翟怡 龐艷莉

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是育齡期婦女最常見(jiàn)的生殖內(nèi)分泌疾病,患病率高達(dá)7.8%[1],常伴胰島素抵抗、糖尿病、心血管疾病、肥胖、子宮內(nèi)膜癌等并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)不一,但高雄激素血癥一直被視為PCOS的重要特征,在PCOS的發(fā)病機(jī)制研究中,也存在將PCOS視為卵巢源性高雄激素血癥的觀點(diǎn)[2],表明其在PCOS發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵地位。然而,雄激素和相關(guān)信號(hào)在PCOS及其相關(guān)并發(fā)癥中的實(shí)際作用尚未明確。

卵巢雄激素在膜細(xì)胞中生成,雄激素過(guò)量會(huì)對(duì)顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞產(chǎn)生不良影響,阻礙卵泡發(fā)育,導(dǎo)致排卵和卵母細(xì)胞成熟障礙、月經(jīng)紊亂[3-4]。全身性的高雄激素血癥會(huì)引起多毛和痤瘡,加重其糖脂代謝和激素代謝紊亂,同時(shí)也被這些代謝異常進(jìn)一步惡化[5]。因此,研究高雄激素環(huán)境下顆粒細(xì)胞的生物學(xué)功能改變對(duì)揭示PCOS發(fā)病分子機(jī)制,厘清高雄激素和PCOS其他并發(fā)癥之間的因果關(guān)系,提供治療靶點(diǎn)意義重大。

顆粒細(xì)胞在排卵和卵成熟過(guò)程中扮演重要角色,既往研究對(duì)顆粒細(xì)胞功能障礙的機(jī)制篩選多局限在PCOS女性與對(duì)照受試者顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組之間的對(duì)比[6-8],缺乏關(guān)于雄激素對(duì)顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組影響的研究,不利于探討卵巢局部雄激素過(guò)量這一因素本身如何影響卵巢功能。本研究通過(guò)對(duì)比體外高雄激素與非高雄激素環(huán)境下小鼠顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息,旨在對(duì)高雄損害卵巢顆粒細(xì)胞功能的分子機(jī)制進(jìn)行全面篩查和討論。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)3 周齡C57/BL6 J健康雌鼠,購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心,實(shí)驗(yàn)方案獲得北京大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

二、方法

1. 小鼠顆粒細(xì)胞獲取及培養(yǎng):取材前48 h對(duì)小鼠行5～10 IU PMSG腹腔注射以促進(jìn)卵泡發(fā)育。取材時(shí)斷頸處死小鼠,取雙卵巢經(jīng)PBS清洗后轉(zhuǎn)移到37℃的M2培養(yǎng)基中,體式鏡下刺破卵泡,排出顆粒細(xì)胞?？谖苁占w粒細(xì)胞后25℃ 2 000 rpm離心5 min. 棄上清,用PBS重懸洗1～2 次后加入含10% FBS和1% P/S的DMEM/F12培養(yǎng)基,將細(xì)胞接種至12孔板中,8～12 h貼壁后換液,DHEA組加10 μM DHEA處理6 h,對(duì)照組加入等量DMSO。

2. 總RNA提取:棄去原培養(yǎng)基,PBS清洗1～2 次后Trizol法提取RNA。

3. 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序:RNA質(zhì)檢合格后取1 μg構(gòu)建文庫(kù)。使用Oligo(dT)珠子分離poly(A) mRNA,在二價(jià)陽(yáng)離子和高溫條件下進(jìn)行mRNA片段化。采用隨機(jī)引物合成了第一鏈和第二鏈cDNA。純化雙鏈cDNA后修復(fù)兩端,連接一個(gè)dA尾,用T-A連接以在兩端添加接頭序列。然后使用DNA清潔珠子對(duì)接頭序列連接的DNA進(jìn)行大小選擇。采用P5和P7引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。然后,將具有不同索引的文庫(kù)多路復(fù)用,在Illumina HiSeq/ Illumina NovaSeq/ MGI2000儀器上,根據(jù)制造商的說(shuō)明,使用2x150雙端(PE)配置進(jìn)行測(cè)序。

