馬永強(qiáng),隋佳琦,黎晨晨,馬調(diào)梅

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱,150028)

蝦青素(3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素)是一種含氧類胡蘿卜素,廣泛存在于鮭魚、南極磷蝦等水產(chǎn)品中,也存在于藻類、細(xì)菌、真菌等特定微生物中。蝦青素分子結(jié)構(gòu)中存在的長(zhǎng)鏈共軛不飽和雙鍵、酮基等與其生理功能密切相關(guān)。蝦青素不僅有抗氧化作用,而且還有很多生理活性,包括防治心血管疾病和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)等[1]。蝦青素在自然界中大部分是全反式-(all-E-)。蝦青素在光照、熱量、O2和酸堿的作用下,很容易被降解和破壞,這些都有利于全反式轉(zhuǎn)化為順式蝦青素[2]。人體內(nèi)可檢測(cè)到9-順式蝦青素及13-順式蝦青素,另外在食品加工產(chǎn)品還發(fā)現(xiàn)15順蝦青素及(9順-,13順-)(9順-,15順-)(13順-,15順-)雙順式蝦青素,其中主要的順式異構(gòu)體為9-順式蝦青素、13-順式蝦青素。YANG等[3]研究指出,9-順和13-順蝦青素的抗氧化性和生物利用率遠(yuǎn)高于全反式蝦青素。天然存在的蝦青素大多是全反式構(gòu)型,但是蝦青素想要更好的在體內(nèi)發(fā)揮其生物活性,需要將全反式構(gòu)型轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖浇Y(jié)構(gòu)。

目前常見的蝦青素異構(gòu)化方法有熱異構(gòu)、光異構(gòu)、碘催化等,這些方法在異構(gòu)化速率和其他方面都各不相同[4-5]。陳曉楓[6]通過(guò)添加碘單質(zhì)進(jìn)行光催化,碘日光照射生成的順式蝦青素占比高,且方法便捷、耗時(shí)短。楊成[7]使用熱異構(gòu)的方法比較了多種溶劑對(duì)全反式蝦青素異構(gòu)化的影響,結(jié)果表明二氯甲烷是促進(jìn)全反式蝦青素異構(gòu)化的最佳溶劑,將含有蝦青素的二氯甲烷溶液于35 ℃加熱,50 h內(nèi)反應(yīng)即可達(dá)到平衡;同時(shí)楊成[7]發(fā)現(xiàn)采用二甲基亞砜作為溶劑時(shí),高溫(50 ℃)可以增加全反式蝦青素異構(gòu)化的轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率比25、35 ℃時(shí)更高。蝦青素異構(gòu)體的檢測(cè)方法主要有HPLC,利用不同的檢測(cè)器根據(jù)保留時(shí)間和光譜特征進(jìn)行定性分析。LI等[8]利用HPLC法鑒定類胡蘿卜素的幾何異構(gòu)體;楊成[7]采用半制備液相分離蝦青素順式異構(gòu)體;鞏風(fēng)英[9]通過(guò)對(duì)合成過(guò)程中異構(gòu)化進(jìn)行分析,利用HPLC分析了幾何異構(gòu)體的占比。然而常見的全反式蝦青素異構(gòu)化方法中多數(shù)存在催化劑不易脫除和實(shí)驗(yàn)耗用時(shí)間長(zhǎng)的缺陷[10-16]。目前關(guān)于高效大量制備順式蝦青素的研究較少,且蝦青素異構(gòu)化過(guò)程中有機(jī)溶劑、催化劑的選擇等方面還需進(jìn)一步研究。

本研究的原料為全反式蝦青素,采用微波加熱法對(duì)蝦青素進(jìn)行異構(gòu)化,探究有機(jī)溶劑、催化劑、蝦青素濃度、微波條件對(duì)蝦青素異構(gòu)化的影響,優(yōu)化高順式蝦青素制備工藝。為其在功能性食品中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦青素(純度98%),陜西金康泰生物科技有限公司;蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品,阿拉丁試劑上海有限公司;丙酮、二氯甲烷、二甲基亞砜、乙酸乙酯(分析純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;異硫氰酸甲酯、異硫氰酸己酯、二甲基三硫(分析純)、乙腈、甲酸(色譜級(jí)),阿拉丁試劑上海有限公司。

1260型高效液相色譜儀,安捷倫科技中國(guó)有限公司;XH-MC-1微波干燥器,北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;MC型精密電子天平(精度0.1 mg),北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;Thermo Scientific Q-Exactive質(zhì)譜儀,美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高順式蝦青素異構(gòu)體的測(cè)定

