王聰亮,張政軒, 2△,白晶晶,付 琪,藍(lán)賢勇,陳生會(huì),屈 雷*,朱海鯨, 5, 6*

(1.榆林學(xué)院陜西省絨山羊工程技術(shù)研究中心,陜西 榆林 719000;2. 榆林市榆陽(yáng)區(qū)牛家梁區(qū)域畜牧獸醫(yī)站,陜西 榆林 719000; 3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712000;4. 陜西神奧農(nóng)業(yè)生物技術(shù)開發(fā)股份有限公司,陜西 神木 719318; 5. 陜西省“四主體一聯(lián)合”肉羊工程技術(shù)校企聯(lián)合研究中心,陜西 神木 719318;6. 陜西浩麗絨山羊科技發(fā)展有限公司,陜西 子洲 718499)

內(nèi)蒙古絨山羊是內(nèi)蒙古自治區(qū)經(jīng)過長(zhǎng)期自然選擇和人工選育而培育的地方優(yōu)質(zhì)品種[1],獨(dú)特的區(qū)域環(huán)境和氣候使得內(nèi)蒙古絨山羊肉質(zhì)緊實(shí)、味美質(zhì)優(yōu),羊絨纖維細(xì)而柔軟,在國(guó)內(nèi)外享有盛名[2-3]。作為絨肉兼用型品種,產(chǎn)肉性能往往與生長(zhǎng)性狀關(guān)系緊密,但目前很難做到肉、絨兼顧選育。家畜的體型外貌往往不同程度影響著生產(chǎn)性能[4],且生長(zhǎng)性狀越好,體重就越大,經(jīng)濟(jì)價(jià)值就越高,因而進(jìn)行內(nèi)蒙古絨山羊生長(zhǎng)性狀表型的選育,對(duì)于提高經(jīng)濟(jì)效益和育種改良意義重大。傳統(tǒng)育種方法耗時(shí)長(zhǎng)、難度大,而分子標(biāo)記輔助選擇(marker assisted selection, MAS)方法能夠極大程度縮短育種年限、有效提高育種效率、快速培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種和提高經(jīng)濟(jì)性狀,在家畜育種過程中發(fā)揮較大作用[5-7],故利用MAS技術(shù)尋找影響山羊體尺和與絨相關(guān)等經(jīng)濟(jì)性狀的重要候選基因和相關(guān)分子標(biāo)記,對(duì)于加快該品種的育種進(jìn)程有著重要理論價(jià)值。

角蛋白相關(guān)蛋白(Keratin- associated Protein, KAPs)和角蛋白中間絲(Keratin intermediate filament, KET-IF)是構(gòu)成羊毛纖維的主要結(jié)構(gòu)蛋白,按照其結(jié)構(gòu)功能分為高硫蛋白(high-sulfer KAPs)、超高硫蛋白(Ultra-high-sulfer KAPs)和高甘氨酸酪氨酸蛋白(high-glycine-tyrosine KAPs),其中高甘氨酸酪氨酸蛋白包括KAP6.n、KAP7和KAP8多基因家族[8-11]。KAP在不同物種或不同品種毛發(fā)內(nèi)的結(jié)構(gòu)和含量差異較大,其中綿羊毛中KAP最高含量為12%,在針鼴鼠高達(dá)30%～40%[12-13]。研究人員通過遺傳連鎖分析和體細(xì)胞雜交技術(shù)將高甘氨酸酪氨酸蛋白KAP6.1、KAP8和高硫蛋白KAP1.1、KAP1.2以及KAP3.2分別定位在綿羊第1號(hào)和21號(hào)染色體上[14-15],其中KRTAP6和KRTAP8基因與美利奴羊纖維直徑和羊毛產(chǎn)量顯著相關(guān)[16]。張亞妮等[17]報(bào)道稱,在絨山羊中,KAP1.1和KAP1.3基因分別與產(chǎn)絨量和體重顯著相關(guān),KAP13.1基因可作為羊絨纖維直徑性狀標(biāo)記輔助選擇的遺傳標(biāo)記[18],其中角蛋白基因的差異表達(dá)可導(dǎo)致不同地域環(huán)境和品種的絨山羊羊絨品質(zhì)存在較大差異[19-20]。

