張義豪,劉笑彤,徐國峰,王文君,王曉敏,李群,許瑞,杜中玉*

(1.濟寧醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 濟寧 272067;2.兗州區(qū)實驗高級中學(xué),山東 濟寧 272100)

微乳液,在1943年首次由Hoar和Schulman發(fā)現(xiàn),是一種由表面活性劑、助表面活性劑、油與水等組分在合適比例下組成的無色、低黏度的,溶液中粒徑在10～100 nm的體系,表現(xiàn)為透明和半透明狀,是熱力學(xué)穩(wěn)定體系。1959年由英國化學(xué)家Schulman首次將上述體系稱為微乳狀液或微乳液。

自微乳液發(fā)現(xiàn)后,圍繞著它提出了多個理論,在Schulman和Prince等的混合膜理論、Schulman和Bowcott等的雙層膜理論、Robbins、Mitchell和Ninham等人的幾何排列理論和R比理論。在這幾個的理論中,Winsor等發(fā)展的R比理論更加完善,更被認(rèn)可。通過R比理論可以將微乳液分為四種類型。R比理論以分子間相互作用力為基礎(chǔ),認(rèn)為微乳液各組分之間必然存在著相互作用力,各個相互作用力之間疊加的最后決定了膜的性質(zhì),由此可用Aco表示油與表面活性劑之間的內(nèi)聚能,表面活性劑之間的內(nèi)聚能用Acw來表示,用AⅡ表示表面活性劑親油基之間的內(nèi)聚能,將Ahh定義為表面活性劑親水基之間的內(nèi)聚能,而Aoo則為油分子之間的內(nèi)聚能,Aww為水分子之間的內(nèi)聚能。由此定義,R=(Aco-Aoo-AⅡ)/(Acw-Aww-Ahh),并由公式可得,當(dāng)R<1時,會形成水包油型微乳液,即為WinsorⅠ型,當(dāng)R≈1時,會形成雙連續(xù)型微乳液,微乳液為WinsorⅢ型,當(dāng)R>1時,形成的油包水型微乳液類型為WinsorⅡ型,而當(dāng)表面活性劑合適時,會形成單相體系的特殊形式的WinsorⅢ型微乳液,并將之命名Wirier Ⅳ型微乳液[1]。

微乳液的理論和應(yīng)用發(fā)展極為迅速,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于洗滌去污、催化、化學(xué)反應(yīng)介質(zhì)和藥物傳遞等領(lǐng)域中。而酶參與的催化反應(yīng)一直是生物學(xué)與化學(xué)交叉研究的重要領(lǐng)域,在酶催化的反應(yīng)體系中如何保持和提高酶的活性是關(guān)鍵,而酶的活性又被反應(yīng)介質(zhì)和反應(yīng)時的微環(huán)境影響,因此尋找能夠更好地保持和提高酶活性的微環(huán)境和介質(zhì)一直是科研工作中的重點[2]。而WinsorⅡ型微乳液,即油包水型微乳液(W/O)其大的界面積、底物溶解性的增強和能在分子水平上分散酶等特點都有利于酶催化反應(yīng)的進行,而且由于界面膜的存在使得酶的活性得到了保障。

1 微乳液中的酶催化酯化反應(yīng)

酶是具有高效和特異催化作用的蛋白質(zhì)。催化劑只會加速化學(xué)反應(yīng)達到平衡點,但不會改變平衡點。酶也是如此,但與非酶催化劑相比,酶具有極高的催化效率;此外,酶僅催化特定物質(zhì)的某些化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生一定產(chǎn)物而不產(chǎn)生副產(chǎn)物,即酶具有極高的特異性。酶的催化能力稱為酶活性,酶量的多少可以測量酶的活性。同時,酶的活性受各種環(huán)境條件影響。

酯化方法是羧酸和醇在少量無機酸存在下加熱而轉(zhuǎn)化成酯的有機合成方法。常用的無機酸有濃硫酸和干燥的氯化氫等。酯化反應(yīng)一般反應(yīng)過程長,反應(yīng)副產(chǎn)物多,且反應(yīng)為可逆反應(yīng),故需要酶催化以加快反應(yīng)進程,控制反應(yīng)產(chǎn)物,促進反應(yīng)向目標(biāo)產(chǎn)物方向進行。酯化反應(yīng)的速率受多種因素的影響,在微乳液酶催化酯化反應(yīng)當(dāng)中,除環(huán)境因素外,表面活性劑的選擇也是重要影響因素。

