廖元淏， 王帥， 陳婉慧， 馮華杰， 陳光英， 何文英*

（1. 熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 海口 571158；2. 海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 海南 ?？?571158）

1 引言

許多重金屬離子如Cd2+、Cr2+、Hg2+、Pb2+等不僅對(duì)人體有害，分布在水體或土壤中也不能分解或降解[1-2]。 其中Hg2+就是一種很典型的重金屬污染物，可在水中被微生物轉(zhuǎn)化為甲基汞，通過食物鏈進(jìn)入人體并在人體內(nèi)蓄積，生物體攝入后可導(dǎo)致正常的生理功能紊亂，引起消化道、腎臟、大腦或神經(jīng)系統(tǒng)等的病變；汞沉入水中后可經(jīng)過水生食物鏈快速積累，對(duì)水體環(huán)境造成極大的污染[3-4]。次氯酸/次氯酸（HOCl/ClO-）在日常生活中可用于殺菌、染料脫色、土壤氧化污染的處理等；在生物體內(nèi)控制參與多種生理過程, 如組織修復(fù)、細(xì)胞生命周期和防御系統(tǒng)中的抗菌活性等。但過量的ClO-會(huì)導(dǎo)致如肺部病變、心血管疾病或動(dòng)脈粥樣硬化等多種人體疾病[5-6]。因而通過研究新合成的1, 2, 3-三氮唑衍生物對(duì)汞離子或ClO-的特征顯色識(shí)別和建立在生理?xiàng)l件下檢測(cè)這兩種離子的方法，實(shí)現(xiàn)在活體細(xì)胞中的應(yīng)用，對(duì)環(huán)境和人類的生命安全具有非常重要的理論與實(shí)際意義。

離子的檢驗(yàn)方法多種多樣，取決于所要檢測(cè)的離子種類以及分析的具體需求。常見的離子檢驗(yàn)方法：滴定法（Titration），原子吸收光譜法, 離子選擇性電極法（Ion-selective electrode, ISE）, 質(zhì)譜法，色譜法,電化學(xué)法[7-8]。而熒光光譜法具有良好的生物相容性、較低的毒性和易于結(jié)構(gòu)修飾而得到廣泛的發(fā)展，其作為一種分析工具, 具有選擇性高、操作簡單、消耗少、成本低等優(yōu)點(diǎn), 在生物成像方面應(yīng)用最為廣泛，可對(duì)化學(xué)及生物樣品進(jìn)行定性和定量測(cè)定，在藥學(xué)、農(nóng)學(xué)、食品工業(yè)等領(lǐng)域已有眾多的應(yīng)用[2-6,9-10]。羅丹明類化合物是具有獨(dú)特“開-關(guān)”結(jié)構(gòu)的熒光化合物。當(dāng)金屬離子被識(shí)別時(shí)，螺內(nèi)酰胺環(huán)除具有優(yōu)異的光化學(xué)和光物理性質(zhì)外，還具有特定的電子重排形成一個(gè)大而穩(wěn)定的剛性平面，在這個(gè)過程中熒光和顏色的變化是肉眼識(shí)別的基礎(chǔ)。羅丹明類衍生物因具有摩爾消光系數(shù)高、光穩(wěn)定性好、熒光量子產(chǎn)率高、較大的激發(fā)和發(fā)射波長等優(yōu)異的光學(xué)性能，被廣泛地應(yīng)用于離子探針的設(shè)計(jì)[11-13]。近年來，具有雙功能的熒光探針也越來越受到關(guān)注, 可用來同時(shí)檢測(cè)生物體等樣品中的陰陽離子或其他小分子[14-15]。

1,2,3-三氮唑是一類非常重要的含氮雜環(huán)化合物，具有如抗菌、抗結(jié)核病、抗病毒、抗瘧疾、抗腫瘤等多種生物活性[16]，易與其他取代基合成多種類型的衍生物，在有機(jī)化學(xué)、材料化學(xué)、環(huán)境科學(xué)及醫(yī)藥學(xué)等方面已顯示出其特有的物理化學(xué)性質(zhì)、藥理活性和廣闊的應(yīng)用前景[17-18]。有些合成的三氮唑衍生物可與某些金屬離子特異性鍵合，顯示如良好的催化性等多方面的功能[9,19-20]，尤其是一些金屬離子與三氮唑通過發(fā)生不同的顯色反應(yīng)，可作為金屬離子的探針進(jìn)行定性或定量分析，在化學(xué)、生物、環(huán)境科學(xué)及其他領(lǐng)域具有眾多應(yīng)用[21]。因此，基于1，2，3-三氮唑的低毒性和良好生物活性，開發(fā)1,2,3-三氮唑-羅丹明類熒光探針具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

本文通過點(diǎn)擊化學(xué)方法合成了一種新的1,2,3-三氮唑羅丹明B衍生物L(fēng)2。L2具有檢測(cè)兩種陰陽離子的熒光探針性質(zhì)；探針L2不僅顯示出良好的熒光性能，且對(duì)Hg2+和ClO-有高選擇性和靈敏性的識(shí)別；并可用于HeLa細(xì)胞中Hg2+和ClO-的細(xì)胞成像。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