1.2.1.1 蝦青素順式異構(gòu)化方法

采用微波加熱法對(duì)全反式蝦青素進(jìn)行異構(gòu)化。取5 mg全反式蝦青素,溶于5 mL乙酸乙酯,配制成1.0 mg/mL的蝦青素溶液,倒入三口燒瓶,置于微波干燥器中,接回流冷凝裝置。微波功率600 W、微波溫度65 ℃,加熱5 min后取樣,反應(yīng)后的溶液用甲醇定容,0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾;HPLC檢測(cè)分析并計(jì)算蝦青素異構(gòu)體的含量。

1.2.1.2 HPLC條件

HPLC條件參照楊成[7]的方法稍有修改:使用Infinity-II-126型高效液相色譜儀搭配二極管陣列檢測(cè)器(diode array detector,DAD),色譜柱:UltimateXB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,4 μm);柱溫25 ℃,流速0.7 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫的條件為:流動(dòng)相: A(0.1%甲酸-水溶液),B(95%甲醇與5%乙腈), 0～2.5 min,40%～20%A;2.5～7.5 min,20%～0%A;17.5～20 min,0%A;20～20.5 min,0%～40%A,20.5～26 min,40%A。

DAD波長(zhǎng)掃描范圍:220～700 nm。參照標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間及UV/Vis光譜數(shù)據(jù)(Q值)以及文獻(xiàn)[17-18]對(duì)不同蝦青素異構(gòu)體進(jìn)行了初步鑒定。

1.2.1.3 順式占比的計(jì)算

通過(guò)計(jì)算液相色譜圖中順式峰峰面積的所占比,從而得到不同順式結(jié)構(gòu)的順式占比。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 有機(jī)溶劑的確定

采用不同的有機(jī)溶劑研究蝦青素在溶液中的異構(gòu)化反應(yīng)。選擇了一些在室溫下容易溶解蝦青素的溶劑,如二甲基亞砜、乙酸乙酯和丙酮。取5 mg全反式蝦青素溶于不同有機(jī)溶劑,配制成1.0 mg/mL的蝦青素溶液,倒入三口燒瓶,置于微波干燥器中,接回流冷凝裝置。微波功率600 W、微波溫度65 ℃,加熱5 min后取樣,反應(yīng)后的溶液用甲醇定容,0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾;HPLC檢測(cè)分析并計(jì)算蝦青素異構(gòu)體的含量。考察了4種不同有機(jī)溶劑在蝦青素異構(gòu)化過(guò)程中的作用,并篩選出順式比例最大的作為后續(xù)試驗(yàn)對(duì)象。

1.2.2.2 催化劑及添加量的確定

稱取5 mg蝦青素,將其溶于乙酸乙酯,配制成1.0 mg/mL的蝦青素溶液,水浴超聲讓蝦青素完全溶解。分別加入催化劑異硫氰酸甲酯、異硫氰酸己酯和二丙基三硫,每種催化劑的質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 mg/mL。倒入三口燒瓶,置于微波干燥器中,接回流冷凝裝置。微波功率600 W、微波溫度65 ℃,加熱5 min后取樣,反應(yīng)后的溶液用甲醇定容,0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,HPLC檢測(cè)分析并計(jì)算蝦青素異構(gòu)體含量?？疾炝?種不同類型的催化劑及其添加量對(duì)蝦青素異構(gòu)化的影響,篩選出其中順式比例較高的催化劑和添加量。

1.2.2.3 蝦青素溶液質(zhì)量濃度的確定

稱取蝦青素(5、7.5、10、12.5、15 mg),將其溶于乙酸乙酯,配制成不同質(zhì)量濃度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL)的蝦青素溶液,水浴超聲讓蝦青素完全溶解,添加催化劑(異硫氰酸甲酯添加量60 mg/mL)。倒入三口燒瓶,置于微波干燥器中,接回流冷凝裝置。微波功率600 W、微波溫度65 ℃,加熱5 min后取樣,反應(yīng)后的溶液用甲醇定容,0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,HPLC檢測(cè)分析并計(jì)算蝦青素異構(gòu)體含量。研究蝦青素溶液質(zhì)量濃度對(duì)異構(gòu)化的作用效果,選擇順式占比最高的蝦青素溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.4 微波加熱條件的確定

