車(chē)冰雁 余尚妍 李志能 李先源

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院 長(zhǎng)江上游農(nóng)業(yè)生物安全與綠色生產(chǎn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶市花卉工程技術(shù)研究中心 重慶 400715）

UFO（unusual floral organs）是被子植物中首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的F-box蛋白，主要參與調(diào)控花器官?zèng)Q定與發(fā)育（Levinet al.，1995; Samachet al.，1999）。F-box家族是植物中的超大家族之一，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中就有超700多個(gè)基因編碼F-box蛋白（Risseeuwet al.，2003）。F-box蛋白在N端具有40～50個(gè)氨基酸的保守基序，是SCF泛素復(fù)合體（skp1-cullin-F-box）的重要組分，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著多重作用，包括植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自交不親和、花器官發(fā)育以及對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)等（Zhanget al.，2019）。在泛素系統(tǒng)中，UFO編碼的F-box蛋白負(fù)責(zé)底物特異性識(shí)別，與SKP1（S-phase kinase-associated protein 1）/ASK1（ArabidopsisSkp1-like 1）和Cdc53（cullin）蛋白相互作用，形成泛素連接酶SCF復(fù)合體，通過(guò)泛素化途徑，促進(jìn)負(fù)調(diào)控B類(lèi)MADS-box基因的蛋白的泛素化，激活B類(lèi)基因的表達(dá)（Leeet al.，1997; Takahashiet al.，2004），形成花瓣和雄蕊。在擬南芥中，UFO亦可作為區(qū)域特異性共調(diào)因子與LFY（LEAFY）相互作用，共同調(diào)控B類(lèi)MADS-box基因的表達(dá)（Zhaoet al.，2001;王利琳等，2004），但該調(diào)控路徑依賴(lài)于LFY的活性（Soueret al.，2008）。UFO蛋白能夠與LFY蛋白C端結(jié)合，直接作用于AP3（apetala 3）啟動(dòng)子，且通過(guò)UFO調(diào)控蛋白酶體活性是激活A(yù)P3轉(zhuǎn)錄所必需的（Chaeet al.，2008）。UFO在植物體內(nèi)外都與LFY相互作用，且這種固定的蛋白互作模式廣泛存在，在矮牽牛（Petunia hybrida）中的DOT（double top）和ALF（aberrant leaf and flower）、水稻（Oryza sativa）的APO1（aberrant panicle organization 1）和APO2/RFL（aberrant panicle organization 2/rice floricula）以及番茄（Solanum lycopersicum）的AN（anantha）和FA（falsiflora）中都得到驗(yàn)證（Soueret al.，2008; Ikeda-Kawakatsuet al.，2012;Allenet al，1996）。除此之外，UFO還可參與抑制C類(lèi)MADS-box基因AG（agamous）負(fù)調(diào)節(jié)擬南芥早期花瓣發(fā)育（Durfeeet al.，2003）。

在擬南芥中，UFO在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都在莖尖分生組織中表達(dá)（Longet al.，1998），主要參與調(diào)控花發(fā)育過(guò)程中一系列復(fù)雜的器官發(fā)育，其功能缺失會(huì)導(dǎo)致花瓣和雄蕊發(fā)育嚴(yán)重受阻，甚至被萼片、心皮和花絲等嵌合器官所代替，同時(shí)，AP3和PI（pistillata）的表達(dá)量降低（Nget al.，2001）。短日照條件下，ufo突變體表現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向花序特征的紊亂轉(zhuǎn)變（Wilkinsonet al.，1995），而UFO的超量表達(dá)則會(huì)出現(xiàn)花瓣與雄蕊的綴疊。百脈根（Lotus corniculatus）pfo（proliferating floral organs）突變體及豌豆（Pisum sativum）stp（stamina pistilloida）突變體都存在著花瓣與雄蕊發(fā)育受損的現(xiàn)象（Ferrándizet al.，1999; Zhanget al.，2003）。研究發(fā)現(xiàn)，矮牽牛UFO的同源基因DOT和番茄中的AN失活后將引發(fā)花分生組織特性完全喪失，甚至是花序結(jié)構(gòu)的改變，但DOT在擬南芥中的異位表達(dá)并未引發(fā)擬南芥花序結(jié)構(gòu)的改變（Kusterset al.，2015; Soueret al.，2008）。除此之外，ufo突變還會(huì)引起擬南芥葉片畸形（Leeet al.，1997）；異源表達(dá)懸鈴木（Platanus acerifolia）PaUFO基因，導(dǎo)致擬南芥蓮座葉和莖生葉逐漸淺裂（張思思，2016）；UFO同源基因STP在豌豆中功能缺失，則會(huì)產(chǎn)生簡(jiǎn)化的葉片（Tayloret al.，2001）。近期研究中還發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtUFO會(huì)導(dǎo)致植株小葉片數(shù)量增多（石欣玥等，2020）。

