陳甜夢，蔡彤璇，王嘉璐，田牧野，趙寶華，劉 東

（河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種淡水、兼性厭氧、化學(xué)有機異養(yǎng)細(xì)菌，可引起魚類、兩棲動物、爬行動物、鳥類和哺乳動物的疾病，尤其可引起魚類細(xì)菌性敗血癥[1]，由于其高發(fā)病率和死亡率，給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]?？股刂委熓菍故人畾鈫伟腥镜闹饕胧Ｈ欢?，由于抗生素耐藥性發(fā)展和傳播的嚴(yán)峻形勢，以及藥物殘留和環(huán)境污染，迫切需要抗生素的替代品[3]。疫苗免疫是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)疾病防控中重要的、有效的方式，在抗生素減少和替代的背景下，疫苗開發(fā)和應(yīng)用的意義更加突出[4]。

Tol-Pal 系統(tǒng)是由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的一組蛋白質(zhì)復(fù)合物。這一系統(tǒng)由內(nèi)膜相關(guān)亞單位TolA、TolQ、TolR 3 種蛋白質(zhì)以及外膜錨定亞單位TolB 和Pal 蛋白組成[5]。Tol-Pal 系統(tǒng)首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，隨后在許多其他細(xì)菌屬中也有報道。對于革蘭氏陰性菌來說，Tol-Pal系統(tǒng)具有重要而多樣的生物學(xué)功能[6]。tol-pal基因的突變對細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和細(xì)菌致病性具有重要作用。目前，關(guān)于Tol-Pal系統(tǒng)在細(xì)菌致病機制中的作用主要體現(xiàn)在：tol-pal基因突變體細(xì)胞壁及包膜完整性被破壞，某些細(xì)菌毒力蛋白如毒素和鞭毛蛋白的功能減低或產(chǎn)生缺陷[7]。tol-pal基因?qū)δ承┲虏∥⑸锏纳L或存活是至關(guān)重要的，tol-pal基因突變體不能在宿主體內(nèi)存活等[8]。

革蘭氏陰性菌細(xì)胞表面外膜蛋白（Outer membrane protein，OMP）在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生命活動方面發(fā)揮重要作用[9-11]。革蘭氏陰性細(xì)菌外膜蛋白TolB 是一種周質(zhì)蛋白，它與外膜脂蛋白Pal 相互作用以介導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)外層之間的接觸。TolB 還可以與位于外膜的幾種蛋白質(zhì)相互作用，包括OmpA、OmpF和Lpp[5]。研究表明，TolB位于細(xì)胞膜表面，廣泛與外界接觸，而且又是病原菌轉(zhuǎn)運毒素的必要裝置，有較好的免疫原性和免疫保護(hù)性，是亞單位疫苗的潛在候選[12]。

嗜水氣單胞菌外膜蛋白表面的抗原決定簇可使其極易被免疫系統(tǒng)識別，從而引起機體的特異性免疫[13-15]。目前，未見關(guān)于嗜水氣單胞菌Tol-Pal 系統(tǒng)致病性的研究報道，對嗜水氣單胞菌外膜蛋白TolB 特性的研究，將有助于嗜水氣單胞菌減毒疫苗或抗菌藥物的開發(fā)。為了深入研究嗜水氣單胞菌外膜蛋白TolB 的免疫功能，表達(dá)純化得到TolB 蛋白，并借助生物信息學(xué)軟件分析了TolB 的蛋白質(zhì)序列相似性，預(yù)測和分析了其基本理化性質(zhì)、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)，磷酸化與糖基化位點，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及優(yōu)勢的B 細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位，以期為TolB 蛋白亞單位疫苗的制備奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）ATCC 7966、大 腸 桿 菌（Escherichia coli）DH5α 和BL21（DE3）。A.hydrophila與E.coli均使用LB培養(yǎng)基，在37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。使用的抗生素終質(zhì)量濃度：氨芐青霉素（Amp）為100 μg/mL，卡那霉素（Kan）為50 μg/mL。

1.2 主要試劑

Taq酶、DNA 連接酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶和IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）購自Takara 公司；DNA 片段回收試劑盒購自生工公司；Ni-NTA agarose 樹脂購自Qiagen 公司；蛋白質(zhì)Marker購自天根公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 引物

本研究所用引物為tolB-up：CGCCATATGTCTTCTTCTGATTCTGACG；tolB-down：AAACTCGAGGTAAACCAGAACCGCA。酶切位點分別為NdeⅠ和XhoⅠ。引物合成由金唯智公司完成。

