章 蕾，黃子洳，林紫怡，鐘曉明，程汝濱，黃 真

浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江 杭州 310053

敗醬草為敗醬科多年生草本植物黃花敗醬PatriniascabiosaefoliaFisch.ex Trev 和白花敗醬P.villosaJuss 的帶根全草[1]，全國大部分地區(qū)均有分布。敗醬草首載于《神農本草經》，被列為中品，其味辛、苦，性微寒，具有清熱解毒、消癰排膿、祛瘀止痛之功效[1]。敗醬草在我國古代本草中最早記載為黃花敗醬，直到明代李時珍才首次記載收錄白花敗醬（攀倒甑）[2]。現(xiàn)代研究表明，敗醬草的有效成分主要為黃酮類、三萜皂苷類、苯丙素類、萜烯類和揮發(fā)油類等[3]，其中黃花敗醬富含三萜皂苷和揮發(fā)油，而白花敗醬含有更多的黃酮類化合物[4]。敗醬草在抗炎、抗腫瘤、抗氧化等方面均顯示良好的藥理活性[4-5]。針對皂苷類成分，已有研究表明其具有較好的抗炎、抗腫瘤[1]等作用。目前敗醬草的臨床應用廣泛，在消化科、皮膚科、呼吸內科、泌尿科以及婦科等多方面疾病均有重要的應用價值，具有很好的藥用價值和開發(fā)前景[6]。但目前敗醬草皂苷類成分的提取工藝研究相對較少，其提取工藝的不成熟一定程度上限制了后續(xù)藥理活性的評價和應用開發(fā)。

苣荬菜、菥蓂及異葉敗醬作為敗醬草的常見市場混偽品，其功能主治、化學成分、藥理作用與敗醬草均有顯著差異，混用易導致臨床的安全隱患。導致敗醬草及其混偽品混用的原因復雜，一方面藥材的名稱和性狀近似，不易區(qū)分，另一方面，區(qū)域性用藥習慣差異以及本草傳承中品種誤用等因素加劇了市場上敗醬草混偽品流通問題。《本草綱目》中首次在敗醬草品種項下添加“苦菜”這一別稱[7]，此后的本草書中多在敗醬草項下使用“苦菜”一名。市場上常見混用品苣荬菜Sonchus arvensisL.為菊科植物苣荬菜的帶根全草，北方民間稱其為“苦菜”，并將其作為蔬菜食用。敗醬草與苣荬菜相同的“苦菜”別稱是引起二者混用的主要原因。菥蓂ThlaspiarvenseL.為十字花科植物菥蓂的地上部分，別名為蘇敗醬[8]。此外，菥蓂為帶果全草，其葉往往脫落，與白花敗醬的無葉果枝性狀相似[9]，其卵圓形扁平果實與白花敗醬團扇狀苞片相似，名稱與性狀的相似更易引起二者混用。敗醬屬常用藥用植物異葉敗醬P.heterophyllaBunge，其根入藥，名為墓頭回，異葉敗醬地上部分與敗醬草性狀相似，易混作敗醬草用。敗醬草及其混偽品雖均有清熱解毒的功效，但苣荬菜、菥蓂不具有排膿祛瘀的功效，用于婦科疾病效果欠佳，混用會影響臨床療效，甚至導致病情加劇及產生過敏反應等不良反應[10-11]。由此可見，敗醬草混偽品的使用會給臨床安全合理用藥帶來嚴重隱患，也不利于敗醬草規(guī)范使用標準的制定。

HPLC 色譜具有分離效能高、分析速度快及儀器自動化等優(yōu)點，與多種指紋圖譜數(shù)據(jù)評價方法相結合，廣泛應用于中藥藥材物種鑒別[12]、藥材質量評價[13]、化學成分分析[14]以及譜效關系研究[15]等多個方面，本研究采用生藥學鑒定、Box-Behnken 法優(yōu)化敗醬草中總皂苷的提取工藝，測定敗醬草及其混偽品的總皂苷得率，并建立敗醬草及其混偽品HPLC 指紋圖譜，結合相似度分析、聚類分析和主成分分析對其進行鑒別，使用傳統(tǒng)鑒別方法結合現(xiàn)代鑒別手段對敗醬草及其市場上常見混偽品進行區(qū)分鑒別，以期為敗醬草的準確鑒別和臨床用藥安全提供一定技術支撐與保障，同時為敗醬草及其市場偽品的資源利用和潛在藥用價值的開發(fā)提供一定參考。