測(cè)試儀器：400 MHz AV-400型超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），1H NMR和13C NMR分別以CDCl3-d/DMSO-d6為溶劑, 以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)參照；Agilent 1100-Bruker Esquire HCT高分辨質(zhì)譜儀（美國Agilent公司-德國Bruker公司離子質(zhì)量分析器）；U3900/3900H紫外可見光分光光度計(jì)（日本日立公司）；F-7000熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）; MCO-15A型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO）；Nikon TS100-F倒置熒光顯微鏡（日本尼康）；SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)（蘇潔凈化）；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar公司）；PHSJ-3F型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為商品化的分析純或化學(xué)純產(chǎn)品, 未經(jīng)純化直接使用。所使用的超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。19種金屬離子Hg2+、Ag+、W6+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、Ca2+、Mn2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Mo6+、K+、Mg2+、Ni2+、Na+、Pd2+、Sn4+和14種陰離子ClO-、S2-、SCN-、CN-、CO32-、SO42-、ACO-、NO2-、NO3-、Br-、F-、Cl-、ClO2-濃度均為1000 μg/mL，購自國藥化學(xué)試劑公司，均不含結(jié)晶水。其中，Mo6+所用緩沖溶液為H2O/tr.NH4OH，W6+所用緩沖溶液為0.2%（v/v）HNO3和2%（v/v）HF，Hg2+、Cd2+和Pb2+所用緩沖溶液均為HNO3（1.0 mol/L），Ag+、Pd2+和Sn4+所用緩沖溶液均為5%（v/v） HNO3，Cu2+和Co2+所用緩沖溶液均為3%（v/v） HNO3，Ca2+和Mg2+所用緩沖溶液均為5%HCl，F(xiàn)e3+、Zn2+和Al3+所用緩沖溶液均為10% HCl，Ni2+所用緩沖溶液均為2%（v/v） HNO3，Mn2+所用緩沖溶液為5%（v/v） H2SO4，其他的陽離子和陰離子所用的緩沖溶液均為H2O。人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞由海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，DMEM培養(yǎng)基及噻唑藍(lán)購自北京索萊寶公司，胎牛血清購自浙江天杭生物公司。

2.2 探針L2的合成路線及方法

首先合成了2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二乙酸乙酯，再通過偶聯(lián)反應(yīng)生成了2-苯基-2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二乙酸乙酯，然后經(jīng)過水解、酰氯反應(yīng)、與羅丹明酰肼的酰胺縮合反應(yīng)等，合成了化合物L(fēng)2（圖1）。

圖1 探針L2的合成Fig.1 Synthesis of the probe L2

2.2.1 2H-1，2，3-三氮唑-4，5-二乙酸乙酯的合成

稱取2.5 g（14.69 mmol）丁炔二酸二乙酯在250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL二甲基亞砜作溶劑，在室溫下攪拌半小時(shí)后，再稱取1.91 g（29.38 mmol）NaN3緩慢加入圓底燒瓶中，然后升溫至80 ℃，通過TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，冷卻至室溫，緩慢加入100 mL次氯酸鈉水溶液攪拌猝滅反應(yīng)，然后使用3 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為2左右，反應(yīng)體系顏色由深棕色變?yōu)榧t色；使用乙酸乙酯和水萃取，有機(jī)相使用飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，柱層析PE/EA=2∶1，即可得到黃色油狀液體。1H NMR（400 MHz, 氘代氯仿）δ分別為4.47（q,J= 7.1 Hz, 4H）, 1.41（t,J=7.1 Hz, 6H） （補(bǔ)充文件圖S1），13C NMR（101 MHz, 氘代氯仿）δ分別為160.36, 139.20, 62.90,14.54 （補(bǔ)充文件圖S2）。

2.2.2 2-苯基-1，2，3-三氮唑-4，5-二羧酸的合成

稱取2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二乙酸乙酯1.60 g（7.50 mmol）到100 mL圓底燒瓶中，加入1.20 g（15 mmol）吡和40 mL 四氫呋喃，攪拌均勻，稱取1.36 g（7.5 mmol）醋酸銅到圓底燒瓶中，再稱取1.83 g（15.0 mmol）苯基硼酸緩慢加入圓底燒瓶中，使整個(gè)體系處于氧氣環(huán)境下，然后升溫至60 ℃反應(yīng)12 h，通過TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用乙酸乙酯萃取，再用無水硫酸鈉干燥，柱層析PE/EA=10∶1，粗品加入無水乙醇40 mL，稱取0.84 g（15 mmol）氫氧化鉀固體，攪拌均勻后加熱回流3 h。通過TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束，旋蒸后加熱少量水以溶解產(chǎn)物。再使用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1，出現(xiàn)大量白色固體析出，抽濾，干燥后即可得到白色固體產(chǎn)物。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ分別為8.05（d,J= 7.6 Hz, 2H）,7.62（t,J= 7.8 Hz,2H）, 7.53（t,J= 7.4 Hz, 1H）（補(bǔ)充文件圖S3），13CNMR（101 MHz, DMSO-d6）δ分別為161.69,142.18, 138.88, 130.42, 129.79, 119.85（補(bǔ)充文件圖S4）。

2.2.3 2-苯基-1，2，3-三氮唑-4，5-二酰氯的合成

稱取200 mg的2-苯基-三氮唑-4,5-羧酸，然后加入2 mL過量氯化亞砜，加熱回流3 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，蒸出多余的氯化亞砜，即可得到白色固體產(chǎn)物，粗品直接用于下一步。

2.2.4 羅丹明B酰肼的合成

參照文獻(xiàn)[22]，在100 mL圓底燒瓶中，分別加入30 mL乙醇與5.0 g（10.5 mmol）羅丹明B，在室溫下劇烈攪拌，然后緩慢滴入80%的水合肼（12 mL）。滴加結(jié)束，攪拌回流，TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢后，冷卻溶液，再減壓蒸去乙醇。在燒瓶中加入1 mol/L的HCl 50 mL，得到橙紅色溶液；在不斷攪拌下，慢慢加入1 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH到9～10之間至出現(xiàn)大量白色沉淀；進(jìn)行抽濾后用少量水洗滌濾餅3次；再通過真空干燥，得到羅丹明B酰肼。1H NMR（400 MHz,DMSO-d6）δ分別為7.76（d,J= 5.8 Hz, 1H）, 7.53～7.41（m, 2H）, 6.98（d,J= 5.9 Hz, 1H）, 6.35（d,J= 16.6 Hz, 6H）, 4.26（s, 2H）, 3.33～3.25（m, 8H）, 1.08（t,J= 7.0 Hz,12H）（補(bǔ)充文件圖S5）；13C NMR（101 MHz, DMSOd6）δ分別為165.82,153.49,152.33,148.60,132.89, 128.60, 128.13, 123.93, 122.65, 108.27,105.83, 97.89, 65.28, 44.16, 12.90（補(bǔ)充文件圖S6）。

