孫琦琦 朱帥 阮小嬌 張水鋒 盛華棟

石斛作為蘭科植物的一大屬，具有不俗的養(yǎng)生保健及藥用價值，近年來市面上也出現(xiàn)許多以石斛為原料的石斛原漿飲品。石斛多糖作為其重要的生物活性物質，主要由甘露糖及葡萄糖通過糖苷鍵結合形成。甘露糖是石斛多糖的重要組成成分及質量評價指標，具有調解免疫系統(tǒng)、抑制腫瘤生長及轉移等生理效應。因此，通過測定石斛原漿飲品中甘露糖含量可以進一步提升對石斛原漿飲品的質量指標把控。石斛原漿飲品中的甘露糖通常以葡甘露聚糖的形式存在，因此要將樣品中的葡甘露聚糖先提取純化后，再將其中的甘露糖解離為游離態(tài)后進行測定。

目前，對石斛或石斛原漿飲品中甘露糖的測定方法多參考《中國藥典（2020版）》，采用水提醇沉提取，鹽酸水解多糖，柱前衍生化高效液相色譜法測定。雖然這種方法能夠檢測出樣品中甘露糖的含量，但卻存在操作繁瑣、時效性不強等缺點。本文基于高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）， 建立了一種非衍生直接測定石斛原漿飲品中水解甘露糖含量的方法，具有線性關系好、穩(wěn)定性好、回收率高、測定結果準確等優(yōu)點。

一、儀器與試劑

1.實驗儀器。LC-20A液相色譜儀（日本島津公司）；Alltech 3300 ELSD蒸發(fā)光散射檢測器（美國奧泰公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；MS 105 DU電子天平（梅特勒-托利多集團）；電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；烘箱（德國BINDER公司）；QT-1渦旋混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；ST 16R高速離心機（賽默飛世爾科技有限公司）。

2.實驗試劑。無水乙醇（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）； 鹽酸（分析純，杭州雙林化工試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，西隴科學股份有限公司）；氨水（分析純，無錫展望化工試劑有限公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）。

實驗用水為一級水；實驗用石斛原漿飲品購置于杭州某超市。

二、實驗與方法

1.標準溶液配置。（1）甘露糖標準儲備液（濃度為10mg/mL）：準確稱取100.00mg（精確至0.01mg）甘露糖標準品，用水溶解，轉移至10mL容量瓶中，用水定容，混勻，甘露糖濃度為10mg/mL，于4℃保存。

（2）甘露糖系列標準工作液：分別吸取甘露糖標準儲備液0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mL于10mL容量瓶中，用水定容，混勻，甘露糖系列標準工作液濃度分別為20、50、100、200、500、1000mg/L。

2.樣品制備。（1）純化：準確移取5mL均勻樣品于50mL離心管中，加入40mL無水乙醇，渦旋混勻并于-18℃下放置20min。取出后于高速離心機中以6000r/min離心5min，棄去上清液，向沉淀中加入80%乙醇水溶液45mL，重復上述純化步驟2次。

（2）提?。簩⒓兓幚砗蟮臍堅?01℃烘箱中徹底干燥（2h以上），精密加入10mL水，渦旋混勻，置于100℃水浴提取30min，取出后放冷，并以6000r/min離心5min，收集上清液。

（3）水解：準確吸取5mL上述離心后的上清液于10mL比色管中，加入3mol/L鹽酸溶液2mL，蓋上塞子后渦旋混勻，并于100℃水浴中水解1h。取出后放冷， 用5mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH至7.0，轉移至10mL容量瓶并用水定容至刻度，混勻，過0.22μm濾膜，待上機測定。

3.色譜條件。XBridge Amide色譜柱（250mm×4.6mm，3.5μm）；流動相為0.1%氨水乙腈溶液-0.1%氨水水溶液（80：20）；流速：1.0mg/min；柱溫：40℃；進樣量：20μL；漂移管溫度：50℃；載氣流速：1.5L/min。

4.結果計算。按照下方公式計算樣品中甘露糖含量：

上式中，X為試樣中甘露糖的含量，mg/mL；C為試樣溶液中甘露糖的質量濃度，mg/L；V為定容體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為試樣稱樣量，g；1000是指換算系數(shù)。

三、結果與分析

1.色譜條件優(yōu)化。本實驗探究不同流動相組成對目標化合物分離程度及色譜峰型的影響，分別采用乙腈-水體系及0.1%氨水乙腈溶液-0.1%氨水水溶液體系對目標物進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，兩種流動相體系都可以達到將目標化合物完全分離的效果，但采用乙腈-水體系進行分析時，色譜峰型表現(xiàn)不理想，而后者能夠得到較好的色譜峰型，故最終采用0.1%氨水乙腈溶液-0.1%氨水水溶液的流動相體系。

2.標準工作曲線、檢出限、定量限。將配置好的甘露糖系列標準工作液注入蒸發(fā)光高效液相色譜（HPLC-ELSD）儀進行檢測，以甘露糖系列標準工作液響應峰面積的自然對數(shù)為縱坐標Y，其濃度的自然對數(shù)為橫坐標X，得到此標準曲線的線性回歸方程為Y=1.3446X+7.6299（圖1），線性范圍為20mg/L-1000mg/L，相關系數(shù)R2=0.9999。當甘露糖的添加濃度為0.02mg/mL時，測得的色譜峰信噪比約為3，當甘露糖的添加濃度為0.04mg/mL時， 測得的色譜峰信噪比約為10。由此得出，本方法中甘露糖的檢出限為0.02mg/mL，定量限為0.04mg/mL。

3.回收率、精密度。對經(jīng)過純化處理的樣品進行3個水平（分別為0.160、0.800、3.200mg/mL）的加標回收測試，每個水平分別測定6次，計算回收率和相對標準偏差，結果見表1。由表1可知，3個水平的回收率在87.5%-101.1%，相對標準偏差（RSD）在1.33%-2.31%。

4.石斛原漿樣品中甘露糖的含量。對3種市售石斛原漿樣品中甘露糖的含量進行測定，結果如表2所示。

四、結論

與現(xiàn)有方法相比，通過無水乙醇純化，純水提取后鹽酸水解并采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）技術測定石斛原漿飲品中甘露糖的含量，有效解決了甘露糖無特征發(fā)光發(fā)色基團的問題，省去回流、衍生等繁瑣步驟，具有良好的線性范圍、較低的檢出限、較高的精密度，適用于石斛原漿飲品中甘露糖含量的測定。