目前關(guān)于KAP6.2基因與內(nèi)蒙古絨山羊生長(zhǎng)性狀相關(guān)性的研究未見報(bào)道,因此,本研究以KAP6.2基因作為目標(biāo)基因,探索KAP6.2基因的InDel多態(tài)性,并分析其與內(nèi)蒙古絨山羊生長(zhǎng)性狀和絨細(xì)度性狀的關(guān)聯(lián)性,以期為內(nèi)蒙古絨山羊的選種選配奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)所用內(nèi)蒙古絨山羊均來自陜西省榆林市某養(yǎng)殖基地。隨機(jī)選取409只(1.0～1.5歲)育成羊和189只(1.5～4.0歲)成年羊,均為雌性。試驗(yàn)羊均舍飼,飼喂環(huán)境和飼喂日糧相同。

1.1.2 樣品的采集與生長(zhǎng)性狀的測(cè)定 剪取試驗(yàn)羊約2 g的耳組織樣,放入含有1.0 mL 70%酒精的2.0 mL Eppedorff管中,冰盒中保存帶回,置于-20 ℃冰箱保存。同時(shí)測(cè)量試驗(yàn)羊的10個(gè)生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù),包括體重、體高、體長(zhǎng)、胸圍、髖骨寬、管圍、十字部高、胸深、胸寬[21],測(cè)量體尺的同時(shí),貼皮取試驗(yàn)羊肩胛骨處約3 g羊絨樣品并測(cè)定絨細(xì)度。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與濃度測(cè)定 受試羊耳組織的基因組DNA參照高鹽法[22]提取,利用Nanodrop分光光度計(jì)和10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分別測(cè)定DNA濃度和純度,稀釋至20 ng/μL,-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的山羊KAP6.2基因序列(GenBank登錄號(hào):AY316158.1),利用Zhao等[23]文章中的引物對(duì)候選變異位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè),引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 PCR體系與反應(yīng)條件 總PCR反應(yīng)體系(25 μL):PCR Master Mix 12.5 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,以ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件參照趙俊星等[24]的文章,擴(kuò)增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳與測(cè)序鑒定分型。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 利用在線網(wǎng)站SHEsis(http://analysis.bio-x.cn)分析了KAP6.2基因InDel多態(tài)位點(diǎn)在內(nèi)蒙古絨山羊群體中的Hardy-Weinberg平衡P值與基因型頻率等結(jié)果,應(yīng)用一般線性模型Yijk=μ+Gi+Eij分析不同參數(shù)對(duì)性狀的影響,其中μ為總體平均值,Gi代表基因型固定效應(yīng),Eij代表隨機(jī)誤差。利用SPSS 23.0軟件和單因素方差分析法分析KAP6.2基因InDel突變位點(diǎn)不同基因型與內(nèi)蒙古絨山羊不同群體生長(zhǎng)性狀和絨細(xì)度性狀的差異顯著性,其中育成羊群體絨細(xì)度性狀DD基因型只有1個(gè),故運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法單獨(dú)對(duì)II和ID基因型與育成羊絨細(xì)度性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。再取各個(gè)性狀表型值的組內(nèi)平均值,獲取個(gè)體表型值與組內(nèi)平均值的差值,以單因素方差分析法分析不同基因型與內(nèi)蒙古絨山羊群體生長(zhǎng)性狀和絨細(xì)度性狀之間的差異顯著性,以上結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 KAP6.2基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

利用合成引物對(duì)KAP6.2基因外顯子區(qū)24-bp InDel突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示(圖1),KAP6.2基因InDel突變位點(diǎn)存在3種基因型:純合插入型(II,362 bp)、雜合型(ID,362/338 bp)與純合缺失型(DD,338 bp),測(cè)序結(jié)果(圖2)與電泳結(jié)果一致。結(jié)果表明,KAP6.2基因24-bp InDel突變(AY316158.1.g:119-142 del CAGGATACGGCTGTGGATACGGTT)在內(nèi)蒙古絨山羊群體中存在多態(tài)性。