2.2.5 探針L2的合成

將上述2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯粗品稱取0.23 g（0.85 mmol），加入10 mL二氯甲烷攪拌溶解后，緩慢加入0.77 g（1.7 mmol）的羅丹明B酰肼，然后再滴加過量三乙胺作縛酸劑，常溫下攪拌12 h以上。通過TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，除去溶劑二氯甲烷后用乙酸乙酯萃取，再用無水硫酸鈉干燥，柱層析PE/EA=1∶1，即可得到白色固體產(chǎn)物L(fēng)2（產(chǎn)率34%）（如圖1）。1H NMR（400 MHz, 氘代氯仿）δ分別為10.00（s, 2H）,7.93（m,3J= 9.5,6.8, 1.8 Hz, 4H）,7.48～7.41（m, 4H）,7.39～7.34（m, 3H）, 7.10～7.05（m, 2H）, 6.75（d,J= 8.8 Hz,4H）, 6.32（s, 4H）, 6.26（d,J= 8.2 Hz, 4H）, 3.24（d,J= 6.9 Hz, 16H）, 1.08（t,J= 7.0 Hz, 24H）（補(bǔ)充文件圖S7）；13C NMR（101 MHz, CDCl3）δ164.46（s）,157.44（s）, 153.43（s）, 152.71（s）,152.65（s）,148.93（s）,139.87（s）,138.44（s）,133.05（s）, 133.03（s）,129.27（s）,128.88（s）,128.03 （s）, 123.87（s）,123.47（s）,120.03（s）,114.25（s） 107.94（s）, 104.23（s）, 97.87（s）44.31（s）, 12.67（s）（補(bǔ)充文件圖S8）。質(zhì)譜檢測(cè)HRMSm/z（[M+H]+）: 計(jì)算值1110.5276; 實(shí)驗(yàn)值:1110.5261（補(bǔ)充文件圖S9）。

2.3 實(shí)驗(yàn)試劑配制

標(biāo)準(zhǔn)離子的配制：取一定體積Hg2+、Ag+、W6+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、Ca2+、Mn2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Mo6+、K+、Mg2+、Ni2+、Na+、Pd2+、Sn4+金屬陽離子標(biāo)準(zhǔn)溶液和ClO-、S2-、SCN-、CN-、CO32-、SO42-、AcO-、NO2-、NO3-、Br-、F-、I-、Cl-、ClO2-陰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，加去離子水定容配制為1.0×10-3mol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

探針L2溶液的配制：稱取55.5 mg的探針L2于50 mL的容量瓶中，使用DMSO定容配制為1.0×10-3mol/L的溶液。

細(xì)胞相關(guān)溶液的配制：DMEM完全培養(yǎng)基：購買市售培養(yǎng)基溶液，按總體積10%的體積加入滅活的胎牛血清，再加入1%的雙抗；PBS緩沖液：使用電子分析天平稱取NaCl：8.0 g，KCl：0.2 g，KH2PO4：0.24 g，Na2HPO4：1.44 g，用超純水定容1 L，在120 ℃高壓滅菌器中滅菌30 min；胰蛋白酶：使用電子分析天平結(jié)晶胰島素粉末2.50 g，高壓滅菌后的PBS緩沖液1 L，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，?.22 μmol/L的滅菌過濾器過濾溶液進(jìn)行滅菌；MTT溶液：使用電子分析天平稱取MTT粉末0.50 g，用PBS緩沖液100 mL充分溶解后，分裝在1.5 mL EP離心管中，放置-5 ℃冰箱中避光冷凍待用。

2.4 光譜實(shí)驗(yàn)測(cè)定

紫外吸收光譜測(cè)定：設(shè)置波長掃描范圍為250～700 nm，掃描速度為快，掃描間隔為1 nm，取60 μL DMSO到1 cm石英比色皿中，再加入60 μL的探針（1.0×10-3mol/L），用DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v）緩沖溶液或甲醇溶液定容3 mL，進(jìn)行波長掃描，再分別逐漸加入Hg2+或ClO-進(jìn)行測(cè)定。

熒光光譜測(cè)定：設(shè)置激發(fā)波長為560 nm（檢測(cè)Hg2+）和555 nm（檢測(cè)ClO-）, 掃描發(fā)射波長為570～700 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm，電壓為700 V，響應(yīng)時(shí)間為0.1 s 掃描速度為1200 nm/min。取60 μL的探針（1.0×10-3mol/L），用DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v）緩沖溶液定容3 mL，進(jìn)行波長掃描。

2.5 理論計(jì)算

所有幾何優(yōu)化和能量計(jì)算都是使用B3LYP泛函在Gaussian 09中進(jìn)行的，采用密度泛函理論DFT方法在6-311G（d）基組下進(jìn)行了基態(tài)的全優(yōu)化, 用含時(shí)密度泛函TD-DFT對(duì)最低激發(fā)態(tài)的構(gòu)型進(jìn)行全優(yōu)化，Hg的基集為LANL2TZ, H、C、N和O的基集為6-311G（d）[23]。

