戎成寶, 孫 輝, 于 斌

(1.浙江理工大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院(國(guó)際絲綢學(xué)院), 浙江 杭州 310018;2.浙江省現(xiàn)代紡織技術(shù)創(chuàng)新中心, 浙江 紹興 312000)

在過去的幾十年里,全世界范圍內(nèi)細(xì)菌抗生素耐藥性的增加已經(jīng)對(duì)公共健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。不良的殺菌、抗菌方法可能會(huì)增加與傷口感染有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)[1]?？咕徔椘穼?duì)細(xì)菌的侵入有阻隔作用,且能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖,因此,開發(fā)綠色、安全和耐用的抗菌紡織品,以保護(hù)傷口不受耐藥性細(xì)菌的影響十分必要。

抗菌納米纖維膜因其比表面積高[2]、納米多孔、價(jià)低、制備方法簡(jiǎn)單等特點(diǎn),已成為研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)[3-6]。用于抗菌敷料的靜電紡絲纖維膜不僅能保護(hù)傷口免受感染,同時(shí)也應(yīng)對(duì)人體無毒、對(duì)環(huán)境友好[7]。聚乳酸(PLA)由于其獨(dú)特的生物降解性和生物相容性,已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、皮膚組織工程和食品包裝等行業(yè)[8-9]。但PLA自身不具有抗菌性,在抗菌材料的應(yīng)用方面受到了限制,通常需對(duì)PLA進(jìn)行抗菌改性來解決這一問題。

納米合金由于其較高的比表面積和表面活性,對(duì)細(xì)菌的黏附、生長(zhǎng)和擴(kuò)散具有強(qiáng)大的抑制能力,即使在較低的濃度下也顯示出明顯的抗菌特性[10]。近年來,銀-銅雙金屬納米粒子由于原子間的靈活配置,可形成多種微觀結(jié)構(gòu),且加入的元素之間具有突出的協(xié)同效應(yīng),在抗菌方面取得了新的進(jìn)展與應(yīng)用[11-12]。Nowak等[13]研究表明,銀-銅雙金屬體系的抑菌性能相對(duì)于單金屬銀、銅得到了很大的提高。Benjamín等[14]發(fā)現(xiàn)銀-銅雙金屬納米顆粒(Ag-Cu NPs)通過細(xì)胞膜錯(cuò)位破壞細(xì)菌的生長(zhǎng)能力,導(dǎo)致細(xì)菌滲漏和細(xì)胞死亡,并系統(tǒng)闡述了Ag-Cu NPs在廣譜抗菌機(jī)制中的構(gòu)效關(guān)系。與單一金屬體系相比,Ag-Cu NPs的活性范圍更廣,活性更強(qiáng),對(duì)更多的細(xì)菌菌株有效[15-16],是一種很有前景的抗菌劑。

本文通過簡(jiǎn)單綠色的方法合成了粒徑約為32 nm的Ag-Cu NPs,并通過調(diào)整Ag-Cu NPs與PLA的共混比例制備了不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜。研究了纖維膜的形貌、組成結(jié)構(gòu)和親水性等,測(cè)試分析了其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性,以期為具有抗菌性能的PLA復(fù)合納米纖維膜在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

材料:硝酸銅三水合物(Cu(NO3)2·3H2O,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司);硝酸銀(AgNO3,常州市國(guó)宇環(huán)?？萍加邢薰?;二氯甲烷、L-抗壞血酸(上海麥克林生化科技有限公司);氫氧化鈉(NaOH,天津市永大化學(xué)試劑有限公司);PLA(相對(duì)分子質(zhì)量為160 000,美國(guó) Nature Works 公司);丙酮(杭州雙林化工試劑有限公司);氯化鈉(杭州高晶精細(xì)化工有限公司);營(yíng)養(yǎng)瓊脂、酵母浸粉、蛋白胨(杭州百思生物技術(shù)有限公司);金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(北京保藏生物科技有限公司)。

儀器:Ultra55 型熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、Zeiss Ultra 55元素面能譜儀(德國(guó)Carl Zeiss AG公司);D8 Discover 型高分辨X 射線衍射儀(德國(guó)Bruker AXS公司);Nicolet5700 型傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);DZF-6050型真空箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司);JY-82B接觸角測(cè)試儀(承德鼎盛儀器有限公司)。

