佘丹，王舒婷，陸信曜，宗紅，諸葛斌

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫 214122）

1,2,4-丁三醇（1,2,4-butanetriol，BT）是一種無色、無味的非天然化合物，性質(zhì)與甘油相似，廣泛應(yīng)用于軍工、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。孫雷等[2]前期研究在大腸桿菌中過表達(dá)木糖脫氫酶（Xdh）和苯甲酰甲酸脫羧酶（KivD）（圖1），同時弱化葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（PTS）、敲除副產(chǎn)物途徑[3]，使得BT 產(chǎn)量達(dá)到14.5g/L、轉(zhuǎn)化率達(dá)到75%。

圖1 大腸桿菌以木糖為底物代謝合成BT的途徑

上述BT生物合成途徑以木糖為底物，成本高，不利于規(guī)模化生產(chǎn)。玉米芯富含半纖維素，酸水解后獲得大量木糖[4]，但會產(chǎn)生有毒抑制物質(zhì)如糠醛[5]，限制菌株生長和發(fā)酵[6]。Zhao等[7]利用產(chǎn)甘油假絲酵母對纖維素水解液脫毒，再利用大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵獲得了4.7g/L 的BT。此兩步發(fā)酵法耗時長，產(chǎn)量較低。為實現(xiàn)一步法發(fā)酵纖維素水解液生成BT，本研究利用上述重組大腸桿菌進(jìn)行改造以提高其糠醛耐受和生產(chǎn)水平。

在大腸桿菌中存在不同類型的糠醛耐受相關(guān)基因，包括糠醛還原酶YghA 等[8-9]，緩解糠醛脅迫下DNA 損傷的胸苷酸合酶ThyA[10]，參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的天然外排泵蛋白MdtJI[11]以及催化NADH 和NADPH相互轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)氫酶PntAB 等[12]。本研究在BT 合成菌株中過表達(dá)上述四種基因，以改善重組菌對糠醛的耐受能力，提高纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)BT 的水平，為后續(xù)研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

卡那霉素、氯霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、酵母提取物，Oxiod公司；1,2,4-丁三醇，上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；玉米芯粉末，江蘇連云港蘇銳秸稈加工廠；一步法克隆試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶，大連寶生物工程有限公司（Takara）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌株與質(zhì)粒

本研究中所使用的菌株和質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10.0g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨15.0g/L，酵母提取物7.5g/L，氯化鈉15.0g/L，碳酸鈣10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，木糖30.0g/L。

種子培養(yǎng)：從LB 固體平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)12h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：250mL三角瓶中裝液量為50mL，1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量；37℃、200r/min 培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8 時，加入終濃度為0.5mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時加入木糖和葡萄糖。

5L 發(fā)酵罐培養(yǎng)：5L 發(fā)酵罐裝液量為2.5L，將種齡12h 的一級種子液按照1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量轉(zhuǎn)接到二級種子液中，培養(yǎng)8h。二級種子液按照10%（體積分?jǐn)?shù)）接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為30℃，轉(zhuǎn)速設(shè)置400r/min，通氣量為3L/(L·min)，用酸和堿溶液維持pH在7.0左右。

補(bǔ)料培養(yǎng)：在發(fā)酵培養(yǎng)24h后一次性補(bǔ)加濃度為10g/L葡萄糖和30g/L木糖。

1.4 水解液的制備

向60 目的玉米芯粉末中加入2%（體積分?jǐn)?shù)）H2SO4至固液比為1∶10，121℃下蒸煮1h[4]。隨后過濾收集濾液并用堿溶液石灰水調(diào)節(jié)pH 至11.0，進(jìn)一步過濾去除沉淀。最后在50℃下攪拌濃縮[13]，獲得所需濃度的玉米芯纖維素水解液母液，經(jīng)過100℃、30min滅菌后按照培養(yǎng)條件要求加入到培養(yǎng)基中。母液儲存在 -20℃以便后續(xù)使用。

1.5 分析方法

OD600利用分光光度計測定發(fā)酵液在波長600nm下的吸光度。發(fā)酵液中葡萄糖、木糖和BT 用高效液相色譜示差法檢測，流動相為5.0mmol/L H2SO4，流速為0.6mL/min，色譜柱為Aminex HPX-87H，柱溫60℃，進(jìn)樣量為20μL。菌液處理方法為，在8000r/min和4℃條件下離心收集對數(shù)期的菌體，用0.1mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗2 次后重新懸浮，再用超聲破碎儀破碎20min，離心得到的上清液為粗酶液[14]。蛋白濃度通過Bradford 蛋白濃度檢測試劑盒測定。