2.6 細(xì)胞毒性測(cè)定

將HeLa細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞凍存、細(xì)胞傳代處理，取對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104/孔；將DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液加入到96孔板中，每孔100 μL，在37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；按梯度濃度將L2濃度調(diào)整為0,10,20,40,60,80,100 μmol/L，使得DMSO加入的體積在細(xì)胞中含量小于4‰即可。依此方法將HeLa細(xì)胞分為空白組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組按照上述濃度梯度每孔加入100 μL，空白組只加培養(yǎng)液100 μL，每個(gè)濃度均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔；然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT試劑，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使得MTT還原成藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚；棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO輕微震蕩使其充分溶解；通過酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算L2對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性。

2.7 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)液加入到35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸取培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞3次；加入探針L2（20 μmol/L）培育1 h后，用PBS沖洗3次；除去未進(jìn)入細(xì)胞的探針，隨后分別加入濃度均為20 μmol/L Hg2+和ClO-溶液，繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h后，用PBS洗滌3次后，進(jìn)行熒光成像。

3 結(jié)果與討論

3.1 紫外-可見光譜分析

通過分析有機(jī)化合物的紫外光譜可初步獲得分子層面的結(jié)構(gòu)信息。為篩選探針L2對(duì)不同金屬離子和陰離子溶液中的識(shí)別能力，在DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v, 20 μmol/L）溶液中，分別測(cè)定了L2對(duì)Hg2+、Ag+、W6+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、Ca2+、Mn2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Mo6+、K+、Mg2+、Ni2+、Na+、Pd2+、Sn4+作用的紫外吸收光譜（見圖2（a）），以及在甲醇溶液中對(duì)ClO-、S2-、SCN-、CN-、CO32-、SO42-、AcO-、NO2-、NO3-、Br-、F-、I-、Cl-、ClO2-作用的紫外吸收光譜（見圖2（b））。由于探針L2為無色溶液，故選擇純水做空白參比。從圖2可以看出，在設(shè)置波長為400～700 nm范圍內(nèi)，吸收峰的起止波長和加入前后最大吸收波長處強(qiáng)度的變化不大，L2+Hg2+體系在565 nm處有最大紫外吸收峰，L2- ClO-體系在555 nm處有最大紫外吸收峰，說明Hg2+和ClO-的存在使得L2的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化而產(chǎn)生了兩個(gè)新的吸收峰。同時(shí)，兩組不同溶液體系的顏色由無色透明液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，而其他離子的加入不會(huì)引起溶液中明顯的顏色變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針L2對(duì)Hg2+和ClO-具有較高的選擇性，L2與Hg2+或ClO-的相互作用影響了羅丹明基團(tuán)的吸收，導(dǎo)致其螺環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生開環(huán)，使得在565 nm和555 nm處出現(xiàn)吸收增強(qiáng)的現(xiàn)象。

圖2 （a）在DMF/Tris-HCl溶液（1∶1，v/v，pH=6.0）中，不同金屬離子存在時(shí)，L2 （20 μmol/L）的紫外可見吸收光譜；（b）在MeOH溶液中，不同陰離子存在時(shí)，L2 （20 μmol/L）的紫外可見吸收光譜Fig.2 （a）UV-Vis spectra of L2（20 μmol/L） in the presence of different metal ions（20 μmol/L） in DMF/Tris-HCl（1∶1， v/v，pH=6.0）. （b）UV-Vis spectra of L2（20 μmol/L） in the presence of different anions（20 μmol/L） in MeOH

3.2 熒光光譜分析

為探究L2和不同陰陽離子的熒光性質(zhì)，在DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v, 20 μmol/L）溶液中測(cè)定了L2與各種金屬離子的熒光光譜，以及在MeOH溶液中L2與各種陰離子的熒光光譜，所有加入離子濃度均為等量（見圖3）。從圖3可見，當(dāng)激發(fā)波長為563 nm時(shí)，L2沒有出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰，這也是羅丹明結(jié)構(gòu)的一個(gè)典型特點(diǎn)；但當(dāng)其與不同的陰陽離子相互作用時(shí)，只有Hg2+使體系的熒光強(qiáng)度在585 nm處出現(xiàn)明顯增強(qiáng)（圖3（a）），也只有ClO-使體系的熒光強(qiáng)度在576 nm處有顯著增大（圖3（b）），而其他金屬離子或陽離子幾乎沒有帶來變化。同時(shí)，伴隨著熒光光譜峰型和強(qiáng)度的變化，只有Hg2+-L2體系或ClO--L2體系的顏色也呈現(xiàn)出裸眼可見的粉紅色溶液（如圖2中插圖所示），而在相同條件下的其他離子-L2體系則沒有顏色的變化。這再次表明探針L2在兩種溶液體系中對(duì)Hg2+和ClO-具有高選擇性和特異性。通常情況下，具有閉環(huán)酰肼結(jié)構(gòu)的羅丹明及其衍生物是無色或非熒光的，而開環(huán)酰肼結(jié)構(gòu)的羅丹明可產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光并伴隨溶液呈現(xiàn)粉色的顏色變化[24-25]。據(jù)此推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中Hg2+或ClO-可能使L2分子中的羅丹明基團(tuán)從閉環(huán)的酰肼結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為開環(huán)的酰肼結(jié)構(gòu)，從而形成了Hg2+-L2或ClO--L2兩種新的配合物，也導(dǎo)致溶液有粉色的變化。

圖3 （a）在DMF/Tris-HCl（1∶1，v/v）中，L2（20 μmol/L）和不同金屬離子（20 μmol/L）存在的熒光光譜，λex=560 nm；（b）MeOH中，L2（20 μmol/L）和不同陰離子（20 μmol/L）存在的熒光光譜，λex=555 nmFig.3 Fluorescence spectra of L2（20 μmol/L） in the presence of different metal ions（20 μmol/L） in DMF/Tris-HCl（1∶1，v/v）（a）（λex=560 nm） and in the presence of different anions（20 μmol/L） in MeOH（b）（λex=555 nm）， respectively