圖1 KAP6.2基因InDel位點(diǎn)擴(kuò)增Fig.1 Amplification of InDel site of KAP6.2 gene M. Marker 1;II:插入/插入;ID. 插入/缺失;DD. 缺失/缺失;下同 M. Marker 1; II. insertion/insertion; ID. insertion/deletion; DD. deletion/deletion; the same below

圖2 KAP6.2基因InDel位點(diǎn)測(cè)序圖a. ID基因型測(cè)序結(jié)果,b. II基因型測(cè)序結(jié)果Fig. 2 Sequencing of InDel site of KAP6.2 genea. ID genotype sequencing results; b. II genotype sequencing results

2.2 KAP6.2基因InDel位點(diǎn)遺傳參數(shù)分析

根據(jù)基因分型結(jié)果對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊試驗(yàn)群體進(jìn)行計(jì)算分析(表1),KAP6.2基因InDel突變位點(diǎn)在內(nèi)蒙古絨山羊育成羊和成年羊群體雜合度分別為0.146和0.081,均屬于低度多態(tài)(0.10.05);將育成羊和成年羊作為一個(gè)群體分析時(shí),此突變位點(diǎn)與育成羊和成年羊分析結(jié)果一致。

表1 內(nèi)蒙古絨山羊群體KAP6.2基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳參數(shù)值Table 1 Genetic parameters values of KAP6.2 gene polymorphism locus in Inner Mongolia cashmere goat

2.3 內(nèi)蒙古絨山羊KAP6.2基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀和絨細(xì)度性狀的相關(guān)分析

由表2可知,在育成羊中(n=409),該InDel突變與胸圍、十字部顯著相關(guān)(P<0.05),與體長(zhǎng)、胸深和胸寬呈極顯著相關(guān)(P<0.01);在成年羊中(n=189),該InDel突變與胸寬顯著相關(guān)(P<0.05),與胸圍、十字部高和胸深極顯著相關(guān)(P<0.01),優(yōu)勢(shì)基因型均為DD;在整個(gè)內(nèi)蒙古絨山羊群體中(n=598),該InDel突變與體長(zhǎng)、胸圍、十字部高、胸深和胸寬極顯著相關(guān)(P<0.01),優(yōu)勢(shì)基因型為DD型;與絨細(xì)度顯著相關(guān)(P<0.05),優(yōu)勢(shì)基因型為ID型。

表2 內(nèi)蒙古絨山羊育成羊KAP6.2基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀和絨細(xì)度性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 2 Correlation analysis of growth traits and cashmere fineness of Inner Mongolia cashmere goats in breeding period with polymorphisms in KAP6.2 gene

3 討 論

內(nèi)蒙古絨山羊養(yǎng)殖業(yè)是內(nèi)蒙古地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)支柱,其羊絨細(xì)度較細(xì),是多國(guó)紡織羊絨精品的主要原料[24-25]。但產(chǎn)肉量較低、絨細(xì)度變化較大是目前內(nèi)蒙古絨山羊養(yǎng)殖過程中亟待解決的問題[26]。因此,利用選擇現(xiàn)代分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)來提高經(jīng)濟(jì)性狀和實(shí)現(xiàn)內(nèi)蒙古絨山羊高效育種具有重要意義。