木糖脫氫酶Xdh 酶活力的測定反應(yīng)體系為100mmol/L 木糖、2mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl（pH=8.1）、1mmol/L NAD(P)+以及100μL粗酶液；Xdh的酶活力定義為每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol/L木糖所需的酶量為1 個酶活力單位。醇脫氫酶YqhD 酶活力的測定反應(yīng)體系為50mmol/L 3-(N-嗎啉)丙磺酸緩沖溶液（pH=7），100mmol/L丁醛，0.25mmol/L NAD(P)H以及100μL粗酶液；YqhD的酶活力定義為每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol/L NAD(P)H所需的酶量為1個酶活力單位[15]。

通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測yjhG和kivD基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。總RNA通過Trizol試劑提取。以RNA 為模板，通過Hiscript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ合成相應(yīng)的cDNA。以cDNA 為模板，使用16S rRNA作為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR。

使用SPSS23 統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢測時選擇ANOVA 和Duncan 檢驗，當(dāng)P＜0.05 時認(rèn)為實驗結(jié)果之間具有顯著性差異，反之則沒有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同重組菌對糠醛的耐受能力

糠醛脅迫下，與對照菌E.coliKXW3009P0 相比，所有糠醛耐受基因的過表達(dá)都能不同程度地提高菌株生物量（圖2），生長的改善使得葡萄糖和木糖的消耗也增加。其中過表達(dá)pntAB的E.coliKXW3009P5的生長和BT合成最具優(yōu)勢，生物量提高了50.3%；BT產(chǎn)量11.0g/L，提高了59.7%。菌株E.coliKXW3009P1、E.coliKXW3009P2 和E.coliKXW3009P3 的生物量分別提升了13.4%、8.1%、18.3%，但BT產(chǎn)量均僅有小幅變化。

圖2 不同重組菌株在0.4g/L糠醛下的發(fā)酵結(jié)果（*P＜0.05）

大腸桿菌自身還原糠醛和丁醛主要依賴于以NADPH為輔因子的YqhD，還原過程與生長競爭還原力[16]。YghA 以NADH 為輔因子，過表達(dá)yghA時加快了糠醛還原并減少NADPH 的消耗[9]，這對于細(xì)胞生長是有利的。同時BT途徑的Xdh、YqhD和KivD 的酶活力或轉(zhuǎn)錄水平均顯著提升（圖3），尤其是關(guān)鍵酶Xdh的酶活力提高了2.1倍，促進(jìn)了BT的合成[17]。

圖3 0.4g/L糠醛下不同重組菌株中關(guān)鍵酶的酶活力與轉(zhuǎn)錄（*P＜0.05，#P＜0.05）

糠醛能造成DNA 損傷，過表達(dá)thyA可促進(jìn)dTTP的合成以加快DNA修復(fù)[10]。外排泵MdtJI能主動從胞內(nèi)將糠醛轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外[11]，因此這兩個基因有助于糠醛脅迫下的菌體生長。但thyA和mdtJI使得BT合成關(guān)鍵酶KivD轉(zhuǎn)錄明顯降低，造成細(xì)胞合成BT能力減弱[17]，單位OD600產(chǎn)量分別下降11.1%和14.5%。

糠醛的還原可能使得胞內(nèi)NADH/NADPH 處于不平衡狀態(tài)，吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶PntAB能將胞內(nèi)更多的NADH 轉(zhuǎn)化為NADPH[18]，來滿足生長和糠醛還原對NADPH 的需求。過表達(dá)PntAB使得Xdh 和YqhD的酶活力分別提高了2.6倍和1.1倍，KivD的轉(zhuǎn)錄也提高了53.0%，進(jìn)而增強(qiáng)了BT的合成效率，使得單位OD600產(chǎn)量提高5.1%。

過表達(dá)yghA和pntAB基因的菌株表現(xiàn)出明顯的糠醛耐受，為探索不同耐受基因與糠醛耐受性的相關(guān)性，將所有菌株在無糠醛壓力下進(jìn)行發(fā)酵（表2）。