1 材料

試驗用敗醬草及其混偽品共5 種藥材，根據(jù)產地或批次不同分為26 批，編號為S1～S26，來源信息見表1，藥材均購自中藥材市場，經浙江中醫(yī)藥大學藥學院黃真教授鑒定為敗醬科黃花敗醬P.scabiosaefoliaFisch.ex Trev、白花敗醬P.villosaJuss、異葉敗醬P.heterophyllaBunge，十字花科菥蓂ThlaspiarvenseL.、菊科苣荬菜S.arvensisL.。

表1 樣品來源Table 1 The sample source

熊果苷（批號T17S681，上海源葉生物科技有限公司）；齊墩果酸（批號YN1101SA14，上海源葉生物科技有限公司）；常春藤皂苷元（批號DSTDC006601，成都樂美天醫(yī)藥/德思特生物，以上對照品質量分數(shù)均＞98%；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；稀甘油、水合氯醛、乙醇、磷酸、冰醋酸、高氯酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；香草醛（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；超純水（Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備）。

SCLIPSE Ci-L 型生物顯微鏡（日本Nikon 公司）；UV-1800 紫外分光光度計（日本島津公司）；DZF 數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；AL104 電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)儀（上海榮亞生化儀器廠）；恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器廠）；Waters 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）。

2 方法

2.1 顯微鑒定

采用顯微鑒別方法對黃花敗醬、白花敗醬、異葉敗醬、苣荬菜、菥蓂進行生藥學鑒定。

2.2 黃花敗醬總皂苷的提取工藝優(yōu)化

2.2.1 黃花敗醬總皂苷的提取 將5 種藥材樣品烘干至恒定質量，研磨至粉碎后得到樣品粉末（過5目篩）。精密稱取粉末1.0 g，在一定提取溫度、液料比、提取時間、乙醇體積分數(shù)下于恒溫水浴鍋中進行冷凝回流提取，將得到的提取液抽濾，殘渣加水10 mL 溶解，用水飽和的正丁醇溶液萃取2 次，每次25 mL，合并正丁醇液，回收正丁醇至干，殘渣加甲醇溶液溶解并定容至50 mL，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液配制 精密稱取齊墩果酸對照品10.10 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.202 mg/mL 的對照品溶液。

2.2.3 檢測波長的選擇 取對照品溶液1 mL，置具塞試管中，水浴揮干，冷卻，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法，在200～800 nm 進行全波長掃描，反應液在545 nm 處有明顯特征峰。選取可見區(qū)域545 nm 的特征吸收峰位作為檢測波長。

2.2.4 齊墩果酸標準曲線的繪制 參考文獻的方法[16]并加以修改，以齊墩果酸濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程，結果表明齊墩果酸在16.833 3～33.666 7 μg/mL，呈良好的線性關系?；貧w方程為Y＝0.048 2X－0.122 4，R2＝0.999 1。

2.2.5 黃花敗醬總皂苷的測定 準確吸取供試品溶液溶液0.4 mL 于10 mL 試管中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，取待測溶液1 ml 于具塞試管中，水浴揮干，冷卻，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，60 ℃水浴保溫15 min，取出，冰水浴中立即冷卻，加入冰醋酸5 mL，搖勻，隨性試劑作空白，按照分光光度法，在545 nm 波長處測定吸收度，測定總皂苷時以齊墩果酸為對照品制作標準曲線，按公式計算黃花敗醬總皂苷得率（Y）。

Y＝C×V×N/M

Y為黃花敗醬總皂苷得率，C為總皂苷的質量濃度，V為測量總皂苷提取液體積，N為稀釋倍數(shù)，M為稱量的黃花敗醬質量

2.2.6 單因素實驗 按照設定條件進行工藝提取，每組試驗設定提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、液料比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）、提取時間（30、60、90、120、150 min）、乙醇體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%、90%、100%）中的一項因素為變量，控制其他3 項因素為定量，以黃花敗醬總皂苷得率為評價指標，每組試驗平行重復3 次。