稱取7.5 mg蝦青素,將其溶于乙酸乙酯,配制成1.5 mg/mL的蝦青素溶液,水浴超聲讓蝦青素完全溶解,添加催化劑(異硫氰酸甲酯,60 mg/mL)。微波時(shí)間5～25 min、微波功率300～700 W、微波溫度55～75 ℃。反應(yīng)后的溶液用甲醇定容,0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,HPLC檢測(cè)分析并計(jì)算蝦青素異構(gòu)體含量。確定最優(yōu)的微波加熱條件。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),自變量為A、B、C、D,分別為溫度、功率、時(shí)間及蝦青素溶液質(zhì)量濃度,因變量為Y:蝦青素順式占比。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,表1為因素及水平編碼。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table 1 Experimental factors and level for response surfaces

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。曲線圖使用Origin對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪制,采用Design-Expert進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.4 順式蝦青素的構(gòu)型鑒定

異構(gòu)化后的產(chǎn)物采用超高效液相-質(zhì)譜(ultra-HPLC-mass spectrometry, UPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步鑒定并確定了順式蝦青素的結(jié)構(gòu)組成[19]。質(zhì)譜條件:離子源HESI,毛細(xì)管263 ℃,氣化溫度425 ℃,源電壓3.5 kV,掃描范圍:100～1 000m/z。通過(guò)LC-MS得到不同時(shí)間峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖,再與蝦青素的分子質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)分析,判斷新生成的物質(zhì)是否為蝦青素異構(gòu)體。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法鑒定蝦青素結(jié)構(gòu)

高效液相色譜法能較好地將樣品中天然色素分離出來(lái),它具有分離效果好,檢測(cè)靈敏度和分離效率高的優(yōu)點(diǎn),目前已成為類胡蘿卜素分析應(yīng)用非?；钴S的方法之一,是蝦青素定性定量檢測(cè)最重要的技術(shù)[20-21]。從圖1-a可以看出,全反式蝦青素檢測(cè)出現(xiàn)了一個(gè)色譜峰,且在此液相條件下的保留時(shí)間為17.67 min。

微波加熱將全反式蝦青素異構(gòu)化形成高順式蝦青素。經(jīng)微波加熱后的液相色譜圖表明,檢測(cè)獲得了3個(gè)色譜峰,從3個(gè)色譜峰和各色譜峰的UV-Vis光譜中得知,1號(hào)色譜峰保留時(shí)間為17.35 min與全反式蝦青素的保留時(shí)間基本一致,由此可以推斷峰1為全反式蝦青素。圖1-b色譜峰上峰1的保留時(shí)間(17.35 min)、峰2的保留時(shí)間(19.45 min)、峰3的保留時(shí)間(19.62 min)對(duì)應(yīng)色譜峰的UV-Vis光譜與全反式蝦青素的UV-Vis光譜相似,可確定圖1中峰2和峰3是2個(gè)順式異構(gòu)色譜峰。

由圖2可知,不同峰位在某一波長(zhǎng)區(qū)間吸光度的變化情況,其中全反式蝦青素特征吸收峰出現(xiàn)在470 nm處,這一波長(zhǎng)為蝦青素的最大吸收波長(zhǎng)。另一些異構(gòu)體除了主要的吸收峰以外,還同時(shí)會(huì)在300～400 nm出現(xiàn)特征順式峰。YUAN等[22]認(rèn)為全反式蝦青素異構(gòu)化生成順式異構(gòu)體后,紫外吸收波長(zhǎng)最大值發(fā)生位移,光譜近紫外區(qū)有一個(gè)新的吸收最大值出現(xiàn),體現(xiàn)在色譜圖中即為“藍(lán)移”。如圖2所示,其中峰2的紫外最大吸收波長(zhǎng)為470 nm,發(fā)生了2～10 nm的藍(lán)移,被認(rèn)定為9-順式異構(gòu)體,與YUAN等[22]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。同時(shí),峰3不同的地方在于370 nm以及468 nm時(shí)出現(xiàn)2個(gè)最大吸收峰,被認(rèn)定為13-順式蝦青素異構(gòu)體,與ZHAO等[23]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明該試驗(yàn)可以成功鑒定蝦青素的異構(gòu)體。將順式峰的吸光度和主峰的吸光度之比定義為Q值,并將Q值進(jìn)行對(duì)比來(lái)判斷蝦青素的幾何構(gòu)型[24]。如表2所示,圖1中2、3號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的Q值分別為0.39和0.95。Q值越高,C鏈中間出現(xiàn)異構(gòu)的可能性也就越大[25]?？梢源_定熱異構(gòu)化后蝦青素多個(gè)不同的異構(gòu)體:其中峰1是全反式蝦青素,峰2是9-順式蝦青素,峰3是13-順式蝦青素。由于使用了不同的流動(dòng)相及色譜條件,該研究中Q值及UV-Vis光譜與文獻(xiàn)中所報(bào)道的資料略有不同。