1.1 不同表面活性劑對微乳液中酯化反應(yīng)的影響

酯化反應(yīng)是微乳液中重要的化學(xué)反應(yīng)之一,而不同表面活性劑對微乳液中酯化反應(yīng)的影響不盡相同。微乳液中酶催化所用活性劑分為陽離子型、陰離子型、兩性型和非離子型表面活性劑。其中大多數(shù)酶促反應(yīng)在雙(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)表面活性劑應(yīng)穩(wěn)定的微乳液中進行,李干佐等人[3]就曾研究了CTAB/異辛烷/正戊醇/緩沖溶液中糖化酶催化淀粉的水解反應(yīng)。研究顯示其最大反應(yīng)速率和米氏常數(shù)比起在水溶液分別提高了近6倍和3倍。Han等人[4]則用DBSA作為表面活性劑,建立DBSA/環(huán)己烷微乳液體系,并用圓柱假絲酵母脂肪酶(Ccl)催化乙醇與乙酸作為酯化反應(yīng)模型,與AOT/環(huán)己烷微乳液體系進行比較。研究表明在DBSA體系中酯化反應(yīng)速率及轉(zhuǎn)化率大于AOT體系。其原因在于DBSA具有雙重功能,即表面活性劑和酸催化劑,二者的協(xié)同作用使DBSA體系有更高的反應(yīng)速率。近年來,反膠束的形成也成了人們研究的熱點。Zheng等人[5]研究合成了一種Bronsted酸性-表面活性劑復(fù)合離子液體,3-(N,N-二甲基十二烷基銨)丙磺酸硫酸氫([SB3-12][HSO4]),它具有疏水尾部、親水陽離子和Bronsted酸性反離子[SB3-12][HSO4],在油酸和乙醇的混合物中形成反膠束,促進酯化反應(yīng)。其形成的反膠束具有親水性,因此反應(yīng)過程中產(chǎn)生的產(chǎn)物酯可有效的排除在反膠束以外,反應(yīng)生成的水可以自動進入到反膠束,并且[SB3-12][HSO4]的自聚集會使酸性催化劑在反膠束界面集中。反膠束可以增強酯化反應(yīng)和微分離器自動分離反應(yīng)過程中產(chǎn)生的水和油酸乙酯,有利于酯的形成。油酸乙酯中水的分離既阻止了油酸乙酯的水解,又迅速促進平衡向產(chǎn)物油酸乙酯轉(zhuǎn)移。此外,相較于前文提到的DBSA體系,該催化劑的高催化活性以及易于重復(fù)利用性,使其更加高效環(huán)保的應(yīng)用于油酸乙酯的合成。表面活性劑對微乳液中酯化反應(yīng)速率的提高還受溫度、pH值、反應(yīng)時間、反應(yīng)物用量等影響。因此,在適宜的溫度、pH值等條件下選擇合適的緩沖體系和活化劑,對微乳液中的酯化反應(yīng)具有重要意義。

1.2 內(nèi)部“水池”環(huán)境對于酶活性的影響

1.2.1 水池大小對酶活性的影響

油包水微乳液具有一定大小的“水池”,含水量大小常以水與表面活性劑物質(zhì)的量比ω0表示,即ω0=[H2O]/[SAA]。多項研究表明,每種酶在固定的反應(yīng)體系中都有一個最適的“水池”大小值,當(dāng)ω0很小或者較大時均會導(dǎo)致酶的活性降低。周國偉等人[6]在烷基聚葡糖苷微乳液中脂肪酶催化的酯合成反應(yīng)動力學(xué)研究中表明,當(dāng)烷基聚葡糖苷濃度增大時反應(yīng)初始速率v0反而有所減小,這可能是因為隨烷基聚葡糖苷濃度增大,體系中微乳液“水池”的總體積增大,酶的濃度減小、流動性增大,引起酶的增溶位置及活化構(gòu)象發(fā)生某種變化,從而導(dǎo)致反應(yīng)初始速率v0減小。此外,底物濃度下降也是酶活力降低的因素之一。當(dāng)ω0較小時,酶的活力相對較低,可能是由于不能滿足酶分子周圍需要的一層必須水,而影響了酶活化構(gòu)象的形成。