3.3 探針L2對(duì)Hg2+和ClO-的選擇性和抗干擾性分析

優(yōu)良的選擇性也是熒光探針的重要性能之一。圖4為探針L2分別對(duì)Hg2+（圖4（a））和ClO-（圖4（b））的選擇性實(shí)驗(yàn)。圖4（a）為在DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v, pH=6.0，20 μmol/L）溶液中，加入金屬離子（Hg2+、Ag+、W6+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、Ca2+、Mn2+、Cd2+、CO2+、Fe3+、Mo6+、K+、Mg2+、Ni2+、Na+、Pd2+、Sn4+）時(shí)測(cè)定不同體系的熒光強(qiáng)度，可看出僅僅當(dāng)Hg2+與 L2相互作用時(shí)，在585 nm處的熒光強(qiáng)度約為1500，且溶液顏色呈現(xiàn)粉紅色；而加入其他金屬離子后，這些體系的熒光強(qiáng)度則沒有顯示出明顯的增大和顏色的變化。從圖4（b）可看出，ClO-與L2相互作用也發(fā)生相似的情況，在甲醇（20μmol/L）溶液中加入不同的陰離子（ClO-、S2-、SCN-、CN-、CO32-、SO42-、ACO-、NO2-、NO3-、Br-、F-、I-、Cl-、ClO2-）時(shí)，在576 nm處的熒光強(qiáng)度約為1100，且溶液顏色呈現(xiàn)較深的粉紅色，而加入其他陰離子后的體系則沒有引起明顯的熒光強(qiáng)度和顏色變化。這些結(jié)果表明，相比實(shí)驗(yàn)中絕大多數(shù)的陰陽離子，L2對(duì)Hg2+和ClO-有較高的選擇性，可以特異性地裸眼識(shí)別Hg2+和ClO-。

另外，由于L2是分別在DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v,pH 6.0, 20 μmol/L）和MeOH（20 μmol/L）溶液中對(duì)Hg2+和ClO-顯示出高選擇性和靈敏性，盡管L2-Hg2+和L2-ClO-體系的最大熒光強(qiáng)度分別在585 nm處（圖3（a））和576 nm（圖3（b）），但不同溶劑的體系可以避免同時(shí)測(cè)定Hg2+和ClO-時(shí)的相互干擾效應(yīng)。

為評(píng)估探針在共存離子情況下的抗干擾性，進(jìn)行了離子競爭實(shí)驗(yàn). 分別在有探針L2存在的DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v, 20 μmol/L）溶液中加入Hg2+和MeOH（20 μmol/L）溶液中加入ClO-測(cè)試體系的熒光強(qiáng)度，再分別加入等量的同離子再測(cè)試其熒光強(qiáng)度（圖5）。從圖5可看出，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，加入Hg2+和ClO-體系中測(cè)得的熒光強(qiáng)度和其他金屬離子或陰離子與Hg2+或ClO-共存時(shí)不同體系的熒光強(qiáng)度有略微的波動(dòng)，但變化不大，說明這些離子的存在對(duì)探針檢測(cè)Hg2+和ClO-沒有明顯的干擾。因此，探針L2可以作為高選擇性的Hg2+和ClO-熒光探針。

圖5 （a）在DMF/Tris-HCl（1∶1，v/v，pH=6.0）中，L2對(duì)Hg2+（20 μmol/L）及與其他離子（20 μmol/L）共存時(shí)的熒光強(qiáng)度，λex=560 nm；（b）在MeOH（20 μmol/L）中，L2對(duì)ClO-（20 μmol/L）及與其他離子（20 μmol/L）共存時(shí)的熒光強(qiáng)度，λex=555 nmFig.5 （a）The fluorescent selectivity of L2 toward Hg2+（20 μmol/L） coexisting with other metal ions（20 μmol/L） in DMF/Tri-HCl（1∶1， v/v， pH=6.0）， λex=560 nm. （b）The fluorescent selectivity of L2 toward ClO-（20 μmol/L） coexisting with other anions（20 μmol/L） in MeOH， λex=555 nm

3.4 探針L2對(duì)Hg2+和ClO-的定量分析

基于以上紫外和熒光光譜的定性分析結(jié)果，暗示L2可以被開發(fā)利用作為定量分析Hg2+和ClO-的一種新型探針。我們首先評(píng)估了pH值對(duì)探針L2熒光強(qiáng)度的影響，由于本研究檢測(cè)Hg2+時(shí)使用DMF/H2O（1∶1）體系，而檢測(cè)ClO-時(shí)在MeOH體系完成，因此以下只分析L2與Hg2+體系的pH值適用范圍。我們測(cè)試了L2和Hg2+-L2體系在pH值3.0～10.0范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化曲線（補(bǔ)充文件圖S10），從圖S10可見，在pH＜4.0的較強(qiáng)酸性條件下，L2本身會(huì)產(chǎn)生微弱熒光；而在4.0＜pH＜10.0范圍內(nèi)，L2的熒光愈加減弱并接近消失。這些結(jié)果表明，在pH值3.0～10.0范圍內(nèi)，L2結(jié)構(gòu)中的羅丹明是一種閉環(huán)的酰肼結(jié)構(gòu)。相應(yīng)地，當(dāng)在L2中加入Hg2+后，pH值在3.0～7.0范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度很高，尤其是pH=6.0時(shí)熒光強(qiáng)度最大。雖然pH在6.0～7.0之間體系的熒光強(qiáng)度有所降低，但均說明L2結(jié)構(gòu)中的羅丹明酰肼鍵處于開環(huán)狀態(tài)。當(dāng)pH值從7.0調(diào)節(jié)為8.0時(shí)，體系熒光強(qiáng)度驟然下降到幾乎沒有熒光，這可能是因?yàn)镺H-跟Hg2+結(jié)合形成了沉淀，而無法跟L2發(fā)生絡(luò)合。因此，本研究中所有的光譜實(shí)驗(yàn)均選擇在pH值為6.0的DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v）溶液體系中進(jìn)行。另外，選擇熒光光譜分析的時(shí)間-熒光強(qiáng)度模式，測(cè)定了L2對(duì)Hg2+和ClO-的響應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定時(shí)間（補(bǔ)充文件圖S11）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)體系發(fā)生顯色反應(yīng)的時(shí)間很短，且L2與Hg2+或ClO-作用后比較穩(wěn)定，在1800 s內(nèi)熒光強(qiáng)度沒有發(fā)生明顯的增加或下降趨勢(shì)，這說明探針L2可以在水溶液或甲醇溶液中對(duì)Hg2+或ClO-進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。