1.2 試樣的制備

1.2.1 Ag-Cu NPs的制備

采用化學(xué)還原法制備Ag-Cu NPs。首先用去離子水制備以下溶液:硝酸銀(0.01 mol/L)、硝酸銅(0.01 mol/L)和抗壞血酸(0.01 mol/L)。實(shí)驗(yàn)在60 ℃水浴鍋中進(jìn)行,將200 mL抗壞血酸溶液用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值到堿性,然后將100 mL硝酸銀溶液和100 mL硝酸銅溶液均勻混合,在連續(xù)的機(jī)械攪拌下逐滴滴入至抗壞血酸溶液中。當(dāng)反應(yīng)完成后,將得到的懸浮液在10 000 r/min下離心15 min得到黑色粉末。用丙酮溶液洗滌粉末并進(jìn)行離心分離(10 000 r/min,30 min),重復(fù)5次以除去多余的雜質(zhì),得到Ag-Cu NPs,最后將其在真空烘箱中干燥,并避光儲(chǔ)存。整個(gè)制備過程速度快、成本低、無有機(jī)溶劑且不產(chǎn)生有毒廢料,制備方法綠色環(huán)保。

1.2.2 Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜的制備

采用相分離法通過靜電紡絲技術(shù)制備了不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜,具體制備流程圖如圖 1 所示。

首先,將一定質(zhì)量的PLA溶解在二氯甲烷與丙酮(二者質(zhì)量比為4∶1)的混合溶劑中,制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的PLA紡絲液。然后分別將相對(duì)于PLA質(zhì)量1%、3%、5% 和7% 的Ag-Cu NPs加入到PLA紡絲液中(具體質(zhì)量配比如表 1 所示),在室溫下超聲波攪拌2 h,最后將所得靜電紡絲溶液裝入10 mL一次性注射器中進(jìn)行靜電紡絲,得到不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜。紡絲速度為3 mL/h,電壓為15 kV,針尖到收集器距離為15 cm,溫度為25 ℃,收集器轉(zhuǎn)速為100 r/min。將所制備的納米纖維膜通風(fēng)干燥24 h,以去除殘留的溶劑。

表1 復(fù)合納米纖維膜組成配比表Tab.1 Compositions of electrostatic spinning membranes

圖1 Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜的制備路線圖Fig.1 Preparation route scheme of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

1.3 測(cè)試與表征

1.3.1 表面形貌觀察及纖維直徑測(cè)試

采用掃描電子顯微鏡觀察Ag-Cu NPs和復(fù)合納米纖維膜的表面形貌。工作電壓為 3 kV,工作距離為8.5 mm。用 Image J 軟件分別對(duì)電鏡照片中的100 個(gè)顆粒和100 根纖維進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差計(jì)算。

1.3.2 表面元素分布測(cè)試

采用高分辨X射線能譜分析儀對(duì)復(fù)合納米纖維膜的表面元素進(jìn)行分析,采用元素面能譜儀觀察單根纖維中Ag-Cu NPs的分布情況。

1.3.3 結(jié)晶結(jié)構(gòu)測(cè)試

采用X 射線衍射儀測(cè)試樣品的結(jié)晶結(jié)構(gòu),掃描范圍為 30° ～ 80°,掃描速度為 5 (°) /min。用 MDI Jade 6 軟件對(duì)XRD圖譜進(jìn)行分峰擬合后,分析復(fù)合納米纖維膜的結(jié)晶特性。

1.3.4 化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)試

采用傅里葉紅外光譜儀測(cè)試復(fù)合納米纖維膜的化學(xué)結(jié)構(gòu),掃描范圍為4 000～500 cm-1,分辨率為2 cm-1。

1.3.5 水接觸角測(cè)試

將復(fù)合納米纖維膜裁成 1 ×1 cm后,貼在載玻片上,用視頻接觸角測(cè)定儀測(cè)量樣品的水接觸角,將單滴2 μL水滴至樣品表面,等待3 s直至平衡,測(cè)量多次取平均值。

1.3.6 抗菌性能測(cè)試

參照GB/T 20944.3—2008《紡織品 抗菌性能的評(píng)價(jià) 第3部分:振蕩法》,測(cè)試不同樣品對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能,測(cè)試時(shí)間為18 h。以純PLA 納米纖維膜為對(duì)照樣,1%Ag-Cu NPs/PLA、3%Ag-Cu NPs/PLA、5%Ag-Cu NPs/PLA和7%Ag-Cu NPs/PLA為測(cè)試樣,每份樣品稱取(0.75±0.05)g,根據(jù)下式計(jì)算活菌濃度和測(cè)試樣的抑菌率,每個(gè)樣品分別測(cè)試3次取平均值。