1.2.2 pH值對酶活性的影響

酶催化反應(yīng)的重要特性之一是對微乳液微環(huán)境的pH值極其敏感,酶表面的電荷密度隨pH值的變化而變化,從而導(dǎo)致酶與表面活性劑頭基的相互作用產(chǎn)生變化。最適pH值的選擇與酶種類、反應(yīng)類型有關(guān)。最適pH值的微小偏離可使酶活性部位的基團離子化發(fā)生變化而降低酶的活性;較大偏離時,維護酶三維結(jié)構(gòu)的許多非共價鍵受到干擾,導(dǎo)致酶蛋白的變性。

Kriegera等人[7]在AOT/異辛烷反膠束中,分別加入不同的緩沖溶液,研究PCL催化三油酸甘油酯的水解反應(yīng)。緩沖溶液分別為乙酸鹽(pH值=4.0～5.5)、磷酸鹽(pH值=6.0～8.0)和Tris-HCl(pH值=8.0～9.0)。研究表明,酶的活力與pH值的大小呈鐘形曲線,在pH值=8時酶的活性最大。同時研究還發(fā)現(xiàn),不同的緩沖液對于酶的活性也有影響。該反應(yīng)在磷酸鹽溶液中酶的活力相較于在Tris-HCl緩沖液中更強。

2 水包油包水的穩(wěn)定性研究

水包油包水(W/O/W)的最內(nèi)部由單一水相W1組成,隨后被較大油滴包裹,形成油/水乳液,該乳液再次分散到另一個水相中,從而形成了一個比較復(fù)雜的多相系統(tǒng)。由于其獨特的多組分結(jié)構(gòu),它們應(yīng)用范圍很廣,且具有很大的應(yīng)用潛力。其中水在油滴中保持對于這些應(yīng)用來說至關(guān)重要,但是,這種系統(tǒng)非常不穩(wěn)定,可能會發(fā)生內(nèi)部水滴之間的聚結(jié)、外部油滴之間的聚結(jié),內(nèi)部水滴和外部水相之間的聚結(jié)及擴散等,應(yīng)用起來具有挑戰(zhàn)性,比一般簡單的單相乳液困難得多。因此研究其內(nèi)部WO乳液的結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性尤為關(guān)鍵。

2.1 內(nèi)部WO乳液分散水相的平均液滴直徑對微乳液平衡的影響

內(nèi)相的液滴尺寸分布(W1)有著至關(guān)重要的作用,影響微乳化液的產(chǎn)品性能和平衡。不同粒徑分布的穩(wěn)定乳液主要取決于內(nèi)部W1/O的處理參數(shù),利用PFG-NMR測量內(nèi)相(W1)的液滴尺寸分布和O相的表征,研究表明內(nèi)部WO乳液分散水相的平均液滴直徑小,可使油滴內(nèi)部水相均勻分布,從而增加與外水相聚結(jié)的穩(wěn)定性[8-9]。當(dāng)直徑足夠小(<1 mm)時,才能更好的適應(yīng)液中典型尺寸的油滴[10-11]。

2.2 滲透活性物質(zhì)的加入對微乳液穩(wěn)定性的影響

滲透活性物質(zhì)(OAS)在乳液中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Neumann等[12]以氯化鈉、氯化鈣和葡萄糖作為OAS,聚甘油-聚蓖麻油酸酯為親脂性乳化劑制備了WO乳液,通過測量界面特性和乳液黏度來評估液滴的穩(wěn)定效果。實驗指出OAS不影響油相張力,也不影響乳液黏度,用于內(nèi)部水滴,來限制乳液中水相之間的擴散過程,也可以通過影響內(nèi)部乳液的結(jié)構(gòu),添加到內(nèi)部水相的滲透活性物質(zhì),如某些電解質(zhì),會改變吸引力,從而減小水滴直徑,來增加微乳液的穩(wěn)定性,但必須使用足量的OAS來限制擴散引起的液滴成熟。據(jù)Ficheux[13]和Pays[14]等人研究表明OAS可以平衡拉普拉斯壓力帶來差異,以及可能會改善基于拉普拉斯壓力的差異所帶來的效應(yīng)即內(nèi)水相與外油相液滴聚合而導(dǎo)致平均液滴直徑增加,乳液破裂,內(nèi)部水相損失,出現(xiàn)典型的液結(jié)構(gòu)的損失。