1.4 嗜水氣單胞菌tolB基因的克隆

以A.hydrophilaATCC 7966 基因組DNA 為模板，tolB-up 和tolB-down 為 引 物，PCR 反 應(yīng) 條 件：95 ℃2 min；95 ℃30 s，56 ℃1 min，72 ℃2 min，30個循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃1 h。使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，4 ℃保存。

1.5 嗜水氣單胞菌tolB基因異源表達(dá)載體的構(gòu)建

將所得的tolB基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，純化回收目的片段，與經(jīng)過酶切的表達(dá)載體pET-22b（+）連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化入E.coliBL21（DE3），挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒送測序公司測序。

1.6 嗜水氣單胞菌TolB蛋白的原核異源表達(dá)

將篩選到的陽性克隆接種到含有50 μg/mL 卡那霉素的100 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)到0.4～0.6 后，添加IPTG 使其終濃度達(dá)到0.5 mmol/L，16 ℃180 r/min 過夜誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌液，經(jīng)4 ℃、8 000 r/min 離心10 min 收集菌體沉淀，將沉淀用20 mL裂解液重懸，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞（電壓：16 V；時間：20 min；脈沖周期：pulse on：8 s；pulse off：8 s）。將細(xì)胞裂解液于4 ℃、15 000 r/min離心10 min，收集上清。

1.7 嗜水氣單胞菌TolB蛋白的純化

將收集到的上清液用鎳柱進(jìn)行純化。把上清液加到Ni-NTA agarose 樹脂中輕輕混勻，4 ℃結(jié)合1 h，用含75 mmol/L咪唑的洗滌液洗去未結(jié)合蛋白，再用含300 mmol/L 咪唑的溶液洗脫目的蛋白，收集各個組分，用SDS-PAGE 分析純化效果。具體操作參照Qiagen公司蛋白質(zhì)純化手冊。

1.8 嗜水氣單胞菌TolB的生物信息學(xué)分析

1.8.1 TolB 的理化性質(zhì)和修飾位點分析 采用ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)絡(luò)在線軟件對嗜水氣單胞菌TolB 蛋白的相對分子質(zhì)量、親水性、等電點、脂肪指數(shù)和穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測分析；采用ProtScale analysis（https：//web.expasy.org/protscale/）方法預(yù)測親水性圖譜。利用在線網(wǎng)站YinOYang-1.2（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/YinOYang-1.2/）和 NetNGlyc-1.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/）分別分析TolB蛋白的O糖基化和N糖基化位點。

1.8.2tolB基因序列測定、序列相似性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹繪制 測序分析由金唯智生物科技有限公司完成。使用生物信息網(wǎng)站NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和DNAMAN 軟件拼接基因的全長序列，并推導(dǎo)編碼的氨基酸序列。利用NCBI 網(wǎng)站下載嗜水氣單胞菌（A.hydrophila，GenBank 登錄號：WP_011707363.1）、殺 鮭 氣 單 胞 菌（Aeromonas salmonicida，GenBank 登錄號：RSM27999.1）、簡氏氣單 胞 菌（Aeromonas jandaei，GenBank 登 錄 號：BCS50541.1）、舒氏氣單胞菌（Aeromonas schubertii，GenBank 登 錄 號：QCG49071.1）、豚 鼠 氣 單 胞 菌（Aeromonas caviae，GenBank 登錄號：BDC85372.1）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，GenBank 登錄號：QLH68355.1）、產(chǎn) 堿 普 羅 維 登 斯 菌（Providencia alcalifaciens，GenBank 登錄號：CAG9413353.1）以及愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri，GenBank 登錄號：QPW30779.1）的tolB基因編碼的氨基酸序列，使用GeneDoc 軟件進(jìn)行相似性分析，并計算出序列相似度，采用MEGA 5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8.3 TolB 的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用Signal P4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）軟件對TolB 蛋白進(jìn)行信號 肽 預(yù) 測。 利 用TMHMM serverv.2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）隱馬爾科夫模型（Hidden Markov Model，HMM）對TolB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用SOPMA（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html） 和 SWISS-MODEL （https://swissmodel.expasy.org/）在線軟件，分別對TolB 蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

1.8.4 TolB 的的磷酸化位點預(yù)測和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 采用NetPhosBac-1.0server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhosBac-1.0/）預(yù)測TolB 蛋白的磷酸化位點。通過String蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測網(wǎng)站（https：//cn.string-db.org/），預(yù)測TolB蛋白與其他蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.8.5 TolB 的細(xì)胞抗原表位分析 采用ABCpred（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/index.html）和 BepiPred-2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）方法預(yù)測TolB 蛋白的B 細(xì)胞表位，分析其肽段位置分布情況。細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）抗原表位采用nHLAPred（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/nhlapred/）進(jìn) 行 預(yù) 測，選 擇HLA-A*020l、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205 四 類 限制表型。采用在線軟件ProPred（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/propred/index.html）對TolB 蛋白進(jìn)行Th 抗 原 表 位 預(yù) 測，選 用HLA-DRBl_0101、HLADRBl_0102、HLA-DRBl_030l 三種不等位基因類型進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 A.hydrophila tolB基因的PCR擴增結(jié)果