KAP6.2基因?qū)儆诟吒拾彼崂野彼岬鞍锥嗷蚣易?目前在山羊上對(duì)KAP基因家族的研究主要集中在與毛、絨相關(guān)的多態(tài)性檢測(cè)和選擇候選基因上[27]。研究顯示,KAP6.1基因可作為與優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊、遼寧絨山羊的產(chǎn)絨量和絨細(xì)度性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)[17,28],同時(shí)該基因已定位到綿羊的1號(hào)染色體上[19]。多項(xiàng)研究表明,KAP6.2基因在多個(gè)山羊、綿羊品種中存在多態(tài)性,與部分品種絨、毛性狀相關(guān)。例如,KAP6.2基因在遼寧絨山羊、遼-岢雜種山羊和黎城大青羊3個(gè)山羊品種內(nèi)檢測(cè)到18個(gè)SNP突變位點(diǎn),并造成了氨基酸的序列變化[24],在綿羊和中衛(wèi)山羊也檢測(cè)到SNP位點(diǎn),在中衛(wèi)山羊?yàn)橹卸榷鄳B(tài)[29-30]。在高原型藏山羊上,KAP6.2基因與產(chǎn)絨量、絨長(zhǎng)度和絨細(xì)度性狀顯著相關(guān),可作為首選標(biāo)記位點(diǎn)[31]。此外,KAP6.2基因在毛囊分化中具有空間表達(dá)變化的特征[32-33],在陜北白絨山羊存在24 bp的缺失突變,提示該缺失突變可能是陜北白絨山羊絨型多樣、產(chǎn)絨量高的原因之一[23]。同時(shí),KAP6.2基因的核苷酸和氨基酸序列在不同地域和不同品種山羊中高度保守,在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段皮膚的初級(jí)、次級(jí)毛囊的皮質(zhì)層和內(nèi)根鞘中均有不同程度表達(dá)[34-35]。

本研究發(fā)現(xiàn),KAP6.2基因外顯子區(qū)24-bp InDel突變?cè)趦?nèi)蒙古絨山羊群體中穩(wěn)定存在且存在多態(tài)性,多態(tài)信息含量、雜合度等往往與群體的遺傳變異程度呈正相關(guān)[36]。多態(tài)信息含量顯示,在內(nèi)蒙古絨山羊育成羊群體、成年羊群體和整個(gè)內(nèi)蒙古絨山羊群體中,多態(tài)信息含量分別為0.136、0.078和0.018,均屬于低度多態(tài),可能是遺傳分化程度較低,與其它種群基因交流較少導(dǎo)致。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)表明,此突變位點(diǎn)均處于平衡狀態(tài),表明該群體未受到人工選育或者受人工選育影響程度較小,也可能是在遺傳漂變、遷徙中處于動(dòng)態(tài)平衡,可以對(duì)這些位點(diǎn)加強(qiáng)選擇力度[37]。同時(shí),此InDel突變位點(diǎn)與育成羊和成年羊胸圍、十字部高、胸深和胸寬等多個(gè)生長(zhǎng)性狀具有顯著或極顯著關(guān)聯(lián),優(yōu)勢(shì)基因型均為DD型,該結(jié)果在具有顯著或極顯著關(guān)聯(lián)的生長(zhǎng)性狀和優(yōu)勢(shì)基因型上具有很好的一致性,說明該位點(diǎn)可以作為內(nèi)蒙古絨山羊選育的重要位點(diǎn),在后續(xù)育種工作中優(yōu)先選擇DD型山羊個(gè)體進(jìn)行選育。在整個(gè)內(nèi)蒙古絨山羊群體中,KAP6.2基因此InDel突變與絨細(xì)度具有顯著關(guān)聯(lián),而次級(jí)毛囊中KAP8.2表達(dá)量是初級(jí)毛囊的2.71倍,可能對(duì)絨細(xì)度具有重要調(diào)控作用[38],KAP6.2與KAP8.2同屬高甘氨酸酪氨酸蛋白[8-11],推測(cè)KAP6.2基因可能通過類似調(diào)控從而影響絨毛纖維的表型性狀,具體作用機(jī)制需進(jìn)一步探究。絨細(xì)度與羊絨經(jīng)濟(jì)價(jià)值有著直接關(guān)系[39],在實(shí)際生產(chǎn)中意義重大,但在育成羊和成年羊群體中恰恰相反,沒有表現(xiàn)出顯著性,這可能與樣本量大小有直接關(guān)系,但不排除與不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和遺傳差異的關(guān)系[34-35]。

4 結(jié) 論

KAP6.2基因外顯子區(qū)24-bp InDel突變位點(diǎn)能夠顯著影響內(nèi)蒙古絨山羊的生長(zhǎng)發(fā)育,可作為內(nèi)蒙古絨山羊部分生長(zhǎng)性狀和絨細(xì)度性狀選育的候選基因,為內(nèi)蒙古絨山羊選育工作提供理論依據(jù)。