2.3 內(nèi)部滲透壓力對微乳液穩(wěn)定性的影響

內(nèi)部水相與外水相之間的滲透壓力梯度可以導(dǎo)致水分子的擴散,當(dāng)內(nèi)部W1的溶質(zhì)濃度高于外部W2的溶質(zhì)濃度時,會使水分子進入內(nèi)部水滴存在驅(qū)動力,使內(nèi)部的水滴膨脹,反之,會使內(nèi)部水相收縮[15]。通過向內(nèi)部分散相中添加溶質(zhì),利用滲透壓梯度來抵消拉普拉斯壓力,來提高穩(wěn)定性。但同時,也需要在外部水相加入少量溶質(zhì),雙重作用使其產(chǎn)生更穩(wěn)定的多相乳液,但微乳液被不含鹽的緩沖液稀釋后,W2溶質(zhì)濃度遠遠小于W1,這將導(dǎo)致水分子從外水相運動到內(nèi)水相,使內(nèi)部發(fā)生膨脹[16]。

2.4 內(nèi)部分散的液滴凝膠化對微乳液穩(wěn)定性的影響

內(nèi)相液滴凝膠化可以利用球狀蛋白加熱至其熱變性溫度來發(fā)生,加熱后,W1中的球狀蛋白展開,通過疏水鍵和二硫鍵相互聚集來提高系統(tǒng)的黏性和凝膠強度[17-18]。將內(nèi)部水相(W1)含有20%乳清蛋白分離物(WPI)的緩沖溶液(pH值7,250 mmol/L氯化鈉)制成W1/O/W2的微乳液,對其進行不同程度稀釋和熱處理,使W1的球狀蛋白熱凝膠化,使疏水性增加,進而導(dǎo)致系統(tǒng)黏度增加,穩(wěn)定性提高。Iqbal等人[17-18]對內(nèi)部分散相進行熱變性,使其凝膠化,通過觀察不同溫度對微乳液W1/O/W2復(fù)合剪切模量的影響,指出流變變化是熱不可逆的,并將其歸因于WPI內(nèi)球狀蛋白的不可逆熱性,球狀蛋白經(jīng)歷了熱凝膠化后,疏水性增加,使其在油滴之間形成聯(lián)系,使系統(tǒng)黏度增加,同時影響多種乳液的穩(wěn)定性。

2.5 乳化劑對微乳液穩(wěn)定性的影響

許多研究小組研究了不同乳化劑的類型和濃度對液穩(wěn)定性的影響,短鏈乳化劑有被證明從一個水相擴散到另一個水相,它們進入W/O/W液的內(nèi)部水滴中會破壞液滴的穩(wěn)定性,而生物聚合物如蛋白質(zhì)和親水膠體被假設(shè)有更好的穩(wěn)定性能乳液,因為它不大可能擴散通過油膜并進入內(nèi)部水滴,所以與短鏈乳化劑相比,大分子乳化劑甚至穩(wěn)定劑更適合穩(wěn)定液[14,19]。生物聚合物主要通過增加內(nèi)外水相的黏度或凝膠程度等多種機制來提高乳液的穩(wěn)定性[20-21]。它在微乳液中起到雙重作用,既可以作為功能成分,減少有關(guān)此類配方中合成微乳劑的使用;也可以作為穩(wěn)定成分,其不易從內(nèi)外水相遷移和擴散,且可以在分散和連接的水相中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),使黏性提高,表面活性生物聚合物還可以作為黑白乳化液滴外油水界面的有效穩(wěn)定成分。

3 微乳液發(fā)展展望

不同微乳液體系已經(jīng)被廣泛研究,在微乳液中各種酶催化反應(yīng)也成為重要研究對象,對于酶催化反應(yīng)的研究大多數(shù)是在改變微乳液內(nèi)部水相的內(nèi)部環(huán)境或者不同的表面活性劑、溶劑和助表面活性劑來提高酶催化反應(yīng)速率。而目前新型的水包油包水(W/O/W)在不同的工業(yè)領(lǐng)域作為封裝系統(tǒng)或在食品工業(yè)中作為潛在脂肪替代品起到關(guān)鍵作用。微乳液的研究趨近成熟,如何更好地應(yīng)用將成為關(guān)鍵。微乳液的內(nèi)部環(huán)境可以用來模擬細胞內(nèi)環(huán)境,希望在應(yīng)用于工業(yè)封裝、食品生產(chǎn)等領(lǐng)域的同時,未來研究應(yīng)集中于研究更加穩(wěn)定的制備方法和增強其長期穩(wěn)定性的技術(shù),使其內(nèi)部可以發(fā)生更加復(fù)雜反應(yīng),為生物化學(xué)反應(yīng)、藥物合成反應(yīng)提供更加廣泛的應(yīng)用前景,為醫(yī)學(xué)發(fā)展、人類健康作出貢獻。