式中:Y為抑菌率,%;Wt為對(duì)照樣的菌落平均數(shù);Qt為測(cè)試樣品的菌落平均數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面形貌分析

圖 2 為Ag-Cu NPs和Ag-Cu NPs/PLA的掃描電鏡照片。從圖 2(a)可以看出,Ag-Cu NPs呈現(xiàn)不規(guī)則球形形態(tài)。通過高分辨率圖像分析得到Ag-Cu NPs的平均直徑為(32.22±5.75)nm。從圖2(b)可看出,PLA納米纖維的直徑均勻,表面粗糙,具有多孔結(jié)構(gòu),多孔納米纖維的形成取決于2個(gè)重要因素:靜電紡的揮發(fā)性溶劑和環(huán)境濕度[17],當(dāng)溶劑揮發(fā)且環(huán)境濕度較高時(shí),水蒸氣在納米纖維表面凝結(jié)并形成水滴,隨著蒸發(fā)冷卻和纖維表面水的滲透,從而制備出多孔PLA納米纖維[18]。從圖2(c)～(f)可以看出,加入Ag-Cu NPs后,復(fù)合納米纖維表面粗糙,未觀察到顆粒存在,這可能是因?yàn)樵陟o電紡絲過程中,Ag-Cu NPs被包裹分散在PLA基體內(nèi)。此外,纖維表面仍有大量的小孔,但小孔的數(shù)量相對(duì)于純PLA納米纖維較少,小孔直徑相對(duì)于純PLA納米纖維略大,這是因?yàn)锳g-Cu NPs的加入導(dǎo)致紡絲液導(dǎo)電率增大,在靜電紡絲時(shí)射流攜帶的電荷量增加,從而增強(qiáng)了射流的不穩(wěn)定性,溶劑難以完全揮發(fā),影響了孔結(jié)構(gòu)和纖維的形成,可紡性變差[19]。

圖2 Ag-Cu NPs、PLA與不同組成的Ag-Cu NPs/PLA的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.2 SEM images of Ag-Cu NPs,PLA and different compositions of Ag-Cu NPs/PLA composite nanofiber membranes

圖3 PLA及不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜纖維的平均直徑Fig.3 Average diameters of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

圖4 Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜單根纖維的元素分布圖Fig.4 Element mapping of Ag-Cu NPs/PLA composite nanofiber membranes for single fiber

2.2 纖維直徑分析

圖 3 為納米纖維膜的纖維直徑分布圖?？梢钥闯?Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜中纖維平均直徑均小于純PLA納米纖維的平均直徑,這是因?yàn)锳g-Cu NPs的加入導(dǎo)致噴出的射流表面積累了更高的電荷密度,靜電紡絲射流攜帶的整體電荷明顯增加[20],在電場(chǎng)作用下射流可以克服自反力獲得更高的伸長(zhǎng)力,因此,隨著電荷密度的增加,纖維的直徑大大減小,且分布變得更窄[21]。但隨著Ag-Cu NPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜纖維平均直徑又不斷增加,這是因?yàn)殡S著Ag-Cu NPs占比的增加,紡絲液濃度、黏度增大,從而導(dǎo)致了纖維直徑的明顯增加。

2.3 元素分析

復(fù)合納米纖維膜中各元素的含量如表 2 所示。結(jié)果表明,純PLA納米纖維膜表面僅含有碳和氧元素,加入Ag-Cu NPs后,復(fù)合納米纖維膜表面出現(xiàn)銀和銅元素,說明Ag-Cu NPs被包裹在PLA基體中。單根纖維中銀、銅元素區(qū)域分布如圖 4所示?？梢钥闯?銀、銅元素沿著纖維徑向排列,說明Ag-Cu NPs與PLA共混噴絲時(shí),Ag-Cu NPs沿著纖維拉伸方向均勻分布。