蠟梅(Chimonanthus praecox)是我國(guó)特有的冬季觀花樹(shù)種，被廣泛應(yīng)用于園林綠化，盆景制作，切花生產(chǎn)等，同時(shí)蠟梅花具有較高的藥用價(jià)值，其花香馥郁，是制作精油、香料的材料（魏瑋等，2010），因此對(duì)其花發(fā)育的研究十分有意義。UFO是被子植物中首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的F-box蛋白（Levinet al.，1995），也是泛素介導(dǎo)蛋白質(zhì)水解過(guò)程中具有底物識(shí)別特性的蛋白質(zhì)（Takahashiet al.，2004），在模式植物擬南芥中，UFO已被證實(shí)參與調(diào)控花器官?zèng)Q定與發(fā)育（Samachet al.，1999）。鑒于此，本試驗(yàn)從蠟梅中克隆CpUFO，構(gòu)建35S::CpUFO過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，進(jìn)而探究轉(zhuǎn)基因植株的表型變化，以期為闡明蠟梅花發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料素心蠟梅（C. praecox ‘Concolor’）種植于校內(nèi)，常規(guī)養(yǎng)護(hù)管理。擬南芥哥倫比亞野生型（Columbia，Col-0/wild type，WT）種植在（22±2）℃、光周期16 h光/8 h暗、濕度70%的人工氣候室。

pMD19-T克隆載體購(gòu)自于日本TaKaRa公司（大連）。pCAMBIA1300植物表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室自制，根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 CpUFO基因克隆及系統(tǒng)進(jìn)化分析

以成年蠟梅不同花期的花朵為材料，利用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊生物）提取蠟梅總RNA，以NanoDrop2000微量核酸測(cè)定儀（美國(guó)Thermo）和1%瓊脂糖凝膠電泳相結(jié)合的方法檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量。使用PrimeScript?RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物）獲得cDNA，根據(jù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)的蠟梅基因組、注釋信息、CDS（coding sequence）等（Shanget al.，2020），擴(kuò)增得到CpUFO編碼序列全長(zhǎng)，連接pMD19-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及PCR檢測(cè)后，將含陽(yáng)性克隆子菌液送公司測(cè)序。所用引物見(jiàn)表1。

表1 本研究所使用引物①Tab. 1 Primers used in this study

利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）在線工具分別對(duì)CpUFO基因編碼的蛋白進(jìn)行分析與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，運(yùn)用Blastp搜索其同源氨基酸序列。多重序列比對(duì)及作圖分別使用ClustalW和GeneDoc軟件。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建及美化分別使用MEGA-X軟件和iTOL（https://itol.embl.de/）在線工具，采用鄰接法（neighbor joining，NJ），泊松模型（Poisson Model），Bootstrap method選擇1 000個(gè)重復(fù)，其他參數(shù)默認(rèn)。

1.3 CpUFO在不同的組織、器官及花發(fā)育時(shí)期表達(dá)特性分析

以成年蠟梅的莖、葉、腋芽、果及初開(kāi)期的花器官（外花被片、內(nèi)花被片、雄蕊、雌蕊）為材料，進(jìn)行CpUFO表達(dá)特性分析。從2018年3月8日—12月30日，對(duì)蠟梅花芽分化期、露瓣期、始花期至盛開(kāi)期花芽進(jìn)行取樣（液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，用于總RNA的提?。?，分析CpUFO在花發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式?？俁NA提取及反轉(zhuǎn)錄方法同上。選用蠟梅CpActin與CpTublin基因作為實(shí)時(shí)熒光定量的雙內(nèi)參基因，反應(yīng)體系根據(jù)SsoFastTMEvaGreen Supermix熒光定量試劑盒（美國(guó)Bio-Rad）內(nèi)說(shuō)明書(shū)配制，利用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行表達(dá)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Bio-Rad ManagerTMSoftware（Version 1.1）軟件進(jìn)行分析，用2-△△CT法獲得目的基因的相對(duì)表達(dá)量。定量引物見(jiàn)表1。

