 和4T1-luc 細(xì)胞置于37 ℃水浴箱中快速震蕩融化，800 r/min離心3 min，分別加入含10% 胎牛血清的DMEM、RPMI1640 培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80% 左右即可傳代。PBS 漂洗，0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞回縮、胞體變圓即終止消化，800 r/min 離心3 min，按1∶3 進(jìn)行傳代。根據(jù)前期研究及參考文獻(xiàn)，調(diào)整MDA-MB-231-luc細(xì)胞密度為5 × 107/mL、4T1-luc 細(xì)胞密度為5 × 106/mL，置于冰上備用。

1.3 骨轉(zhuǎn)移模型建立 將BALC/c 裸小鼠隨機(jī)分為左心室注射組、脛骨注射組、尾動(dòng)脈注射組，每組各8 只，分別給予MDA-MB-231-luc 細(xì)胞左心室注射、脛骨骨髓腔注射、尾動(dòng)脈注射；將BALB/C 小鼠隨機(jī)分為脛骨注射組、尾動(dòng)脈注射組（由于4T1-luc細(xì)胞左心室內(nèi)注射易發(fā)生內(nèi)臟多發(fā)轉(zhuǎn)移［2］，模型可靠性較低，故未設(shè)置左心室注射組），每組各8 只，分別給予4T1-luc 細(xì)胞脛骨骨髓腔注射、尾動(dòng)脈注射。左心室注射方法：小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，固定，從胸部左側(cè)第二肋間旁開(kāi)2～3 mm進(jìn)針，深度5～6 mm，略回抽，見(jiàn)壓力較高的血液呈噴射狀進(jìn)入注射器針筒，表明針尖已進(jìn)入左心室，于30～60 s內(nèi)緩慢注射腫瘤細(xì)胞懸液0.1 mL。脛骨骨髓腔注射方法：小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，固定，屈曲肢膝關(guān)節(jié)呈90°，確定脛骨平臺(tái)部位，用29 G 胰島素注射器針頭從脛骨近端向脛骨遠(yuǎn)端斜下穿刺，緩慢左右旋轉(zhuǎn)進(jìn)針直至骨髓腔，針尖有明顯的落空感并部位固定，難以左右晃動(dòng)，使用微量注射器依次吸入1 μL 明膠海綿水溶液、10 μL 腫瘤細(xì)胞懸液，緩慢注射。尾動(dòng)脈注射方法：將小鼠置于固定器內(nèi)，露出尾部并用溫水浸泡，使尾部血管充盈，向尾動(dòng)脈推注腫瘤細(xì)胞懸液0.1 mL。

1.4 乳腺癌轉(zhuǎn)移灶觀察 MDA-MB-231-luc 細(xì)胞造模組于第10、20 天，4T1-luc 細(xì)胞造模組于第10 天進(jìn)行活體成像。使用異氟烷進(jìn)行氣體麻醉，成像前5 min 予腹腔注射熒光素酶底物D，使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察全身腫瘤細(xì)胞熒光強(qiáng)度，熒光信號(hào)越強(qiáng)、顏色越亮，表明腫瘤細(xì)胞濃度越高，以此評(píng)估轉(zhuǎn)移灶的進(jìn)展情況。

1.5 骨組織病理學(xué)觀察 MDA-MB-231-luc 細(xì)胞模型組于造模后第20天、4T1-luc細(xì)胞模型組于造模后第10 天頸椎脫臼法處死，取腭骨、左右肩胛骨、胸骨、椎骨、左右肱骨、左右股骨，剝離干凈肌肉、筋膜等組織，4%多聚甲醛固定24 h，EDTA 脫鈣，裸小鼠和普通小鼠脫鈣時(shí)間分別約為3 周和5 周。脫鈣結(jié)束后組織脫水、包埋、蠟塊切片，切片厚度為0.4μm。取骨組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞核呈藍(lán)色；隨后置于伊紅染液中染色30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、封片，顯微鏡觀察病灶腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、骨質(zhì)破壞情況。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)觀察結(jié)果 造模后24 h內(nèi)，MDA-MB-231-luc 細(xì)胞左心室注射組1 只裸小鼠死亡，解剖發(fā)現(xiàn)小鼠死亡原因?yàn)樾呐K破裂出血；其他小鼠均存活。MDA-MB-231-luc 細(xì)胞各組肉眼未見(jiàn)明顯瘤體生長(zhǎng)，小鼠精神狀態(tài)良好、活動(dòng)正常，進(jìn)食正常。4T1-luc細(xì)胞脛骨注射組造模后第10天，肉眼可見(jiàn)骨轉(zhuǎn)移瘤；尾動(dòng)脈注射組呈弓背樣狀態(tài)，觸摸小鼠尾背部有明顯僵硬感，小鼠逐漸行動(dòng)遲緩，精神萎靡、嗜睡，皮毛無(wú)光澤，食物和水納入減少。