TolB 信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，嗜水氣單胞菌TolB蛋白的信號肽序列由N 端的21 個氨基酸殘基組成（1—21 位），切割位點在第21—22 個氨基酸殘基，分值是0.946。因此，本研究根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)中嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）ATCC 7966 的tolB核苷酸序列（登錄號：NC_008570）設(shè)計得到去除信號肽的特異性PCR 引物，從基因組中擴增1 條大小約為1 263 bp 的DNA 單一條帶，與預(yù)期基因大小一致。將擴增基因產(chǎn)物命名為AHtolB，將目的基因與克隆載體連接并測序，測序結(jié)果表明，AHtolB與A.hydrophilaATCC 7966tolB基因（GenBank 登錄號：WP_017412185.1）相似度100%。

2.2 TolB蛋白的異源表達(dá)與純化

以pET-22b（+）為載體成功構(gòu)建pET-22b-tolB重組質(zhì)粒，NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切驗證正確后轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）進(jìn)行異源表達(dá)。重組菌株經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni 柱純化后超濾濃縮，將產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測，得到分子質(zhì)量約46 ku的目的蛋白，這與根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)出的TolB 蛋白分子質(zhì)量相近（圖1）。

圖1 親和層析純化TolB 蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified TolB protein

2.3 TolB蛋白理化性質(zhì)分析

TolB 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明，蛋白的分子質(zhì)量為45.78 ku；相對分子質(zhì)量為86.26，理論等電點為8.75。TolB 蛋白全長序列氨基酸數(shù)量為441個，含量較多的氨基酸是甘氨酸（39個，占8.8%）、絲氨酸（39 個，占8.8%）和丙氨酸（38 個，占8.6%）；TolB 只含有一個半胱氨酸，不含有二硫鍵。帶負(fù)電荷的氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）共有41個，帶正電荷的氨基酸（精氨酸和賴氨酸）共有44個，其分子式為C2137H3392N594O647S14，原子總數(shù)6 784。假設(shè)TolB所有的胱氨酸殘基以半胱氨酸的形式出現(xiàn)，即形成二硫鍵，消光系數(shù)為60 850 mol/cm，A280為1.262；假設(shè)二硫鍵全部打開，消光系數(shù)為60 850 mol/cm，A280為1.262。TolB 在哺乳動物紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)半衰期大于10 h。TolB不穩(wěn)定指數(shù)為34.14，表明嗜水氣單胞菌TolB 蛋白屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)是86.26，平均親水性（GRAVY）為-0.194，表明嗜水氣單胞菌TolB蛋白為親水性蛋白。

2.4 嗜水氣單胞菌tolB基因序列相似性比較

序列相似性比對結(jié)果表明，TolB 氨基酸序列在氣單胞菌間具有高度的同源性，分別為99.3%（維氏氣單胞菌）、98.4%（簡氏氣單胞菌）、97.5%（豚鼠氣單胞菌）、96.6%（殺鮭氣單胞菌）和90.9%（舒氏氣單胞菌），而在不同屬間菌株也具有一定的同源性，如32.5%（產(chǎn)堿普羅維登斯菌）和33.6%（愛德華氏菌）（圖2）。以MEGA 5.0 軟件構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，幾種不同的氣單胞菌親緣關(guān)系均較近，且不同種屬間也有一定的親緣關(guān)系（圖3）。因而，TolB 蛋白免疫動物后產(chǎn)生的抗體可能對不同種屬的細(xì)菌具有交叉免疫的作用。

圖2 氣單胞菌屬菌株間TolB蛋白氨基酸序列同源性分析Fig.2 Alignment of amino acid sequences from A.hydrophila and other Aeromonas strains

圖3 不同菌株間TolB蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic relationships of TolB among different strains

2.5 TolB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，TolB 蛋白沒有跨膜區(qū)，所有區(qū)域都在細(xì)胞膜外，是一種外膜蛋白。

TolB 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖4 所示。TolB蛋白包含的二級結(jié)構(gòu)分別為α 螺旋（藍(lán)色）66個，占14.97%；β 片層（紅色）129 個，占29.25%；β 轉(zhuǎn)角（綠色）52 個，占11.79%；無規(guī)則卷曲（紫色）194 個，占43.99%。無規(guī)則卷曲是TolB 蛋白含量最豐富的結(jié)構(gòu)原件。