1.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選、表型觀察及內(nèi)源基因表達(dá)分析

采用雙酶切法構(gòu)建CpUFO過(guò)表達(dá)載體，并命名為pCAMBIA1300-CpUFO。利用蘸花法（Cloughet al.，1998）轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0，轉(zhuǎn)化后的T0代種子播種在含50 mg L-1潮霉素（hygromycin，Hyg）和125 mg L-1羧芐青霉素（carbenicillin，Cb）的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行陽(yáng)性植株篩選，使用CTAB法提取35S::CpUFO/擬南芥和WT整株基因組DNA，進(jìn)行PCR陽(yáng)性檢測(cè)。采用Trizol法分別提取T2代35S::CpUFO/擬南芥和WT整株總RNA，利用qRT-PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)（over expression，OE）株系中CpUFO的表達(dá)量，篩選出表達(dá)量高、中、低的株系并進(jìn)行表型觀察和內(nèi)源基因表達(dá)量分析，所用引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpUFO目的基因獲得與結(jié)構(gòu)域分析

從蠟梅cDNA中克隆得到CpUFO的基因序列，該基因位于第6條染色體上，有2個(gè)外顯子（圖1A、B）。其基因全長(zhǎng)cDNA序列為1 665 bp，包含1 212 bp的完整開(kāi)放閱讀框（ORF）和346 bp/107 bp的5'/3'-UTR區(qū)（untranslated region）。將CpUFO測(cè)序結(jié)果在NCBI上Blastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)儆贔-box家族。

圖1 CpUFO序列基本特征（A-C）、CpUFO與其他同源蛋白多序列比對(duì)（D）及系統(tǒng)進(jìn)化分析（E）Fig. 1 Basic characteristics of CpUFO sequence (A-C), multiple alignment (D) and phylogenetic evolution analysis (E) of CpUFO and the other homologous protein

2.2 CpUFO編碼蛋白特征及系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2.1 CpUFO蛋白基本特征分析 利用ProtParam軟件在線分析結(jié)果表明：CpUFO基因編碼蛋白由403個(gè)氨基酸組成（圖1C），其中包含47個(gè)堿性氨基酸［strongly basic(+) amino acids］、43個(gè)酸性氨基酸［strongly acidic(-) amino acids］、174個(gè)疏水氨基酸（hydrophobic amino acids）和126個(gè)極性氨基酸（polar amino acids），所占百分比依次為11.6%、10.7%、43.2%和31.2%；預(yù)測(cè)分子式為C2071H3183N545O592S24；總原子數(shù)為6 415，等電點(diǎn)pI值為6.55；不穩(wěn)定系數(shù)（instability index)為50.69，由此可以推測(cè)該蛋白是不穩(wěn)定的蛋白。脂肪系數(shù)為84.81，是親水蛋白。

利用SOPMA對(duì)CpUFO蛋白前體二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其主要由12.41%α螺旋（α helix）、29.53%的延伸鏈（extended strands）、0.00%β轉(zhuǎn)角（β turn）和58.06%的隨機(jī)卷曲（random coil）組成。

2.2.2 CpUFO蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析 將CpUFO的最大ORF翻譯的蛋白序列在NCBI上進(jìn)行Blastp比對(duì)，從比對(duì)結(jié)果可以看出CpUFO蛋白與其他物種的UFO蛋白相似性并不高，其中僅與沉水樟（Cinnamomum micranthum）的同源性達(dá)80%以上，為82.13%。從CpUFO與擬南芥、葡萄（Vitis vinifera）、水稻等10個(gè)物種的UFO同源蛋白多序列比對(duì)結(jié)果也可以看出，CpUFO蛋白與其他UFO蛋白相似性不高，但其結(jié)構(gòu)域比較保守（圖1D）。