2.2.7 Box-Behnken 響應面法優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素試驗結果，以提取溫度（A）、液料比（B）、提取時間（C）、乙醇體積分數(shù)（D）作為影響因素，總皂苷得率為評價指標（Y），應用Box-Behnken 中心組合進行4 因素3 水平的試驗設計。將因素水平（?1、0、1）設定為提取溫度70、80、90 ℃，液料比25∶1、30∶1、35∶1，提取時間90、120、150 min，乙醇體積分數(shù)為80%、90%、100%。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 混合對照品溶液的制備 取熊果苷、齊墩果酸、常春藤皂苷元對照品，加甲醇制成含熊果苷0.376 mg/mL、齊墩果酸0.416 mg/mL、常春藤皂苷元0.392 mg/mL 的混合對照品溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取各藥材粉末1.0 g，以最佳提取工藝進行提取，抽濾，濾液轉移至50 mL 量瓶中，定容至刻度。后置于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣加甲醇超聲溶解，轉移至5 mL 量瓶中，定容至刻度，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，得到供試品溶液，備用。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為Waters Sunfire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.1%磷酸水-乙腈，梯度洗脫（0～5 min，10%乙腈；5～8 min，10%～13%乙腈；8～32 min，13%～16%乙腈；32～37 min，16%～20%乙腈；37～40 min，20%～22%乙腈；40～52 min，22%～24%乙腈；52～55 min，24%～34%乙腈；55～60 min，34%～40%乙腈；60～63 min，40%～50%乙腈；63～90 min，50%～100%乙腈）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。

2.3.4 精密度試驗 取樣品（S1），按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項條件下連續(xù)進樣6 次[17]，以熊果苷峰為參考峰，計算得出各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值分別小于0.35%、1.22%，表明該儀器的精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取樣品（S1），按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定[17]，計算得出各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值分別小于1.76%、1.8%，表明供試品在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復性試驗 取6 份樣品（S1），按“2.3.2”項下方法分別制備供試品溶液，在“2.3.3”項條件下進樣測定[17]，計算得出各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值分別小于1.05%、2.06%，表明該方法的重復性良好。

2.4 指紋圖譜分析

2.4.1 相似度評價 將26 批樣品液相色譜圖數(shù)據(jù)導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）進行分析，以S1 樣品色譜圖為參照圖譜，采用中位數(shù)法生成對照圖譜，時間窗寬度設置為0.1 min，進行多點校正和自動峰匹配，生成指紋疊加圖譜，確定共有峰，進行相似度評價。

2.4.2 聚類分析 采用SPSS 25.0 軟件以26 批樣品的共有峰峰面積為變量，采用組間連接聚類方法，以平方歐式距離為度量標準進行系統(tǒng)聚類分析。

2.4.3 主成分分析 采用SPSS 25.0 軟件對26 批樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)進行主成分分析，采用降維、因子分析，計算相關系數(shù)矩陣，主成分特征值、累積貢獻率及主成分綜合得分等。

3 結果與分析

3.1 敗醬草及其混偽品粉末的顯微鑒別研究

5 種藥材在顯微特征方面均存在一定差異，敗醬草中草酸鈣結晶類型主要為草酸鈣簇晶，類圓形，棱角鈍，白花敗醬中較多，直徑15～35 μm，黃花敗醬中較少，直徑10～17 μm；淀粉粒較多，且多為類圓形單粒，黃花敗醬中直徑6.5～12 μm，臍點點狀或人字狀，白花敗醬中直徑5～32 μm，臍點短縫狀、人字狀或三叉狀；非腺毛有一種，壁較厚，表面具疣狀突起；導管類型主要為螺紋導管和具緣紋孔導管，直徑3.5～35 μm；花粉粒淡黃色，呈類球形，具3 萌發(fā)溝，直徑33～40 μm?；靷纹分胁菟徕}結晶類型為草酸鈣方晶且數(shù)量較少，直徑約5 μm；淀粉粒少見；異葉敗醬中非腺毛有2 種，均為單細胞，分別為厚壁與薄壁非腺毛，具壁疣，菥蓂中非腺毛有3 種，分別為平直厚壁多細胞非腺毛、薄壁多細胞長非腺毛、薄壁單細胞角錐形非腺毛，苣荬菜中非腺毛類型為丁字形多列式；異葉敗醬中導管類型主要為網紋、孔紋、梯紋導管，菥蓂和苣荬菜中的導管類型主要為螺紋導管，直徑5～33 μm，其他類型導管少見；苣荬菜中花粉粒黃色，類圓形，有3 萌發(fā)孔，直徑22～30 μm。