圖4 TolB蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.4 The secondary structure prediction of TolB

利用SWISS-MODEL 進(jìn)行同源建模，得到了以PDB ID：3iax.1.A 為模板的預(yù)測模型。比對結(jié)果顯示，模板與TolB 同源性最高為48.72%，基于模板構(gòu)建了TolB 蛋白的三級結(jié)構(gòu)圖（圖5），全局模型質(zhì)量評估分?jǐn)?shù)（GMQE）為0.79，GMQE 值在0～1，數(shù)字越高表明可靠性越高。TolB 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型覆蓋率最高為97%，說明模型的質(zhì)量和匹配度較好，可靠性較高。從TolB 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型可以看出，其α 螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)數(shù)量較多，推測α螺旋和無規(guī)則卷曲對TolB蛋白生物學(xué)功能具有重要作用。

圖5 TolB蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.5 The 3-D structure prediction of TolB

2.6 TolB蛋白翻譯后的修飾

2.6.1 磷酸化位點的預(yù)測 NetPhosBac 軟件預(yù)測結(jié)果表明，TolB 蛋白的磷酸化位點有12 個，全部為絲氨酸磷酸化位點。包括第18、33、103、134、141、208、247、277、187、296、410、428位氨基酸。

2.6.2 糖基化位點的預(yù)測 利用NetNGlyc-1.0 服務(wù)器預(yù)測TolB 蛋白存在1 個N 糖基化位點，位于395位。應(yīng)用在線軟件YinOYang-1.2預(yù)測該蛋白可能存在1個O糖基化位點，位于294位。

2.7 TolB蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

TolB 蛋白相互作用預(yù)測結(jié)果顯示，TolB 蛋白與10 種蛋白質(zhì)存在相互作用，其中與Tol-Pal 系統(tǒng)中的Pal 蛋白、TolQ 蛋白、TolA 蛋白、TolR 蛋白以及外膜蛋白CpoB 蛋白、BamD 蛋白和BamA 蛋白之間的相互作用更加緊密（圖6）。

圖6 TolB蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測Fig.6 Prediction of TolB protein interaction

2.8 TolB蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

通過ABCpred 軟件預(yù)測TolB 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位，序列的得分越高，表明作為抗原表位的概率越高。預(yù)測得到的抗原表位評分大于0.85 的表位有10 條，分別 為190—205、301—427、74—89、167—182、334—349、352—367、346—361、422—437、256—277、131—147 aa。利用BepiPred-2.0 方法預(yù)測獲得的細(xì)胞優(yōu)勢B 抗原表位共有13條，其中長度大于6 aa的共有11條，分別為43—67、69—95、123—156、160—173、199—205、242—252、287—295、334—342、380—387、419—425 aa。使用在線軟 件Vaxi-Jen 2.0（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）進(jìn)一步對抗原性進(jìn)行評估，結(jié)果顯示，潛在B 細(xì)胞抗原表位數(shù)量為9 個（表1）。

表1 TolB蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測Tab.1 B-cell epitope prediction results of TolB

2.9 TolB蛋白T細(xì)胞抗原表位預(yù)測

2.9.1 TolB 蛋白CTL 抗原表位預(yù)測 通過nHLAPred 在線軟件預(yù)測CTL 抗原表位，選擇HLAA_020l、HLA-A_0202、HLA-A_0203、HLA-A_0205四類限制表位，篩選出表位肽共20 條。屬于HLAA2 表 位 有7—21、138—146、364—372 aa，屬 于HLA-A_0201 表位有49—57、388—396 aa。屬于HLA-A_0202 表 位 的 有49—57、99—107、388—396 aa。屬于HLA-A_0203 表位有121—129、150—158、185—293 aa。屬于HLA-A_0205 表位有1—9、34—46、110—122、150—158、166—180、260—268、359—367、426—434、442—450 aa。將預(yù)測得到的CTL抗原表位應(yīng)用Vaxi-Jen 2.0軟件進(jìn)一步評估，最終確定8個CTL細(xì)胞優(yōu)勢表位（表2）。