2.2 各組小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移情況 MDA-MB-231-luc細(xì)胞造模后第10 天，左心室注射組3 只小鼠心臟周圍顯現(xiàn)藍(lán)、綠色熒光，表明腫瘤細(xì)胞有漏出，造模失敗，其余4只小鼠心臟周圍無(wú)明顯顯像，造模后第20天顯示熒光信號(hào)散在分布于全身；脛骨注射組顯示雙側(cè)脛骨熒光信號(hào)；尾動(dòng)脈注射組顯示雙側(cè)肺部熒光信號(hào)（OSID碼圖1）。4T1-luc細(xì)胞造模后第10天，尾動(dòng)脈注射組顯示雙側(cè)股骨及尾背部熒光信號(hào)，脛骨注射組顯示雙側(cè)脛骨熒光信號(hào)，兩組熒光信號(hào)均較強(qiáng)（OSID碼圖2）。

2.3 各組小鼠骨組織病理變化 MDA-MB-231-luc細(xì)胞造模后第20天，脛骨注射組骨質(zhì)破壞明顯、腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)狀生長(zhǎng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)異常；尾動(dòng)脈注射組形成肺轉(zhuǎn)移病灶，未見(jiàn)明顯骨轉(zhuǎn)移病灶；左心室注射組可見(jiàn)少量腫瘤細(xì)胞浸入于骨組織、骨質(zhì)破壞較少（OSID 碼圖3）。4T1-luc細(xì)胞造模后第10天，脛骨注射組可見(jiàn)脛骨近端浸潤(rùn)大量乳腺癌細(xì)胞，并呈外向型生長(zhǎng)，形態(tài)異常、細(xì)胞排列緊密，腫瘤灶內(nèi)見(jiàn)少量片狀骨組織；尾動(dòng)脈注射組可見(jiàn)尾背部轉(zhuǎn)移灶，腫瘤細(xì)胞包繞骨組織生長(zhǎng)，侵蝕、破壞骨質(zhì)（OSID碼圖4）。

2.4 各組乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型造模成功率 MDAMB-231-luc 細(xì)胞造模后第20 天，左心室注射組4 只發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，造模成功率為57%；尾動(dòng)脈注射組未見(jiàn)骨轉(zhuǎn)移病灶；脛骨注射組均形成骨轉(zhuǎn)移模型，造模成功率為100%。4T1-luc 細(xì)胞造模后第10 天，尾動(dòng)脈注射組、脛骨注射組造模成功率均為100%，其中尾動(dòng)脈注射組2例伴有肺轉(zhuǎn)移病灶。

3 討論

乳腺癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其轉(zhuǎn)移方式包括血行播散、淋巴轉(zhuǎn)移、直接蔓延等，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落進(jìn)入轉(zhuǎn)移階段，經(jīng)歷定植和存活、休眠、再活化、增殖與侵襲四個(gè)階段［3-4］。乳腺癌具有明顯的骨轉(zhuǎn)移傾向，多通過(guò)血行播散引起，但其復(fù)雜的轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未完全明確，需要通過(guò)骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型深入開(kāi)展相關(guān)研究。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型是研究乳腺癌發(fā)病、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程以及評(píng)估藥物有效性不可缺少的實(shí)驗(yàn)工具，因此，合格的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型應(yīng)能夠較好的模擬轉(zhuǎn)移發(fā)生和發(fā)展過(guò)程［2］。

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型可采用多種方式構(gòu)建，主要有原位移植法、局部注射法和血流播散法，如自發(fā)性骨轉(zhuǎn)移模型（原位注射法）、骨定植模型（骨內(nèi)注射）以及血管注射模型（左心室注射、動(dòng)脈注射）［5-6］。本研究采用左心室注射、脛骨骨髓腔注射以及尾動(dòng)脈注射構(gòu)建乳腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型，比較三種造模方式的小鼠存活率、骨轉(zhuǎn)移成功率的差異。