花粉粒的形狀、大小、表面紋理、外壁萌發(fā)孔和雕紋的形態(tài)等常因植物品種不同而異，對鑒定中藥有重要意義，是中藥顯微鑒別的標志性特征之一。在敗醬草正品白花敗醬和黃花敗醬中均清楚觀察到類球形、具3 萌發(fā)溝、外壁有斷刺的花粉粒，可作為敗醬草的特征鑒別依據(jù)?；靷纹匪幉闹袃H在苣荬菜中觀察到花粉粒，其萌發(fā)孔與敗醬草可明顯區(qū)分。此外，混偽品藥材粉末中的部分特殊結構也可將正品與混偽品進行區(qū)分，如針晶僅在異葉敗醬中觀察到，可作為異葉敗醬的特征鑒別依據(jù)；橙色種皮表皮石細胞僅在菥蓂中觀察到，可作為菥蓂的特征鑒別依據(jù)；苣荬菜為菊科植物，存在褐色乳汁碎片及內有黃棕色顆粒狀分泌物的乳汁管，可作為苣荬菜特征鑒別依據(jù)。因此，顯微鑒別可以簡單鑒別敗醬草及其混偽品。具體顯微特征見圖1。

圖1 敗醬草及其混偽品粉末的顯微特征Fig.1 Microscopic characteristics of powder of Herba Patriniae and its adulterants

3.2 敗醬草總皂苷的提取工藝優(yōu)化研究

以黃花敗醬為研究對象，在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化敗醬草總皂苷的提取工藝，為敗醬草及其混偽品的總皂苷提取奠定基礎。

提取溫度、液料比、提取時間和乙醇體積分數(shù)對黃花敗醬總皂苷得率影響的結果如圖2 所示?？傇碥盏寐孰S著溫度的升高先升高后下降，并在提取溫度80 ℃時達到最大值，故確定80 ℃為最佳提取溫度；總皂苷得率隨著液料比的增大先升高后略有下降，并在液料比30∶1 時達到最大值，故確定30∶1 為最佳提取液料比；總皂苷得率隨著時間的增加先升高后下降，并在提取時間120 min 時達到最大值，故確定120 min 為最佳提取時間?？傇碥盏寐孰S著乙醇體積分數(shù)增加先升高后下降，在90%時達到最大值，故確定90%為最佳乙醇體積分數(shù)。

圖2 單因素實驗結果Fig.2 Single factor test results

綜合上述因素，確定響應面分析的各因素考察水平分別為提取溫度70、80、90 ℃，液料比25∶1、30∶1、35∶1，提取時間90、120、150 min，乙醇體積分數(shù)80%、90%、100%。

在黃花敗醬總皂苷提取的單因素試驗基礎上，以提取溫度（A）、液料比（B）、提取時間（C）和乙醇體積分數(shù)（D）為自變量，以總皂苷得率（Y）為響應值，采用Design-Expert 8.0.6 軟件設計4 因素3 水平共29 個試驗點，結果見表2，得到總皂苷得率關于提取溫度（A）、液料比（B）、提取時間（C）和乙醇體積分數(shù)（D）的二階多項式方程：

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface tests

Y＝2.53＋0.013 A－0.043 B＋0.007 5 C＋0.062 D－0.015 AB＋0.080 AC－0.060 AD－0.032 BC－0.035 BD＋0.065 CD－0.19 A2－0.075 B2－0.11 C2－0.094 D2

由表3 可知，試驗所選模型的決定系數(shù)R2＝0.959 5，修正相關系數(shù)R2adj＝0.919 0，模型F＝23.690，P＜0.000 1，表明該模型具有極顯著性意義；失擬項P＞0.05，無顯著性差異，表明該模型與試驗數(shù)據(jù)擬合程度良好。B、D、AC、AD、CD、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.05，表明其對總皂苷得率具有顯著性影響。各因素的影響程度通過F 值反映，F(xiàn) 值越大代表該因素的影響程度越大，故各因素對總皂苷得率的影響次序乙醇體積分數(shù)（D）＞液料比（B）＞提取溫度（A）＞提取時間（C）。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