良好的靈敏度是離子探針的一個(gè)重要指標(biāo)。通過熒光滴定實(shí)驗(yàn)確定探針L2對(duì)Hg2+和ClO-的靈敏度。分別在存在L2（20 μmol/L）的DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v, 20 μmol/L）、MeOH溶液中，逐漸加入濃度梯度的Hg2+或ClO-進(jìn)行熒光測(cè)試（圖6）。從圖6可以看出，隨著Hg2+或ClO-濃度的增加，探針L2-Hg2+體系在585 nm處的熒光在逐漸增強(qiáng)，這可能是由于探針L2對(duì)Hg2+發(fā)生配位反應(yīng)，發(fā)生內(nèi)酰胺開環(huán)釋放熒光；而ClO-的氧化作用也可以使得L2斷鍵在576 nm處釋放熒光。圖6中的兩個(gè)插圖表明L2與Hg2+（5.0～26.7 μmol/L,R2=0.9802）、L2與ClO-（3.33 μmol/L～0.7 mmol/L,R2=0.9959）分別存在兩種線性相關(guān)關(guān)系。根據(jù)相關(guān)公式CL= 3σ/K（其中，CL為檢出限，σ為測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）, 計(jì)算出L2對(duì)Hg2+的檢出限為7.45 nmol/L，對(duì)ClO-的檢出限為0.67 μmol/L. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針L2對(duì)Hg2+和ClO-的檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可以用來檢測(cè)環(huán)境或生物樣品中這兩種有害離子的含量。

圖6 （a）在DMF/Tris-HCl（1∶1， v/v， pH=6.0）中，λex=560 nm，隨著Hg2+濃度（濃度變化對(duì)應(yīng)數(shù)值：0，3.3，4.9，6.6，8.3，9.9，11.5，13.1，14.7，16.3，18.0，19.1，22.8，25.9，29.1，32.2，38.4，44.5，50.6，56.6，62.5，66.7μmol/L）增加，探針L2 （20 μmol/L）的熒光光譜；（b）在MeOH中，λex=555 nm，隨著ClO-濃度（濃度變化對(duì)應(yīng)數(shù)值：0，3.33，10.0，16.6，33.3，66.6，100， 133.3，200，366.6，533.3，700，866.6，1033.3，1200， 1366.6 μmol/L）增加，探針L2（20 μmol/L）的熒光光譜，其中的插圖分別為L2與Hg2+和L2與ClO-的線性關(guān)系Fig.6 Fluorescence spectra of L2（20 μmol/L） with the increasing concentration of Hg2+（0-66.7 μmol/L） in DMF/Tris-HCl（1∶1， v/v， pH=6.0）（a）（λex=560 nm） and with the increasing concentration of ClO-（0-1.36 mmol/L） in MeOH（b） （λex=555 nm）， the linear relationship between L2 with Hg2+ and ClO-（inset）

3.5 L2響應(yīng)Hg2+或ClO-的機(jī)理推測(cè)

為闡明探針L2與Hg2+和ClO-的作用機(jī)理，分別采用質(zhì)譜分析、Job's plot等摩爾連續(xù)變化法、1H NMR核磁滴，研究該探針對(duì)Hg2+和ClO-的識(shí)別機(jī)制。

首先運(yùn)用質(zhì)譜儀器Aglient1100-Bruker的正離子模式測(cè)定探針與Hg2+和ClO-發(fā)生反應(yīng)后分子量的變化情況 （補(bǔ)充文件圖S12）。通過圖S9（a）可以看出，質(zhì)譜中m/z為1651.2，分子量與[L2+2Hg2++2NO3-+H2O]的分子量相匹配；在相同條件下，測(cè)定探針L2-ClO-的質(zhì)譜為圖S9（b），可看出質(zhì)譜中m/z為465.3，分子量與[RhB+Na+]的分子量465相吻合。對(duì)于L2-Hg2+體系，這些結(jié)果說明探針L2與Hg2+能夠產(chǎn)生熒光是兩者可能發(fā)生1∶2配位絡(luò)合的原因，該結(jié)果也與后面用等摩爾連續(xù)變化法測(cè)定的絡(luò)合比結(jié)果一致；對(duì)于L2-ClO-體系，ClO-可能通過氧化L2而導(dǎo)致其中羅丹明結(jié)構(gòu)中的酰肼鍵開環(huán)，進(jìn)而產(chǎn)生熒光。