4. 數(shù)據(jù)分析:主成分分析用R(Version 3.0.3) ggplot2包分析繪制。差異表達(dá)分析用DESeq2 Bioconductor包,多重假設(shè)檢驗(yàn)校正后的Padj<0.05被視為有顯著差異。GOSeq(v1.34.1)用于識(shí)別基因本體(gene ontology, GO)術(shù)語(yǔ),注釋顯著富集的基因。京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encylopaedia of Genes and Genomes, KEGG)是一個(gè)涉及基因組、生物途徑、疾病、藥物和化學(xué)物質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)集合(http://en.wikipedia.org/wiki/KEGG)。本研究使用其中的腳本在KEGG通路中富集顯著差異表達(dá)基因。GSEA分析借助GSEA數(shù)據(jù)庫(kù)完成(http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp),參考hallmark基因集,對(duì)通路內(nèi)有標(biāo)識(shí)的基因使用加權(quán)法計(jì)算富集分?jǐn)?shù)(enrichment score, ES),標(biāo)準(zhǔn)化后得到標(biāo)準(zhǔn)化的富集分?jǐn)?shù)(normalized enrichment score, NES);通過(guò)計(jì)算錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR) 控制假陽(yáng)性率。富集結(jié)果滿足FDR<0.25,P<0.05且|NES|>1表示結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、主成分分析和基因差異表達(dá)分析

主成分分析(principal component analysis, PCA)可以降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜性,深入挖掘樣品之間關(guān)系和變異大小,展示樣本間的聚類關(guān)系。在兩組小鼠顆粒細(xì)胞的主成分分析中,可以看到在組內(nèi)差異不大的情況下,兩組樣品明顯地聚為兩類(N=3),表明數(shù)據(jù)重復(fù)性良好。見(jiàn)圖1。

圖1 3D主成分分析Figure 1 3D principal component analysis

對(duì)兩組樣品基因表達(dá)情況按差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)(Fold Change≥2且q value(FDR, Padj)≤0.05)進(jìn)行篩選,可發(fā)現(xiàn)DHEA處理組的顆粒細(xì)胞相較于對(duì)照組有355 個(gè)基因顯著下調(diào)(圖2中用藍(lán)色標(biāo)記的點(diǎn)),577 個(gè)基因顯著上調(diào)(圖2中用紅色標(biāo)記的點(diǎn)),組間差異明顯(圖2),說(shuō)明DHEA處理對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞基因表達(dá)產(chǎn)生了廣泛影響。

圖2 差異基因火山圖Figure 2 Volcano map of differential genes

二、GO和KEGG富集分析

為探究這些表達(dá)差異基因的生物學(xué)功能,本研究對(duì)表達(dá)差異具有顯著性的基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。GO將基因功能分為分子功能(molecular function, MF)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)、參與的生物過(guò)程(biological process, BP)三類,從這三個(gè)角度說(shuō)明兩組樣本間有顯著差異的基因影響了細(xì)胞中什么位置的哪些細(xì)胞功能。MF富集最顯著的GO條目依次是:蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚體活性、蛋白質(zhì)激酶結(jié)合、微管結(jié)合、激素活性、谷硫酮轉(zhuǎn)移酶活性、配體激活的序列特異性DNA結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、谷胱甘肽結(jié)合。CC富集最顯著的GO條目依次是:膜的整體成分、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)域、神經(jīng)元細(xì)胞體、細(xì)胞表面、細(xì)胞骨骼、頂端質(zhì)膜、蛋白樣細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜外側(cè)、結(jié)合珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物。BP富集最顯著的GO條目依次是:細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡過(guò)程的正向調(diào)節(jié)、有絲分裂、蛋白激酶B信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)、對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)、氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝過(guò)程、異種分解代謝過(guò)程、睪酮生物合成過(guò)程、細(xì)胞外基質(zhì)成分分泌的正向調(diào)節(jié)。見(jiàn)圖3。

圖3 富集程度前30的GO條目Figure 3 The top 30 enriched GO items

對(duì)DHEA組和對(duì)照組表達(dá)差異具有顯著性的基因進(jìn)行KEGG通路分析,可以了解兩組樣本間表達(dá)差異顯著的基因分布在哪些通路相關(guān)的基因集中。如圖4所示,KEGG分析結(jié)果富集到過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPAR)信號(hào)通路、腎素分泌、細(xì)胞色素P450藥物代謝、谷胱甘肽代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸生物合成、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素生物合成、在癌癥中的通路、胰島素抵抗、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)信號(hào)通路等。