通過軟件Design-Expert 10.0 軟件分析可知，黃花敗醬總皂苷的最優(yōu)提取條件為提取溫度80.30 ℃，液料比27.69 mL/g，提取時間128.03 min，乙醇為95%，預測總皂苷得率為2.55%?？紤]到實際操作，最終將其確定為提取溫度80 ℃，液料比28 mL/g，提取時間128 min，乙醇體積分數(shù)95%。此條件下對建立的數(shù)學模型進行驗證，獲得的黃花敗醬總皂苷實際測得值為（2.57±0.05）%，與預測值相差小，說明該模型符合黃花敗醬總皂苷提取工藝研究及后續(xù)數(shù)據(jù)利用。

3.3 敗醬草及其混偽品總皂苷得率的比較分析

以最佳提取工藝對敗醬草及其混偽品樣品進行總皂苷提取，平行3 次，測得各樣品總皂苷得率，如圖3 所示。其中黃花敗醬、白花敗醬、異葉敗醬的總皂苷得率較高，分別為2.57%、3.48%和2.72%；菥蓂、苣荬菜的總皂苷得率較低，白花敗醬總皂苷含量顯著高于其市場偽品總皂苷含量，黃花敗醬總皂苷含量顯著高于菥蓂、苣荬菜總皂苷含量，不進行準確區(qū)分鑒定將影響其臨床療效，并帶來一定的安全隱患。

圖3 敗醬草及其混偽品總皂苷得率比較Fig.3 Comparison of the yields of total saponins from Herba Patriniae and its adulterants

3.4 敗醬草及其混偽品HPLC 指紋圖譜研究

將26 批樣品液相色譜圖數(shù)據(jù)導入—中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）進行分析，分別生成5 個物種的對照圖譜，如圖4-B～F 所示，26批樣品疊加圖譜中標定11 個共有峰分別為1～4、9、11～16 號峰，如圖4-A 所示。同時通過與對照比對，指認其中3 個成分，確認1 號峰為熊果苷，15 號峰為常春藤皂苷元，16 號峰為齊墩果酸。其中1 號峰在白花敗醬中占比最高，15 號峰在異葉敗醬中占比最高，16 號峰僅在黃花敗醬、白花敗醬中存在。共有峰中，3 號峰在異葉敗醬中占比顯著高于其他樣品，9 號峰在黃花敗醬中占比顯著高于其他樣品，11 號峰在白花敗醬中占比顯著高于其他樣品，13 號峰在苣荬菜中占比顯著高于其他樣品，3、4、14 號峰在部分混偽品中均有缺失。5 號峰、10 號峰僅在白花敗醬、黃花敗醬中存在且在白花敗醬中占比顯著高于黃花敗醬，6、8、17 號峰在白花敗醬中占比顯著高于其他樣品，7 號峰僅在菥蓂中存在。敗醬草及其混偽品的指紋圖譜存在著顯著差異，因此HPLC 指紋圖譜可作為一種鑒別敗醬草正偽品種的有效手段。各樣品色譜圖中均存在1 號峰（熊果苷），其與鄰峰的分離度較好，峰形較佳，且峰面積較大，故選擇該峰作為參考峰（S），計算得出26 批樣品共有峰相對峰面積的RSD 為28.19%～188.06%。敗醬草及其混偽品共有峰相對峰面積的RSD 值差異較大，表明敗醬草及其混偽品樣品同一化學成分含量差異較大。由指紋圖譜可知白花敗醬各化學成分最為豐富，且各成分含量也較高。

圖4 敗醬草及其混偽品樣品HPLC 疊加圖譜及對照圖譜Fig.4 HPLC overlay atlas and comparative atlas of Herba Patriniae and its adulterants

3.5 敗醬草及其混偽品指紋圖譜相似度分析

將26 批樣品圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）軟件進行分析處理，試驗過程中發(fā)現(xiàn)S1 圖譜出峰多且成分含量較高，故以S1 號白花敗醬樣品的指紋圖譜為參照圖譜，進行自動匹配，并對所有的HPLC指紋圖譜全譜進行相似度計算，結果如表4 所示。26 批樣品的相似度差異較大，習用品和混用品相似度在0.137～0.644，可見5 種樣品差異較大，該指紋圖譜可對其進行鑒別區(qū)分。