表2 TolB蛋白CTL抗原表位預(yù)測Tab.2 CTL peptide prediction results of TolB

2.9.2 TolB 蛋白Th 抗原表位預(yù)測 分別選擇等位基因HLA-DRB1_0101、HLA-DRB1_0102 和HLADRB1_0301 預(yù)測Th 細(xì)胞抗原表位。預(yù)測得到HLA-DRB1_0101 的 表 位 為6—22、25—33、226—234 aa。預(yù)測得到HLA-DRB1_0102 的表位6 條，分別 為6—22、25—33、100—108、252—260、356—364、278—386 aa。預(yù)測得到HLA-DRB1_0301的表位8 條,分 別 為25—33、57—70、100—108、137—145、206—214、281—289、349—370、414—422 aa。將預(yù)測得到的Th抗原表位應(yīng)用Vaxi-Jen 2.0軟件進(jìn)一步評估，最終確定2 個HLA-DRB1_0101 優(yōu)勢表位，1個HLA-DRB1_0102 優(yōu)勢表位和4 個HLADRB1_0301優(yōu)勢表位（表3）。

表3 TolB蛋白Th抗原表位預(yù)測Tab.3 Th peptide prediction results of TolB

3 結(jié)論與討論

疫苗免疫是水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防控的重要手段。嗜水氣單胞菌滅活疫苗通過誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)，對水生動物具有較好的免疫保護(hù)作用，因此被廣泛研究和應(yīng)用[16]。嗜水氣單胞菌滅活疫苗對斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）幼魚表現(xiàn)出顯著的免疫保護(hù)作用，免疫后能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體[17]。通過腹腔注射或浸泡接種嗜水氣單胞菌滅活疫苗可顯著上調(diào)細(xì)鱗鯧（Piaractus mesopotamicus）血清和皮膚黏液中溶菌酶和特異性抗體水平，從而提高感染后的存活率[18]。然而，由于嗜水氣單胞菌來源廣泛、血清型多，限制了滅活疫苗的免疫保護(hù)作用和應(yīng)用范圍。雖然嗜水氣單胞菌減毒活疫苗和核酸疫苗也表現(xiàn)出很好的免疫保護(hù)作用，但這些研究還停留在實驗室階段[19]。

外膜蛋白TolB 在不同菌株之間高度保守，它在維持菌株外膜的完整性方面起關(guān)鍵作用，是制備亞單位疫苗的理想抗原[20，21]。KHAN 等[22]通過針對嗜肺軍團(tuán)菌疫苗開發(fā)的基因組學(xué)與反向疫苗學(xué)發(fā)掘到TolB 蛋白等3 個靶向蛋白可以作為潛在疫苗靶點。外膜蛋白TolB 作為一種候選疫苗，具有參與代謝途徑簡單、與其他蛋白質(zhì)相互作用緊密、與人類微生物菌群蛋白相似度低且有較高抗原性的特點。本研究分析了嗜水氣單胞菌TolB 蛋白的理化特性，發(fā)現(xiàn)TolB 蛋白是一個結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的親水性外膜蛋白。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，TolB 蛋白具有多個可以形成表位的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果都與嗜肺軍團(tuán)菌外膜蛋白TolB 的生物信息學(xué)分析結(jié)果極為相近。可見，嗜水氣單胞菌TolB 蛋白也極有可能是一種潛在的候選疫苗。

生物信息學(xué)是隨著人類基因組計劃的發(fā)展而出現(xiàn)的一門新學(xué)科，現(xiàn)已成為基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具[23]。通過分析氨基酸序列、基本理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、三維結(jié)構(gòu)和抗原性，能夠篩選出潛在的抗原表位，從而加快疫苗的研究，避免浪費的重復(fù)工作和無效的試驗過程[24]。生物信息學(xué)因其高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、蛋白質(zhì)功能研究和抗原表位預(yù)測等領(lǐng)域。SONG 等[12]利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測了鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）TolB 蛋白的結(jié)構(gòu)，表明TolB 是一種親水性好、可塑性強、可及性高、抗原性指數(shù)高、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞表位多的潛在的疫苗抗原。對4 株鮑曼不動桿菌的tolb基因片段進(jìn)行測序，結(jié)果表明，TolB 蛋白的相似性為96.2%。前人對TolB氨基酸序列上的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位進(jìn)行了篩選和重組，設(shè)計了1個優(yōu)秀的表位，并驗證了免疫效果[9，25]。本研究利用生物信息學(xué)軟件分析了TolB 蛋白的基本理化性質(zhì)和翻譯后修飾及二維和三維結(jié)構(gòu)，利用專用的預(yù)測軟件對TolB 蛋白潛在的B 細(xì)胞表位和T 細(xì)胞表位進(jìn)行了預(yù)測，表明TolB 蛋白具有豐富的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞抗原表位，可以開發(fā)成為診斷及治療嗜水氣單胞菌感染的新型表位疫苗。