所有糠醛耐受基因的過表達(dá)均未明顯提高BT產(chǎn)量，表明這些基因?qū)T 代謝途徑?jīng)]有明顯影響，推測yghA和pntAB基因在糠醛壓力下是通過改善菌株生長進(jìn)而提高糠醛耐受性。

2.2 重組菌利用纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)1,2,4-丁三醇

為考察以上4種基因在纖維素水解液復(fù)雜環(huán)境下的耐受情況，以玉米芯纖維素水解液為底物進(jìn)行發(fā)酵。與對照菌株E.coliKXW3009P0 相比，過表達(dá)yghA、thyA和pntAB的三株菌株在生物量和BT產(chǎn)量上有明顯的提升（圖4，表3），其中過表達(dá)yghA的菌株生物量提高了66.1%，獲得最高的BT產(chǎn)量3.36g/L，木糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到23.4%。隨著生物量的增加，葡萄糖和木糖消耗也均有顯著提升。

表3 不同重組菌株在纖維素水解液中發(fā)酵結(jié)束時的參數(shù)

圖4 不同重組菌株的纖維素水解液發(fā)酵結(jié)果（*P＜0.05，#P＜0.05）

過表達(dá)yghA基因?qū)T途徑酶的酶活力或轉(zhuǎn)錄水平的提高均有利（圖5），獲得最高單位OD600的BT 產(chǎn)量。纖維素水解液中乙酸等復(fù)雜組分會降低大腸桿菌中外源基因的表達(dá)效率[19]，過表達(dá)thyA或pntAB基因時，KivD的轉(zhuǎn)錄水平相對較低，導(dǎo)致單位OD600的BT產(chǎn)量分別下降了17.7%和5.9%。過表達(dá)mdtJI時對大腸桿菌在玉米芯纖維素水解液中的生長與發(fā)酵沒有明顯的改善，這與在0.4g/L糠醛壓力下的發(fā)酵結(jié)果較為相似。

圖5 不同重組菌株纖維素水解液中的關(guān)鍵酶的酶活力與轉(zhuǎn)錄（*P＜0.05，#P＜0.05）

2.3 5L發(fā)酵罐發(fā)酵纖維素水解液生產(chǎn)1,2,4-丁三醇

基于搖瓶發(fā)酵結(jié)果，選擇過表達(dá)yghA基因的E.coliKXW3009P1 進(jìn)行放大培養(yǎng)（圖6）。BT 的合成為生長偶合型[20]，需要進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，通過生物量與葡萄糖濃度的監(jiān)測，選擇在24h 補(bǔ)料。在5L發(fā)酵罐中，與搖瓶相比，生長、糖耗和BT 生產(chǎn)速率都明顯提升，最終BT 產(chǎn)量增加了3.6 倍，達(dá)到15.3g/L，轉(zhuǎn)化率為63.8%，增加了1.7 倍，放大培養(yǎng)后明顯提高了玉米芯纖維素水解液中木糖的利用率。以水解液為底物的5L 發(fā)酵結(jié)果與純化后的木糖發(fā)酵結(jié)果相比，生長更具有優(yōu)勢，糖耗和BT 產(chǎn)量沒有明顯差異，表明水解液中菌株的BT 合成能力受到一定程度的抑制。

圖6 E. coli KXW3009P1菌株以玉米芯纖維素水解液為底物的5L發(fā)酵過程

3 結(jié)論

在大腸桿菌生產(chǎn)BT過程中過表達(dá)yghA、thyA、mdtJI和pntAB這四種基因，均提高了糠醛耐受性。攜帶pntAB的菌株在加入0.4g/L 糠醛的培養(yǎng)基中獲得了最高的BT 產(chǎn)量，然而在玉米芯纖維素水解液中這些菌株的生長與代謝趨勢和在0.4g/L糠醛壓力下存在一些差異，其中過表達(dá)yghA基因的菌株表現(xiàn)出最好的生長與BT 產(chǎn)量，BT 產(chǎn)量達(dá)到3.36g/L。在5L發(fā)酵罐中，過表達(dá)yghA基因促進(jìn)了細(xì)胞生長和對纖維素水解物中木糖的利用，BT 產(chǎn)量達(dá)到15.3g/L。這些結(jié)果為工業(yè)上利用玉米芯纖維素水解物生產(chǎn)BT提供了參考。