表4 敗醬草及其混偽品樣品相似度評價Table 4 Similarity evaluation table of Herba Patriniae and its adulterants

3.6 敗醬草及其混偽品指紋圖譜聚類分析

以敗醬草及其混偽品11 個共有峰的面積為變量，導入SPSS 25.0 軟件，采用組間連接聚類方法，以平方歐式距離為度量標準進行系統(tǒng)聚類分析[18]，結果如圖5 所示。當歐式距離為2 時，敗醬草及其混偽品可分為6 類，苣荬菜（S7～S12）樣品聚為第1 類，菥蓂（S23～S26）樣品聚為第2 類、黃花敗醬（S13～S18）樣品聚為第3 類、白花敗醬（S1～S6）樣品聚為第4 類、異葉敗醬（S19、S21、S22）樣品聚為第5 類，異葉敗醬（S20）聚為第6 類，證明5 種樣品之間可以明確區(qū)分鑒別，與相似度分析結果一致。其中，歐式距離＞5 時，GroupⅠ～Ⅲ可聚為一類，表現(xiàn)出較近的親緣關系，苣荬菜、菥蓂、黃花敗醬的化學成分及含量具有一定的相似性，提示苣荬菜、菥蓂可能有部分藥理活性與黃花敗醬類似，值得深入研究。

圖5 敗醬草及其混偽品樣品聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of Herba Patriniae and its adulterants

3.7 敗醬草及其混偽品指紋圖譜的主成分分析和綜合評價研究

通過SPSS 25.0 軟件對26 批樣品HPLC 指紋圖譜的11 個共有特征峰峰面積進行數(shù)據(jù)處理，采用降維、因子分析，以回歸方法，計算主成分特征值和方差貢獻率，結果見表5，得到主成分因子載荷矩陣，結果如表6 所示。主成分特征值和方差貢獻率是選擇主成分的依據(jù)，載荷矩陣反映了各變量對主成分的重要程度[19-20]。以特征值＞1 為標準，得到3個主成分，其中主成分F1、F2、F3 的貢獻率分別為43.15%、27.24%、18.35%，累計貢獻率為88.73%，表明可以反映樣品大部分的信息，可作為敗醬草及其混偽品成分的評價指標。主成分因子荷載矩陣表中，峰1（熊果苷）、2、11、12、15（常春藤皂苷元）在主成分1 上有較高載荷，說明主成分1 主要反映這5 個成分指標信息；同理，主成分2 主要反映峰3、4、13、14 這4 個成分指標的信息；主成分3 主要反映峰9、16（齊墩果酸）這2 個成分指標的信息。以3 個主要成分建立坐標系，繪制敗醬草及其混偽品的得分圖，如圖6 所示，表明敗醬草及其混偽品的質量存在一定的差異，可將26 批樣品分為5 群，其分析結果與聚類分析結果一致。

圖6 敗醬草及其混偽品樣品主成分分析得分圖Fig.6 Principal component analysis scores of Herba Patriniae and its adulterants

表5 敗醬草及其混偽品樣品主成分特征值和方差貢獻率Table 5 Principal component characteristic value and variance contribution rate of Herba Patriniae and its adulterants

表6 敗醬草及其混偽品樣品主成分因子荷載矩陣Table 6 Principal component factor load matrix of Herba Patriniae and its adulterants

采用3 個主成分得分情況，以各主成分對應的方差貢獻率為權重，按照公式F＝0.431 48 F1＋0.272 37 F2＋0.183 49 F3，計算綜合得分及排名，如表7 所示。結果表明白花敗醬樣品中1（熊果苷）、2、3、4、11、12 等含量較高，且綜合得分為1.85，在各樣品中位居第1 位，表明白花敗醬質量最好。而苣荬菜不僅各成分含量低，且綜合得分墊底，表明苣荬菜質量較差。敗醬草及其混偽品樣品主成分得分之間具有一定差異，表明這些成分與藥材質量存在著一定相關性，可以反映敗醬草及其混偽品的差異性，為敗醬草及其混偽品的鑒別提供更有力的參考依據(jù)。