圖4 富集最顯著的KEGG通路Figure 4 The most significantly enriched KEGG pathways

三、GSEA分析

GO與KEGG一方面僅僅富集FoldChange與p value同時(shí)變化顯著的基因,可能漏掉變化倍數(shù)不大但功能重要的基因;另一方面只能指出哪些通路變化顯著,不能回答通路具體是被激活還是被抑制的問(wèn)題。而基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)不預(yù)先在表達(dá)差異顯著的基礎(chǔ)上對(duì)基因進(jìn)行過(guò)濾,作為GO和KEGG的補(bǔ)充能更全面地對(duì)比兩組樣本間通路的抑制激活情況。

與對(duì)照組相比,DHEA組中激活最顯著的14 個(gè)基因集如表1所示,其中E2F轉(zhuǎn)錄因子靶點(diǎn)通路,G2M檢查點(diǎn),MYC靶基因V2,MYC靶基因V1,MTORC1信號(hào),未折疊蛋白響應(yīng)富集最顯著(FDR q value<0.25)。其次是有絲分裂紡錘體,活性氧途徑,膽固醇平衡,血紅素代謝,雄激素響應(yīng),晚期雌激素反應(yīng),早期雌激素反應(yīng)和氧化磷酸化(NOM p value<0.25),說(shuō)明DHEA激活了小鼠顆粒細(xì)胞中的這些生物學(xué)活動(dòng)。而在對(duì)照組中顯著富集的基因集只有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(表2),即DHEA抑制了小鼠顆粒細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

表1 DHEA組中顯著富集的基因集Table 1 Gene sets significantly enriched in phenotype DHEA

表2 Control組中富集到的GSEA基因集Table 2 Gene sets enriched in phenotype Control

討 論

一、顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵巢功能障礙

在PCOS模型中,隨著卵泡發(fā)育至竇卵泡階段,顆粒細(xì)胞凋亡率逐漸增加,大量卵泡發(fā)育停滯不前,形成卵巢多囊樣改變。顆粒細(xì)胞通過(guò)縫隙連接與卵母細(xì)胞緊密聯(lián)系[9],其凋亡還會(huì)影響卵母細(xì)胞成熟[10]。卵巢雄激素過(guò)量對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用逐漸受到認(rèn)可[11]。在本研究中,KEGG顯著富集到的癌癥中的通路,以及GSEA分析中被顯著激活的E2F靶點(diǎn)通路,G2M檢查點(diǎn),MYC靶基因V2,MYC靶基因V1也都指向了DHEA影響顆粒細(xì)胞的機(jī)制與凋亡有關(guān)。E2F主要以細(xì)胞周期依賴性的方式調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、凋亡和分化相關(guān)的幾個(gè)基因的表達(dá)[12-13]。由原癌基因c-MYC編碼的MYC是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子,高 MYC水平可引發(fā)細(xì)胞凋亡[14],而卵巢組織中c-MYC的表達(dá)降低有利于改善小鼠的PCOS表型[15]。當(dāng)前對(duì)PCOS顆粒細(xì)胞凋亡引發(fā)機(jī)制的研究多集中在自噬方面[16],而本研究的測(cè)序結(jié)果則主要強(qiáng)調(diào)了氧化應(yīng)激與炎癥在其中的作用。

二、氧化應(yīng)激與炎癥引發(fā)顆粒細(xì)胞凋亡

PCOS患者卵巢局部存在慢性低度炎癥狀態(tài),影響正常卵巢功能[17]。同時(shí)PCOS患者表現(xiàn)出明顯的氧化應(yīng)激,有研究表明高雄誘導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)生可能是這其中的原因[18]。氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)在PCOS的發(fā)病過(guò)程中同為病因,互為因果。在本研究中,GO和KEGG富集結(jié)果顯示PPAR信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝、精氨酸生物合成、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素生物合成、cAMP信號(hào)通路在DHEA處理后發(fā)生了顯著變化。GSEA提示DHEA激活了小鼠顆粒細(xì)胞中的mTORC1信號(hào),未折疊蛋白響應(yīng)、活性氧途徑、氧化磷酸化;抑制了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上述生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路均與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān),強(qiáng)調(diào)了氧化應(yīng)激和炎癥在高雄激素引起顆粒細(xì)胞功能損傷中的重要作用。