另外，采用Bruker AV-400核磁儀器，以DMSO-d6為氘代溶劑，分別測(cè)定了L2及L2-Hg2+、L2-ClO-的1H NMR譜（見補(bǔ)充文件圖S13和圖S14）。從圖S9和圖S10分析，在單獨(dú)探針L2的氫譜中，氨基—NH的H信號(hào)化學(xué)位移為1.136×10-5左右，苯環(huán)上的氫的化學(xué)位移為（7.9～8.0）×10-6，（7.8～7.9）×10-6，（7.5～7.6）×10-6左右。對(duì)L2-Hg2+體系，當(dāng)加入Hg2+后，L2探針的—NH的H質(zhì)子信號(hào)1.128×10-5移動(dòng)，苯環(huán)上的氫的化學(xué)位移變?yōu)椋?.75～8.0）×10-6，（7.5～7.75）×10-6左右。探針的—NH的H質(zhì)子信號(hào)化學(xué)位移向高場1.128×10-5移動(dòng)，苯環(huán)上氫由（7.8～7.9）×10-6向高場移動(dòng)說明可能是Hg2+的加入使其化學(xué)環(huán)境發(fā)生了改變。Hg2+加入可能使探針的內(nèi)酰胺發(fā)生開環(huán)（NH2和羰基參加配位后開環(huán)），C=O和氨基N原子與Hg2+絡(luò)合形成五元環(huán)，而這個(gè)五元環(huán)的形成導(dǎo)致氨基上的氫的化學(xué)環(huán)境改變，進(jìn)一步對(duì)苯環(huán)上的氫的環(huán)境產(chǎn)生影響導(dǎo)致苯環(huán)上的氫的化學(xué)位移向高場移動(dòng)，峰的裂分也受到影響。

對(duì)L2-ClO-體系，探針的—NH在1.136×10-5的H質(zhì)子信號(hào)消失，苯環(huán)上的氫的化學(xué)位移變?yōu)椋?.75～8.0）×10-6，（7.25～7.75）×10-6左右，且在8.30×10-6處出現(xiàn)了一個(gè)新峰，可能是由于電子轉(zhuǎn)移的原因，ClO-與L2發(fā)生了氧化作用使得—NH官能團(tuán)從探針L2中脫離，導(dǎo)致加入ClO-后探針L2中—NH的H質(zhì)子信號(hào)峰消失，從而打開了羅丹明的閉環(huán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了熒光，使得核磁結(jié)果產(chǎn)生了新的峰及峰的耦合變化，質(zhì)譜圖及數(shù)據(jù)也證實(shí)了羅丹明B的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明,L2對(duì)Hg2+或ClO-有不同的響應(yīng)機(jī)理。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證L2與Hg2+發(fā)生相互作用時(shí)可能的絡(luò)合比，采用等摩爾連續(xù)變化法[26]，分別配制L2/L2+Hg2+濃度比為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9的系列溶液，測(cè)定最大發(fā)射波長峰處的熒光強(qiáng)度（圖7）。圖7曲線表明，當(dāng)摩爾分?jǐn)?shù)約為0.34時(shí)，熒光強(qiáng)度有最大值，說明L2與Hg2+的配位絡(luò)合比為1∶2，與前面用質(zhì)譜測(cè)定的結(jié)果相一致。

圖7 探針L2-Hg2+的化學(xué)計(jì)量比的Job's plot圖Fig.7 Job's plot for determining the stoichiometry of L2 and Hg2+

為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用量子化學(xué)相關(guān)方法再次確證L2對(duì)Hg2+的作用機(jī)理。在Gaussian 09軟件中，采用基于B3LYP泛函的TD DFT方法，計(jì)算了L2和L2-Hg2+配合物的最高占據(jù)分子軌道（HOMO）和最低未占據(jù)分子軌道（LUMO），以此判斷L2和L2-Hg2+配合物的HOMO能級(jí)與LUMO能級(jí)之間是否發(fā)生相互作用及形成過渡態(tài)的主要原因；而能隙是LUMO軌道和HOMO軌道之間的能差，是影響化合物穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素[27]。補(bǔ)充文件中表S1為優(yōu)化的L2基態(tài)參數(shù)，表中的鍵角和鍵長數(shù)據(jù)表明L2為非平面的分子結(jié)構(gòu)；補(bǔ)充文件圖S11為探針L2與兩個(gè)Hg2+離子結(jié)合的優(yōu)化結(jié)構(gòu)，顯示出L2有足夠的空間來容納兩個(gè)Hg2+且可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。圖8為探針L2和L2-Hg2+配合物的前沿分子軌道，可看出L2和L2-Hg2+配合物的電子轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在由HOMO躍遷到LUMO，即表明它們具有熒光性質(zhì)，光譜實(shí)驗(yàn)也證明了該結(jié)果。計(jì)算出的L2的能隙值為3.50591 eV，L2+2Hg2+的能隙值為0.23129 eV，說明探針與2個(gè)Hg2+分子結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，能隙更小。因?yàn)閺?fù)合分子的能隙越小，極化越強(qiáng)，這與高的化學(xué)反應(yīng)活性和低的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性直接相關(guān)。電子由于具有較低的能隙，更容易被激發(fā)從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)從而產(chǎn)生熒光[27]，也再次從理論上確證了L2與Hg2+的配位絡(luò)合比為1∶2是合理的。

圖8 探針L2和L2-Hg2+配合物的基態(tài)LUMO、HOMO及其能隙前沿分子軌道Fig.8 The frontier molecular orbital of ground state on LUMO，the frontier molecular orbital of ground state on HOMO， and the HOMO-LUMO gap of L2 and L2-2Hg2+