從NCBI上下載CpUFO同源蛋白序列以及一些F-box蛋白，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1E所示。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，CpUFO同柳葉蠟梅（Chimonanthus salicifolius）、睡蓮（Nymphaea colorata）、沉水樟聚為一支，且與柳葉蠟梅親緣關(guān)系最近。

2.3 CpUFO表達(dá)特性分析

2.3.1 不同組織、器官中CpUFO表達(dá)特性分析 通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行組織特異性分析表明，CpUFO的表達(dá)主要集中在花器官中，其中外花被片中表達(dá)量最高，內(nèi)花被片中表達(dá)量次之，雌/雄蕊中表達(dá)量相當(dāng)。在腋芽、葉、莖、果中，CpUFO表達(dá)量依次降低，在果中表達(dá)量?jī)H0.02，不足外花被片中表達(dá)量的1/100，表達(dá)差異極顯著（圖2A）。同時(shí)，LFY、WOX13（WUSCHEL related homeobox 13）、AP3、SEP1（Sepallata 1）在蠟梅中的同源基因也均顯示在外花被片中表達(dá)量最高（圖2B-E），由此推測(cè)CpUFO可能與上述基因存在一定的調(diào)控關(guān)系，并共同調(diào)控外花被片的發(fā)育。

圖2 不同基因在蠟梅不同組織、器官中的相對(duì)表達(dá)量（A-E）及CpUFO在不同花發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量（F）Fig. 2 Relative expression of different genes in different tissues or organs (A-E) and relative expression of CpUFO at different floral development periods of C. Praecox (F)

2.3.2 自然條件下不同花發(fā)育時(shí)期CpUFO表達(dá)特性分析 利用qRT-PCR對(duì)CpUFO在蠟梅不同花發(fā)育時(shí)期花芽中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明，從蠟梅花原基形成階段進(jìn)入休眠階段，到子房發(fā)育成熟，再到開(kāi)花前的需冷量累積階段，CpUFO基因表達(dá)量均較低，且整體呈先升高后降低的趨勢(shì)；其中4月28日和5月25日花原基形成期、6月5日—19日休眠起始階段的表達(dá)量相對(duì)較高，是其他時(shí)期表達(dá)量的1.75～9.00倍。CpUFO在花芽打破休眠/花蕾開(kāi)放階段的露瓣DT（displayed tepal）、始花IB（initiate blooming）和盛開(kāi)期OF（open flower stage）花芽中表達(dá)水平達(dá)到最高，均極顯著高于其他時(shí)期花芽，分別是子房發(fā)育階段及需冷量累積階段的38.7倍和38.9倍（圖2F）。

2.4 35S::CpUFO/擬南芥表型分析

對(duì)CpUFO過(guò)表達(dá)擬南芥T0代經(jīng)PCR篩選后（圖3A, B），對(duì)純合35S::CpUFO/擬南芥T2代不同株系中CpUFO基因的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，挑選出CpUFO基因表達(dá)量高/中/低的OE6-1/OE16-3/OE1-1株系（圖3C），進(jìn)行表型觀察。結(jié)果表明，35S::CpUFO株系OE6-1/16-3/1-1均具有明顯的早花現(xiàn)象，且與表達(dá)量成正相關(guān)。對(duì)花器官進(jìn)行解剖觀察后發(fā)現(xiàn)，在同一個(gè)開(kāi)花生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)基因株系中雌蕊柱要比WT株系的雌蕊柱長(zhǎng)，但成熟后的果莢長(zhǎng)度無(wú)明顯差異。過(guò)表達(dá)株系中蓮座葉數(shù)目顯著減少，抽薹時(shí)間、第1個(gè)果莢形成時(shí)間縮短，且與表達(dá)量成負(fù)相關(guān)。綜上所述，推測(cè)CpUFO過(guò)表達(dá)能夠縮短擬南芥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間、促進(jìn)早花，并對(duì)其花器官產(chǎn)生一定影響（表2，圖3D-I）。