PPAR作為核激素受體,其中的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)不僅與PCOS患者中降低的IL-7,升高的IL-1β,IL-6和TNFα水平有直接關(guān)聯(lián)[19],被激活后還可改善高雄激素型PCOS患者的代謝和生殖表型[20]。谷胱甘肽作為體內(nèi)重要的抗氧化劑,能保護(hù)人體免受自由基和促氧化劑的傷害,參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊和細(xì)胞凋亡[21]。過(guò)量的雄激素可能通過(guò)影響谷胱甘肽來(lái)促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡,誘發(fā)卵泡過(guò)早閉鎖[22],這與本研究中GO和KEGG的提示相吻合。精氨酸在甲基化過(guò)程中發(fā)揮重要作用,參與精氨酸合成過(guò)程的9 種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶可通過(guò)廣泛途徑參與氧化應(yīng)激和炎癥[23]。目前的研究表明,PCOS患者的精氨酸代謝可能受到影響,但可能由于樣本大小或患者特征的不同,對(duì)PCOS患者精氨酸代謝變化及作用的研究結(jié)論多有齟齬,需要更多的大樣本研究驗(yàn)證[24-26]。cAMP是最通用的細(xì)胞第二信使之一,調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子和粒細(xì)胞招募,控制粒細(xì)胞凋亡和吞噬作用[27]。上述通路在本研究中雖被GO或KEGG富集,卻未在GSEA分析中表現(xiàn)出明顯的激活或抑制趨勢(shì),因此只能說(shuō)明它們?cè)赑COS中確實(shí)發(fā)生了變化,但具體變化趨勢(shì)還不能明確。

mTORC1 與mTORC2同屬絲氨酸/硫氨酸激酶,有研究報(bào)道m(xù)TORC1在PCOS中被顯著激活[28],這與本研究中的發(fā)現(xiàn)一致,說(shuō)明PCOS中mTORC1的激活可能是由雄激素過(guò)剩導(dǎo)致的。另有研究發(fā)現(xiàn)mTOR通路被二甲雙胍抑制后能清除產(chǎn)生TNFα的B細(xì)胞[29],這同時(shí)強(qiáng)調(diào)了PCOS患者過(guò)量的雄激素對(duì)炎癥的促進(jìn)關(guān)系[17]。此外,mTORC1激活還會(huì)造成線粒體損傷,降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4, GLUT4)表達(dá),下調(diào)葡萄糖攝取,導(dǎo)致骨骼肌胰島素抵抗[30]。最后,顆粒細(xì)胞需要進(jìn)行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化才能完成正常排卵過(guò)程[31],GSEA提示DHEA抑制了小鼠顆粒細(xì)胞中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,這或許是高雄激素抑制排卵的另一原因。

三、創(chuàng)新性與研究局限

高雄激素對(duì)PCOS卵巢局部的作用及其與PCOS其他并發(fā)癥之間的關(guān)系尚未闡明,既往研究中僅有兩例關(guān)注了雄激素過(guò)量單獨(dú)對(duì)顆粒細(xì)胞的影響[32-33],但其高通量測(cè)序內(nèi)容主要局限于基于差異基因進(jìn)行的富集分析,沒(méi)有進(jìn)行更高級(jí)的數(shù)據(jù)分析;同時(shí)只就研究者的關(guān)注重點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證,數(shù)據(jù)解讀不夠全面。而本研究借助GSEA這個(gè)更高級(jí)且不預(yù)先設(shè)置表達(dá)差異顯著性門(mén)檻的方法,說(shuō)明了各個(gè)通路的抑制或激活情況,客觀分析其整體變化情況后著重強(qiáng)調(diào)了氧化應(yīng)激與炎癥在雄激素影響顆粒細(xì)胞功能中的權(quán)重。盡管本研究反映的是顆粒細(xì)胞在體外對(duì)雄激素DHEA的短期應(yīng)答,與人體中長(zhǎng)期高雄激素環(huán)境下顆粒細(xì)胞的基因表達(dá)變化是否一致還有待證實(shí),有一定的研究局限性,但也部分解讀了高雄激素在轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的影響,指出了氧化應(yīng)激與炎癥在高雄激素引發(fā)的PCOS顆粒細(xì)胞功能障礙中的重要作用,可作為后續(xù)分子機(jī)制研究的重要參考。