表2 靜電紡絲纖維膜表面元素含量Tab.2 Surface element contents of electrospun fiber membranes

2.4 結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析

圖5為PLA及不同組成的Ag-Cu NPs /PLA復(fù)合納米纖維膜的X射線衍射圖。純PLA納米纖維膜在2θ為10° ～ 20°之間出現(xiàn)1個(gè)廣泛的衍射峰,表明其無定形的性質(zhì)。對(duì)于不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜,其XRD曲線在2θ為 42.7°、50.2°和73.9° 處出現(xiàn)了與金屬Cu相關(guān)的不同衍射峰,分別對(duì)應(yīng)Cu的(111)、(200)、(220)晶面;而在2θ為 38.4°、44.4°、64.8°和77.1° 處出現(xiàn)了歸因于Ag的(111)、(200)、(220)和(311)晶面的衍射峰[22]。除此之外,在2θ為 36.7°和61.6° 處還出現(xiàn)了歸屬于Cu2O的衍射峰,這是因?yàn)樵诩徑z過程中,聚合物溶液噴射成絲時(shí)溶劑揮發(fā)使空氣中的氧氣與Ag-Cu NPs接觸,導(dǎo)致銅發(fā)生部分氧化所致。上述結(jié)果也表明,Ag-Cu NPs已混入復(fù)合納米靜電紡絲纖維膜中,這與2.3節(jié)中分析的結(jié)果一致。

圖5 PLA及不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜的XRD圖譜Fig.5 XRD patterns of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

2.5 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖6為PLA與不同組成的Ag-Cu NPs /PLA復(fù)合納米纖維膜的紅外光譜圖。Ag-Cu NPs與PLA的相互作用和相行為可以通過紅外光譜分析確定[23]。

圖6 PLA及不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜的紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectra of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs/PLAcomposite nanofiber membranes

圖7 PLA與不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜的水接觸角Fig.7 Water contact angles of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs/PLA composite nanofiber membranes

2.6 水接觸角分析

圖 7示出PLA及不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜的水接觸角。可以看出,純PLA膜的水接觸角約為135°,顯示出固有的較差的親水性;加入Ag-Cu NPs后,Ag-Cu NPs/PLA的水接觸角略有下降,這是因?yàn)榧尤氲腁g-Cu NPs具有一定的親水性。

2.7 抗菌性能分析

表 3 示出對(duì)照組、PLA及Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率。可以看出,純PLA納米纖維膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力弱。對(duì)于Ag-Cu NPs/PLA來說,其抑菌率均大于96%,這主要是因?yàn)殂y銅雙金屬納米粒子的引入,使銀、銅離子的釋放達(dá)到殺菌性能。研究表明:在復(fù)合材料中存在銅和銀納米粒子的協(xié)同作用,從而使材料對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌均表現(xiàn)出良好的抑菌活性[28-29],無論銀銅比例如何,對(duì)革蘭氏陰性菌、陽性菌和白色念珠菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果[30],這種增強(qiáng)的抗菌效果可能與銀銅合金形成過程中銀離子的釋放直接相關(guān)[31]。隨著Ag-Cu NPs含量的增加,復(fù)合納米纖維膜的抑菌率不斷增加,這是因?yàn)镹Ps的抑菌活性與其濃度呈顯著正相關(guān)[32]。當(dāng)添加Ag-Cu NPs為 7% 時(shí),Ag-Cu NPs/PLA顯示出很高的抗菌活性,對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率均分別高達(dá) 99.29% 和 99.35%,且Ag-Cu NPs/PLA對(duì)大腸桿菌的抗菌效果都優(yōu)于金黃色葡萄球菌,這是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌的細(xì)胞壁比大腸桿菌厚,所以細(xì)胞壁較薄且蛋白質(zhì)含量較高的大腸桿菌更易受到離子攻擊。

表3 PLA與不同組成的Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜的抑菌率Tab.3 Antibacterial efficiencies of PLA and different compositions of Ag-Cu NPs /PLA composite nanofiber membranes

3 結(jié) 論

1)以銀和銅的硝酸鹽溶液為原料,抗壞血酸為還原劑,采用化學(xué)還原法合成了銀-銅雙金屬納米粒子(Ag-Cu NPs),然后利用靜電紡絲技術(shù)制備了Ag-Cu NPs/聚乳酸(PLA)復(fù)合納米纖維膜。通過觀察發(fā)現(xiàn),復(fù)合納米纖維膜表面多孔、粗糙,Ag-Cu NPs包覆在PLA納米纖維內(nèi)且均勻地沿著纖維拉伸方向排列。相較于純PLA纖維膜,Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜的纖維直徑下降。

2) Ag-Cu NPs與PLA之間僅發(fā)生物理作用,未產(chǎn)生明顯的化學(xué)作用;相較于純PLA納米纖維膜,Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜水接觸角略有下降。

3)Ag-Cu NPs/PLA復(fù)合納米纖維膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有良好的抑菌性,當(dāng)Ag-Cu NPs為7%時(shí),Ag-Cu NPs/PLA對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率超過99%,實(shí)現(xiàn)了對(duì)其的高效抗菌作用。