圖3 35S::CpUFO/擬南芥株系篩選及T2代株系表型分析Fig. 3 Screening of overexpression and phenotypic analysis of T2 generation of 35S::CpUFO/Col-0 lines and WT in A. thaliana

表2 35S::CpUFO/擬南芥T2代株系表型分析①Tab. 2 Phenotypic analysis of T2 generation of 35S::CpUFO/Col-0 lines and WT

2.5 35S::CpUFO/擬南芥內(nèi)源基因的表達(dá)分析

為探究35S::CpUFO/擬南芥表型變化的原因，選取擬南芥中5個(gè)花發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，擬南芥中的AP1、AP3、FUL（fruitfull）基因均有不同程度的上調(diào)，同時(shí)OE1-1株系中3個(gè)基因的表達(dá)量均顯著高于WT株系。與野生型相比，35S::CpUFO/擬南芥中作為調(diào)控開(kāi)花的抑制因子TFL1（terminal flower 1）基因顯著下調(diào)（圖4）。可見(jiàn)，蠟梅CpUFO基因過(guò)表達(dá)具有促進(jìn)擬南芥早花的功能。

圖4 35S::CpUFO/擬南芥T2代株系內(nèi)源基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression of endogenous genes from T2 generation of 35S::CpUFO/Col-0 lines and WT

3 討論

目前，已經(jīng)在擬南芥（Levinet al.，1995）、金魚(yú)草（Antirrhinum majus）（Ingramet al.，1997）、玉米（Zea mays）（Chucket al.，2002）、水稻（Ikedaet al.，2007）、波斯菊（Cosmos bipinnatus）（Liet al.，2019）、蒺藜苜蓿（馬翠娜等，2020）等多個(gè)物種中分離并克隆得到UFO及其同源基因，并在不同物種中對(duì)其參與花發(fā)育調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。研究表明，UFO基因參與調(diào)控花分生組織形成及花器官識(shí)別，但其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在不同物種間可能具有一定差異，如擬南芥UFO基因缺失將導(dǎo)致花瓣和雄蕊發(fā)育嚴(yán)重受阻（Ingramet al.，1995）；UFO同源基因FIM（Fimbriata）在金魚(yú)草中異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致其無(wú)法形成正常的心皮（Ingramet al.，1997）。而在頭狀花序植物波斯菊中，CbUFO基因的缺陷表達(dá)，則會(huì)導(dǎo)致難以區(qū)分的花序外圍和中心（Liet al.，2019）。UFO與LFY同源基因相互作用在多個(gè)物種中得到驗(yàn)證，但在懸鈴木及樟樹(shù)（Cinnamomum camphora）開(kāi)花機(jī)制研究中這一互作關(guān)系卻不明顯（張思思，2016; 周琴，2016），初步推測(cè)可能是由于UFO與LFY同源基因在木本植物花發(fā)育調(diào)控過(guò)程中產(chǎn)生了功能冗余或是分化，亦或是兩者的表達(dá)域在空間與時(shí)間上無(wú)法重疊導(dǎo)致。而在木本植物水杉（Metasequoia glyptostroboides）中，UFO與LFY同源基因仍存在互作關(guān)系（王菁菁，2019）。因此，對(duì)于CpUFO基因的研究，不僅能夠豐富UFO基因參與調(diào)控植物開(kāi)花機(jī)制的多樣性，也能為蠟梅觀賞性狀改良提供更多線索。