a-全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品;b-蝦青素異構(gòu)化后

表2 蝦青素異構(gòu)體的初步鑒定Table 2 Initial identification of the astaxanthin isomers

a-全反式蝦青素;b-9-順式蝦青素;c-13-順式蝦青素

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同有機(jī)溶劑對(duì)蝦青素順式占比的影響

不同的反應(yīng)條件會(huì)影響蝦青素異構(gòu)化產(chǎn)物的種類和產(chǎn)率,已有研究報(bào)道不同溶劑加熱時(shí)全反式蝦青素異構(gòu)體的異構(gòu)化效果,并發(fā)現(xiàn)高溫有利于全反式蝦青異構(gòu)體的形成,溶劑效應(yīng)也會(huì)影響不同順式異構(gòu)體的形成和積累[26]。本研究將全反式蝦青素分別溶于丙酮,乙酸乙酯和二甲基亞砜中加熱,如圖3所示,在65 ℃高溫加熱條件下,不同溶劑中蝦青素轉(zhuǎn)化效率順序?yàn)橐宜嵋阴?22.6%)>二甲基亞砜(20.8%)>丙酮(14%)。全反式蝦青素溶于乙酸乙酯,2種順式蝦青素異構(gòu)體比例存在顯著性差異,所得的9-順式蝦青素的占比為4.62%,13-順式蝦青素占比為17.98%。

圖3 不同有機(jī)溶劑對(duì)蝦青素順式占比的影響Fig.3 Effects of different organic solvent on the cis-ratio of astaxanthin

2.2.2 催化劑對(duì)蝦青素順式占比的影響

當(dāng)催化劑加入全反式蝦青素溶液中微波加熱處理后,蝦青素的順式異構(gòu)化增強(qiáng),其轉(zhuǎn)化程度因催化劑不同而不同[27]。本文研究3種催化劑(二丙基三硫、異硫氰酸甲酯、異硫氰酸己酯)及其添加量對(duì)熱處理后的蝦青素順式異構(gòu)化的影響。由圖4可知,添加60 mg/mL異硫氰酸甲酯催化效率最高,總順式占比達(dá)到25.99%,其中9-順式蝦青素占8.39%,13-順式蝦青素占17.59%。隨著催化劑質(zhì)量濃度的增加,反應(yīng)加速,進(jìn)而促進(jìn)了蝦青素的順式異構(gòu)化反應(yīng),蝦青素異構(gòu)體的順式比例有上升趨勢(shì),順式異構(gòu)體在催化劑質(zhì)量濃度為60 mg/mL的時(shí)候趨于穩(wěn)定。當(dāng)質(zhì)量濃度大于60 mg/mL時(shí),加大催化劑質(zhì)量濃度會(huì)影響蝦青素異構(gòu)化率。故選用60 mg/mL的異硫氰酸甲酯進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同催化劑對(duì)蝦青素順式占比的影響Fig.4 Effects of different catalyst on the cis-ratio of astaxanthin

2.2.3 質(zhì)量濃度對(duì)蝦青素順式占比的影響

圖5為不同質(zhì)量濃度的蝦青素溶液,以乙酸乙酯為介質(zhì)65 ℃下加熱得到的順式異構(gòu)體占比。蝦青素順式比例隨蝦青素溶液質(zhì)量濃度升高呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。這是因?yàn)橐宜嵋阴サ奶幚砟芰τ邢?蝦青素溶液質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)會(huì)出現(xiàn)掛壁的現(xiàn)象,造成蝦青素會(huì)有一部分損失,同時(shí)對(duì)異構(gòu)化后的順式占比產(chǎn)生影響。提高蝦青素溶液質(zhì)量濃度,可以明顯提高順式蝦青素的生成效率進(jìn)而促進(jìn)蝦青素異構(gòu)化,蝦青素溶液質(zhì)量濃度提高到1.5 mg/mL時(shí),蝦青素的順式異構(gòu)體比例較高,異構(gòu)化效果好。故選取1.5 mg/mL蝦青素溶液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同蝦青素溶液質(zhì)量濃度對(duì)蝦青素順式占比的影響Fig.5 Effect of different astaxanthin solution mass concentration on the cis-ratio of astaxanthin