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)分析了探針L2與Hg2+和ClO-響應(yīng)機(jī)制，如圖9所示。對(duì)于L2-Hg2+體系，沒有配合Hg2+時(shí)，結(jié)構(gòu)中的酰肼的閉環(huán)導(dǎo)致羅丹明本身的熒光猝滅；但有Hg2+存在時(shí)，L2可能通過C=O和氨基上的N原子與Hg2+配合形成穩(wěn)定的五元環(huán)，導(dǎo)致羅丹明螺旋環(huán)開環(huán)，使得探針發(fā)出熒光。對(duì)于L2-ClO-體系，L2與ClO-的響應(yīng)機(jī)制可能是L2的二芳基甲酰肼被ClO-氧化釋放二芳基甲酰二亞胺，產(chǎn)生羅丹明B結(jié)構(gòu)，從而引起探針L2中的螺旋環(huán)開環(huán)產(chǎn)生熒光[24]。這里，L2可以作為反應(yīng)基團(tuán)，其中的羅丹明B分子作為提供光信號(hào)的基團(tuán)，共同組成了一種熒光化學(xué)計(jì)量器來檢測(cè)Hg2+或ClO-。當(dāng)Hg2+或ClO-存在時(shí)，L2分子中羅丹明從閉環(huán)的酰肼鍵結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為開環(huán)的酰肼結(jié)構(gòu)，伴隨著肉眼可見的粉紅色顯色反應(yīng)發(fā)生。 雖然L2對(duì)Hg2+或ClO-有不同的響應(yīng)機(jī)理，但是很確定的結(jié)論是L2與Hg2+以1∶2的絡(luò)合比進(jìn)行反應(yīng)，前面的質(zhì)譜、1HNMR滴定、等摩爾連續(xù)變化都佐證了這個(gè)結(jié)論。

圖9 探針L2對(duì)Hg2+和ClO-響應(yīng)機(jī)理推測(cè)圖Fig.9 Proposed mechanism of the the probe L2 response to Hg2+ and ClO-

3.6 細(xì)胞毒性和細(xì)胞成像分析

作為一種含氮五元雜環(huán)化合物，1,2,3-三氮唑類衍生物在生物、醫(yī)藥、農(nóng)藥、超分子材料等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用，具有低毒及多種藥理活性[21,25,28]。考慮到探針L2可能被開發(fā)應(yīng)用在生物樣品中的Hg2+或ClO-測(cè)定，有必要對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞毒性和細(xì)胞成像的測(cè)定。首先利用MTT方法，將探針L2按梯度濃度調(diào)整為0，10，20，40，60，80，100 μmol/L，將HeLa細(xì)胞分為空白組和實(shí)驗(yàn)組，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的吸光值，計(jì)算L2干預(yù)下HeLa細(xì)胞的24 h后存活率（圖10）。從圖10可看出，探針L2在0～60 μmol/L濃度范圍內(nèi)，對(duì)HeLa細(xì)胞的存活率均在80%，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞低毒性，說明L2可以較好地運(yùn)用在細(xì)胞中用來檢測(cè)離子的存在，具有良好的生物實(shí)用性。

圖10 探針L2在HeLa細(xì)胞中孵育24 h后的細(xì)胞存活率Fig.10 Cell viability graph of L2 using HeLa cells incubating for 24 h

鑒于探針L2有較低的細(xì)胞毒性及對(duì)檢測(cè)Hg2+或ClO-有高選擇性，可進(jìn)一步開發(fā)是否能在生物樣品中應(yīng)用。將HeLa細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱的6孔板中培養(yǎng)24 h后，再加入探針L21（20μmol/L）孵育1 h，隨后分別向6孔板中加入含（20μmol/L）Hg2+和ClO-，繼續(xù)孵育1 h后，在熒光顯微鏡下捕獲熒光圖像（圖11）。如圖11所示，單獨(dú)探針L2的HeLa細(xì)胞沒有發(fā)出熒光，而加入Hg2+和ClO-明顯觀察到HeLa細(xì)胞發(fā)出紅色熒光。這說明探針L2不僅可以很好地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，有良好的膜滲透性，也顯示出熒光探針具備特異顯色的“開關(guān)”性質(zhì)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)探針的生物體內(nèi)應(yīng)用具有很重要的價(jià)值。

圖11 探針L2在HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞熒光成像：（a）單獨(dú)探針L2的明場圖；（b）探針L2與Hg2+的明場圖；（c）探針L2與ClO-的明場圖；（d）單獨(dú)探針L2的熒光圖；（e）探針L2與Hg2+的熒光圖；（f）探針L2與ClO-的熒光圖Fig.11 Fluorescence images of HeLa cells treated with L2： （a）bright-field images of the probe L2， （b）bright-field images of L2-Hg2+ system， （c）bright-field images of L2-ClO- system， （d）fluorescence images of the probe L2 ， （e）fluorescence images of L2-Hg2+ system， （f）fluorescence images of L2-ClO- system

4 結(jié)論

本文合成了基1,2,3-三氮唑化合物與羅丹明B酰肼構(gòu)建的雙功能熒光探針L2，分別在DMF/Tris-HCl（v/v=1∶1, pH=6.0）溶液中或MeOH溶液中可高選擇性地用于檢測(cè)溶液中的Hg2+和ClO-；并整合利用Job-plot、核磁滴定、質(zhì)譜確證了探針L2識(shí)別Hg2+和ClO-的響應(yīng)機(jī)制，兩種被測(cè)離子可將探針L2結(jié)構(gòu)中羅丹明分子的螺環(huán)閉環(huán)轉(zhuǎn)換為開環(huán)狀態(tài)從而引起顯色反應(yīng)。生物細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果表明，探針L2具有較低的細(xì)胞毒性，并可成功用于HeLa細(xì)胞中Hg2+和ClO-的熒光成像。探針L2在生物科學(xué)中有望被開發(fā)用于檢測(cè)Hg2+和ClO-，具有較大價(jià)值。

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