研究顯示，UFO在不同物種組織間廣泛表達(dá)。在擬南芥、油松（Pinus tabuliformis）以及樟樹(shù)中，UFO基因在營(yíng)養(yǎng)組織和生殖組織中均有表達(dá)，但其表達(dá)量在時(shí)空上呈現(xiàn)顯著差異，與花發(fā)育的表達(dá)模式密切相關(guān)。如擬南芥UFO表達(dá)主要集中在中心區(qū)域，且隨花發(fā)育的進(jìn)行，在空間上表現(xiàn)出精確的界限，最后僅局限于花瓣原基區(qū)域（Ingramet al.，1995）；油松UFO同源基因PtUFO2主要在雌雄球花中表達(dá)，且表達(dá)量均在雌雄球花的花發(fā)育初始階段達(dá)到最高（袁露，2015）；樟樹(shù)CcUFO在花苞中表達(dá)量最高，作用于花發(fā)育早期階段，促進(jìn)早花（周琴，2016）。在本研究中，CpUFO同樣廣泛表達(dá)于蠟梅不同組織，在花器官中，尤其是外花被片中表達(dá)量達(dá)到最高；同時(shí)CpLFY表達(dá)量也顯示在外花被片中達(dá)到最高，這可能與花器官形成與正常發(fā)育相關(guān)，符合UFO基因功能在不同物種間具有保守性這一結(jié)論，即UFO激活LFY，UFO與被激活的LFY相互作用進(jìn)一步激活B類(lèi)MADS-box基因（Ikedaet al.，2007; Soueret al.，2008）。在全年不同發(fā)育階段花芽中，CpUFO在露瓣、始花和盛開(kāi)期表達(dá)量相對(duì)最高，這與樟樹(shù)花發(fā)育表達(dá)模式相似（周琴，2016）。由此推測(cè)，CpUFO可能參與蠟梅開(kāi)花調(diào)控及花器官發(fā)育。

在蠟梅CpUFO過(guò)表達(dá)擬南芥的表型觀察中發(fā)現(xiàn)，35S::CpUFO/擬南芥出現(xiàn)蓮座葉減少、開(kāi)花提前的現(xiàn)象，與擬南芥中異位表達(dá)樟樹(shù)CcUFO表型觀察結(jié)果一致（周琴，2016）；在35S::CpUFO/擬南芥株系與WT株系內(nèi)源基因相對(duì)表達(dá)量分析中發(fā)現(xiàn)，CpUFO的超量表達(dá)，引起了擬南芥B類(lèi)功能基因AP3的表達(dá)，同時(shí)，擬南芥中成花抑制因子TFL1下調(diào)，從而上調(diào)其下游基因AP1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花分生組織的形成、提早開(kāi)花，同已報(bào)道的擬南芥中的研究結(jié)果一致（Takahashiet al.，2004; Blumelet al.，2015）；UFO蛋白可通過(guò)參與修飾LFY蛋白，來(lái)增強(qiáng)LFY的轉(zhuǎn)錄活性（Chaeet al.，2008）；同時(shí)，TFL1在擬南芥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過(guò)程中對(duì)LFY具有負(fù)調(diào)控作用（王利琳等，2004; Zhuet al.，2020），但在本研究中，LFY的表達(dá)量并無(wú)顯著變化。前人的研究發(fā)現(xiàn)，UFO同源基因在參與花發(fā)育過(guò)程中具有保守性（Levinet al.，1995;Ingramet al.，1997; Ikeda et al.，2007），但在本試驗(yàn)中，CpUFO的超量表達(dá)除促進(jìn)轉(zhuǎn)基因株系中雌蕊柱的伸長(zhǎng)外，并未見(jiàn)明顯的花器官身份改變，推測(cè)是CpUFO活性在擬南芥中受限所致（Kusterset al.，2015）。綜上所述，35S::CpUFO/擬南芥表型及其內(nèi)源基因相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果與擬南芥UFO激活花器官?zèng)Q定基因、觸發(fā)花發(fā)育及TFL1參與成花抑制功能研究結(jié)果相似（Shannonet al，1991; Ohshimaetal.，1997;Zhaoet al.，2001; Hananoet al，2011; Risseeuwet al.，2013），推測(cè)CpUFO基因能夠促進(jìn)蠟梅開(kāi)花，但其分子作用機(jī)制還需深入研究。

4 結(jié)論

本研究克隆得到蠟梅CpUFO基因全長(zhǎng)cDNA序列為1 665 bp，編碼403個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，CpUFO與無(wú)油樟聚為一支，進(jìn)化地位較低，但結(jié)構(gòu)域比較保守，具有F-box家族典型的F-box基序。35S::CpUFO過(guò)表達(dá)擬南芥研究結(jié)果顯示，CpUFO可能促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，形成早花，同時(shí)參與調(diào)控花器官的發(fā)育，這為闡明蠟梅花發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制提供一定參考。