表7 敗醬草及其混偽品主成分得分、綜合得分Table 7 Principal component scores and comprehensive scores of Herba Patriniae and its adulterants

4 討論

本研究采用的生藥學鑒定、單因素實驗法、響應面法優(yōu)化提取工藝、HPLC 指紋圖譜法等研究方法，已被廣泛應用于各領域的科學研究，其穩(wěn)定性和可靠性已被認可。雖然目前已有部分關于敗醬草及其混偽品鑒別的研究，如羅霄等[21]、周寶玉等[22]均對敗醬草的鑒別有一定的研究，但基本使用的是傳統(tǒng)的生藥學鑒別方法，且大多局限于性狀特征，對敗醬草及其混偽品的顯微特征及藥效物質基礎研究甚少。而在敗醬草總皂苷的提取工藝優(yōu)化及指紋圖譜建立方面，研究主要集中于敗醬草而未與混偽品結合研究[23]。敗醬草及其混偽品飲片為干品，部分特征缺失，所以性狀鑒定的難度很大，準確性偏低。顯微鑒別研究發(fā)現(xiàn)，敗醬草與其他3 種混偽品在粉末的組織結構、細胞性狀或內含物類型基本相似，但之間仍存在差異和一些特殊結構。傳統(tǒng)的鑒定方法辨別難度較大，鑒定手段具有一定的主觀性，HPLC 指紋圖譜鑒別是一種快速有效的鑒別手段[24-25]，可彌補傳統(tǒng)鑒別方法的不足。本研究使用傳統(tǒng)鑒別方法和現(xiàn)代技術鑒別手段相結合，提高試驗的準確性和科學性。

總皂苷作為敗醬草中主要有效成分之一，其含量高低是衡量和評價敗醬草質量的關鍵因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，敗醬草及其3 種混偽品所含的化學成分復雜，但均含有總皂苷類成分，且含量不同，因此其含量可作為一個鑒定的參考。目前對敗醬草皂苷類成分的藥理活性研究較少，故本研究對敗醬草總皂苷提取工藝進行優(yōu)化，以期為后續(xù)敗醬草藥理作用研究提供基礎。響應面試驗所得的黃花敗醬總皂苷得最優(yōu)提取條件下總皂苷得率為（2.57±0.05）%，相比潘濤等[26]在正交工藝優(yōu)化下的得率1.26%有了明顯的提升，表明該工藝優(yōu)化較大程度提高了黃花敗醬總皂苷的得率，為敗醬草總皂苷的高效提取提供基礎。此外，本實驗得到的黃花敗醬總皂苷僅為粗提物，其具體的單體化合物組成、成分含量及對應藥理活性值得后續(xù)深入研究。

本實驗聚類分析中黃花敗醬、苣荬菜和菥蓂表現(xiàn)出較近的親緣關系，表明其化學成分及含量具有一定的相似性，提示苣荬菜、菥蓂可能有部分藥理活性與黃花敗醬類似，且二者長期作為敗醬草的代替習用品，具有一定的科學依據(jù)。本研究的開展為苣荬菜、菥蓂的開發(fā)與利用提供了一定的技術保障，為后續(xù)苣荬菜、菥蓂的應用研究奠定了基礎，有助于對其進一步深入研究和開發(fā)。綜合評價結果得出白花敗醬質量最好，苣荬菜質量較差。由以上結果可知，總皂苷得率較高的白花敗醬的綜合評價排名靠前，表明綜合評價的結果與總皂苷的得率有一定的相關性。本研究發(fā)現(xiàn)，HPLC 指紋圖譜可以作為一種鑒別敗醬草及其混用品并評價其質量差異的方法，但藥材的生長時期、生長環(huán)境、炮制方法、儲存時期等均會對藥材所含化學成分種類、含量造成一定的影響，因此應進一步在其他方面進行深入分析，以提高藥材鑒別及臨床用藥的科學性。

本研究對敗醬草及其市場上常見混偽品進行了鑒定，為敗醬草的鑒別及完善質量標準提供了科學依據(jù)，保證了用藥的準確性，故提議醫(yī)藥工作者應對敗醬草的藥源加以規(guī)范，杜絕偽品摻雜，確保臨床療效，為后續(xù)敗醬草的藥物資源研究開發(fā)利用提供基礎保障，推動敗醬草的深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突