2.2.4 微波時(shí)間對(duì)蝦青素順式占比的影響

蝦青素異構(gòu)化作用隨熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。不同順式異構(gòu)體在熱處理時(shí)異構(gòu)化程度不同,順序上也有所不同[28-29]。由圖6可知,微波加熱20 min時(shí),蝦青素總順式占比最高為43.48%,9-順式蝦青素含量增加到13.10%,13-順式蝦青素30.38%。在5～20 min,蝦青素順式比例隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),而在加熱時(shí)間大于20 min以上的時(shí)候,蝦青素順式占比呈下降趨勢(shì)。加熱時(shí)間的延長(zhǎng)可以對(duì)蝦青素的異構(gòu)化起到促進(jìn)作用。但是,在加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的情況下,其所形成的順式異構(gòu)體也會(huì)發(fā)生降解,從而造成蝦青素總含量降低,蝦青素順式轉(zhuǎn)化率降低。故選取微波時(shí)間20 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 不同微波時(shí)間對(duì)蝦青素順式占比的影響Fig.6 Effects of different microwave time on cis-ration of astaxanthin

2.2.5 微波功率對(duì)蝦青素順式占比的影響

微波功率對(duì)蝦青素的異構(gòu)化程度具有一定的影響。由圖7可知,微波功率為600 W時(shí),蝦青素總順式占比最高為47.83%。在300～600 W,隨著微波功率的增大,蝦青素總順式占比逐漸增大,其中9-順式蝦青素比例變化較小,而13-順式蝦青素的占比則持續(xù)增加。當(dāng)超過(guò)600 W時(shí),蝦青素順式占比不斷下降。這是由于功率不斷提升,對(duì)于蝦青素異構(gòu)化有促進(jìn)作用,但功率過(guò)大會(huì)導(dǎo)致順式蝦青素的占比降低,蝦青素異構(gòu)化速率小于降解速率,從而對(duì)蝦青素的順式占比造成了影響。故選取600 W的功率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖7 不同微波功率對(duì)蝦青素順式占比的影響Fig.7 Effects of different microwave power on cis-ration of astaxanthin

2.2.6 微波溫度對(duì)蝦青素順式占比的影響

蝦青素的異構(gòu)化程度也取決于微波加熱的溫度[30]。由圖8可得出,微波溫度為70 ℃時(shí),蝦青素總順式占比最高48.73%。溫度較低時(shí),9-順式和13-順式蝦青素的比例上升速度比較緩慢;隨微波溫度的不斷上升,9-順式和13-順式蝦青素含量比例均呈上升趨勢(shì);但當(dāng)微波溫度超過(guò)70 ℃時(shí),蝦青素總順式占比下降至43.88%。這是因?yàn)槲⒉訜釡囟忍岣叽龠M(jìn)順式異構(gòu)體生成,且該溫度范圍內(nèi)順式異構(gòu)體的降解速率相較緩慢;當(dāng)溫度過(guò)高時(shí),全反式蝦青素很快發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng),但是會(huì)因?yàn)轫樖疆悩?gòu)體的熱不穩(wěn)定降解[31],造成蝦青素的損失,影響了蝦青素順式占比,故選取70 ℃的微波溫度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖8 不同微波溫度對(duì)蝦青素順式占比的影響Fig.8 Effects of different microwave temperature on cis-ration of astaxanthin

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn),選擇微波溫度(A)、微波功率(B)、微波時(shí)間(C)、蝦青素濃度(D),以順式占比(Y)為響應(yīng)值。按照Box-Behnken的設(shè)計(jì)試驗(yàn),進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn),表3為試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken test design and results

采用Design-Expert數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行擬合分析,根據(jù)表4建立四因素三水平多元回歸擬合,得到二次回歸模型方程為:Y=48.49-0.54A-0.46B+1.89C+0.36D+1.97AB-2.08AC+0.55AD-2.38BC+0.85BD+0.19CD-6.21A2-4B2-3.16C2-4.2D2。根據(jù)表4可知模型F=10.81,P<0.000 1。說(shuō)明所建立的模型達(dá)到顯著水平(P<0.000 1),失擬性檢驗(yàn)差異不顯著,R2=0.915 3,表明所得模型的擬合程度較好,可用于預(yù)測(cè)分析。從各個(gè)因子F值大小可以看出,各個(gè)因子對(duì)蝦青素順式比例影響程度排序依次是:C(微波時(shí)間)>A(微波溫度)>B(微波功率)>D(蝦青素濃度)。微波溫度和微波功率(AB),微波溫度和微波時(shí)間(AC),微波功率和微波時(shí)間(BC)存在一定的交互作用,對(duì)蝦青素順式占比率具有顯著影響。