左心室注射法廣泛應(yīng)用于建立小鼠骨轉(zhuǎn)移模型，該方法將腫瘤細(xì)胞注射到左心室，通過(guò)動(dòng)脈血流傳播到包括骨髓組織在內(nèi)的整個(gè)身體，最終發(fā)展成骨和其他器官的轉(zhuǎn)移性病灶，該模型概括了骨轉(zhuǎn)移過(guò)程，如循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞存活、外滲、微集落形成和完整骨髓轉(zhuǎn)移進(jìn)展［7-8］，但對(duì)操作技術(shù)要求高，小鼠易發(fā)生心臟損傷出血、腫瘤細(xì)胞滲漏入心包、血容量急劇增加伴隨循環(huán)衰竭等問(wèn)題［9］。崔永奇等［10］采用左心室注射法將SPC-A-1、XL-2 細(xì)胞接種于BLAB/c 裸小鼠建立骨轉(zhuǎn)移模型，模型組小鼠出現(xiàn)消瘦、脊柱彎曲等癥狀，經(jīng)Micro CT 和HE 染色明確骨轉(zhuǎn)移率在40%～60%。本研究利用MDA-MB-231-luc細(xì)胞進(jìn)行左心室注射造模，發(fā)現(xiàn)左心室注射法能夠較好模擬乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的早期病理過(guò)程，但造模成功率僅有57%，部分小鼠發(fā)生心臟損傷死亡，且易出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞滲漏于心包，形成局部心包轉(zhuǎn)移，并且造模后20 天才能觀察到熒光信號(hào)。張帆等［11］采用MDA-MB-231-luc 細(xì)胞進(jìn)行裸小鼠左心室注射建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率為48.15%。這表明該方式造模成功率較低，不利于大批量開(kāi)展乳腺癌骨轉(zhuǎn)移防治實(shí)驗(yàn)。

脛骨骨髓腔注射法將乳腺癌細(xì)胞直接接種于脛骨骨髓腔內(nèi)，模擬腫瘤細(xì)胞定植于骨轉(zhuǎn)移生態(tài)位后的狀態(tài)，可用來(lái)研究腫瘤細(xì)胞和其他細(xì)胞（如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞）相互調(diào)控、串?dāng)_的關(guān)系以及藥物防治骨轉(zhuǎn)移的有效性和安全性［12］，具有成瘤率高、方法簡(jiǎn)單易行等優(yōu)勢(shì)；其缺點(diǎn)是無(wú)法模擬腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離后定植于骨的全過(guò)程，并且造成小鼠脛骨皮質(zhì)、骨髓腔損傷［13］。本研究結(jié)果顯示，脛骨骨髓腔注射法造模成功率為100%，局部腫瘤病灶生長(zhǎng)迅速，HE 染色顯示骨質(zhì)破壞明顯、腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)狀生長(zhǎng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)異常，表明該方式造模成功率高。

動(dòng)脈注射方面，目前多采用髂內(nèi)動(dòng)脈注射、尾動(dòng)脈注射建立骨轉(zhuǎn)移模型。髂內(nèi)動(dòng)脈注射能夠選擇性地將乳腺癌細(xì)胞遞送到小鼠后肢骨髓，形成干骺端骨轉(zhuǎn)移模型，但其復(fù)雜的操作流程不適合大批量的小鼠實(shí)驗(yàn)，同時(shí)存在局部感染的風(fēng)險(xiǎn)［14］。KUCHIMARU 等［15］通過(guò)小鼠尾動(dòng)脈注射法成功建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型，采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞優(yōu)先定植于小鼠后肢骨組織，而不是進(jìn)入尾靜脈血管，其操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行。我們嘗試采用尾動(dòng)脈注射法進(jìn)行造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231-luc細(xì)胞多聚集于裸鼠肺部并形成肺轉(zhuǎn)移，未見(jiàn)形成骨轉(zhuǎn)移病灶；而尾動(dòng)脈注射4T1-luc 細(xì)胞建立模型方面，小動(dòng)物活體成像以及HE 染色顯示腫瘤細(xì)胞聚集于小鼠尾背部，形成局部骨轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移局部腫瘤生長(zhǎng)迅速，表明不同細(xì)胞系尾動(dòng)脈注射骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率有明顯差異。

綜上所述，采用左心室注射、脛骨骨髓腔注射、尾動(dòng)脈注射乳腺癌細(xì)胞構(gòu)建乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型，脛骨骨髓腔注射法具有造模成功率高的優(yōu)勢(shì)；左心室注射能夠最大限度模擬骨轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的自然過(guò)程，克服了脛骨骨髓腔注射法的不足，但對(duì)操作技術(shù)要求高且造模成功率相對(duì)較低；尾動(dòng)脈注射作為建立骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的新策略，該方法的可行性和穩(wěn)定性尚需進(jìn)一步研究。實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)三種造模方式的優(yōu)缺點(diǎn)，選擇最適宜的方式。