表4 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 4 Regression equation coefficients and significance test

根據(jù)回歸方程得出響應(yīng)面圖,分析任意兩因素交互作用對(duì)蝦青素順式占比的影響。觀察響應(yīng)面圖,因素的改變對(duì)響應(yīng)值越明顯,響應(yīng)曲面坡度越彎。如圖9所示,任意兩因素對(duì)蝦青素順式占比的影響大小:微波功率和微波時(shí)間(BC)>微波溫度和微波時(shí)間(AC)>微波溫度和微波功率(AB)。在等高線圖中,交互作用的強(qiáng)度能夠從等高線圖的形狀反映出來(lái),等高線圖形越橢圓,響應(yīng)面坡度愈陡,表示交互作用對(duì)于順式占比有顯著影響。

a-微波溫度、微波功率交互作用;b-微波溫度、微波時(shí)間交互作用;c-微波溫度、蝦青素濃度交互作用; d-微波功率、微波時(shí)間交互作用;e-微波功率、蝦青素濃度交互作用;f-微波時(shí)間、蝦青素濃度交互作用

2.4 最佳工藝條件與驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)擬合模型方程,得到最佳條件:微波溫度69.24 ℃,微波功率578 W,微波時(shí)間22.16 min,蝦青素質(zhì)量濃度1.51 mg/mL,蝦青素順式占比為48.99%。根據(jù)實(shí)際條件,對(duì)最佳條件進(jìn)行調(diào)整:微波溫度為69 ℃,微波功率為600 W,微波時(shí)間為22 min,蝦青素的質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL,在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),取其平均值,蝦青素總順式占比為49.34%、9-順式蝦青素占比為40.48%、13-順式蝦青素占比為8.86%,與模型無(wú)顯著差異。

2.5 蝦青素異構(gòu)體結(jié)構(gòu)鑒定

以上實(shí)驗(yàn),全反式蝦青素經(jīng)過(guò)熱異構(gòu)化反應(yīng)生成新物質(zhì),為了進(jìn)一步證實(shí)產(chǎn)生的新物質(zhì)是順式構(gòu)型蝦青素,使用UPLC-MS檢測(cè),鑒定蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品樣品,如圖10所示。

圖10 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Fig.10 Mass spectra of astaxanthin standard

對(duì)蝦青素順式異構(gòu)化后的樣品進(jìn)行液相質(zhì)譜檢測(cè),其質(zhì)譜圖如圖11所示。

圖11 蝦青素異構(gòu)體的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Fig.11 Mass spectra of astaxanthin isomers

從蝦青素異構(gòu)體的HPLC結(jié)果可知1號(hào)峰是全反式蝦青素,經(jīng)液質(zhì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)如色譜圖中峰2和峰3的質(zhì)譜圖和峰1的質(zhì)譜圖相似,他們具有共同的分子離子峰[M+H]+為597.39,且3個(gè)質(zhì)譜圖高度一致,基本可以斷定2、3峰都屬于蝦青素的異構(gòu)體,也就是3個(gè)峰的分子質(zhì)量都和蝦青素質(zhì)荷比一致,從而推測(cè)這3種物質(zhì)是蝦青素的同分異構(gòu)體。結(jié)合文獻(xiàn)[7],通過(guò)匹配出峰保留時(shí)間,光譜圖、Q值以及UPLC-MS等方法可以鑒定出峰1、2和3分別是全反式蝦青素、9-順式蝦青素異構(gòu)體、13-順式蝦青素異構(gòu)體。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化蝦青素的異構(gòu)化條件,確定了高順式蝦青素的制備方法;使用HPLC和LC-MS對(duì)蝦青素幾種不同幾何構(gòu)型進(jìn)行了分析和鑒定。通過(guò)試驗(yàn),得出最佳條件:60 mg/mL異硫氰酸甲酯,微波溫度69 ℃,微波功率600 W,微波時(shí)間22 min,蝦青素的質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL。在此條件下,蝦青素總順式占比率為49.34%。本研究在前人研究基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化,提供一種可以快速制備順式蝦青素的異構(gòu)化方法,同時(shí)也提高了蝦青素的順式占比,可為蝦青素在食品和藥品等領(lǐng)域進(jìn)一步的應(yīng)用與發(fā)展提供一定參考,具有潛在應(yīng)用價(jià)值。