楊楠 王奧 張子晨 趙良成

摘 要： ???川柿（Diospyros sutchuensis）為極小種群和國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物，分布范圍狹窄，種群數(shù)量極少。目前，川柿基因組信息缺乏，在柿屬（Diospyros）中的系統(tǒng)親緣關(guān)系不明確。該研究通過Illumina平臺對川柿葉綠體基因組進(jìn)行測序，應(yīng)用Getorganellev1.7.3.4和PGA軟件對基因組進(jìn)行組裝和注釋，使用DnaSP6.12.03軟件進(jìn)行多序列對比分析，并使用REPuter、Tandem Reapeats Finder和MISA軟件進(jìn)行重復(fù)序列分析，使用CodonW1.4和EasyCodemL軟件分別進(jìn)行密碼子偏好性和選擇壓力分析。同時(shí)，基于4個(gè)不同的葉綠體基因組序列數(shù)據(jù)集，使用IQtree軟件分析川柿與11個(gè)柿屬物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果表明：（1）川柿葉綠體基因組全長157 917 bp，包含1對26 111 bp的反向重復(fù)區(qū)、大單拷貝區(qū)（87 303 bp）和小單拷貝區(qū)（18 392 bp），GC堿基含量為37.4%。（2）川柿葉綠體基因組共注釋到113個(gè)基因，包括79個(gè)蛋白編碼基因、30個(gè)tRNA基因和4個(gè)rRNA基因；共檢測到49個(gè)長重復(fù)序列、27個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列和34個(gè)簡單重復(fù)序列；蛋白編碼基因中高頻密碼子31個(gè)，多數(shù)密碼子末位堿基為A或U，編碼亮氨酸的密碼子使用最多；基因組編碼區(qū)比非編碼區(qū)更為保守，10個(gè)高變熱點(diǎn)區(qū)域可作為潛在的分子標(biāo)記；蛋白編碼基因中有8個(gè)基因（ndhB、ndhG、ndhI、rbcL、rpoB、petB、petD、rps12）受到正選擇壓力。（3）系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，川柿與老鴉柿（D. rhombifolia）和烏柿（D. cathayensis）親緣關(guān)系最為密切，它們與海南柿（D. hainanensis）共同形成一個(gè)單系分支。該研究結(jié)果既為川柿及柿屬種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性保護(hù)以及種群恢復(fù)等提供了葉綠體基因組資源，也為闡明川柿的系統(tǒng)進(jìn)化提供了重要的分子信息。

關(guān)鍵詞： ?川柿， 葉綠體基因組， 重復(fù)序列， 選擇壓力， 系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號： ??Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： ???A

文章編號： ??1000-3142（2024）01-0015-15

Characteristics of chloroplast genome and phylogenetic

analysis of Diospyros sutchuensis with

extremely small populations

YANG Nan1 ， WANG Ao1 ， ZHANG Zichen1 ， ZHAO Liangcheng2*

（ 1. School of Ecology and Nature Conservation， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China;

2. Museum of Beijing Forestry University， Beijing 100083， China ）

Abstract： ??Diospyros sutchuensis is a national protected wild plant species with narrow distribution and extremely small population in southwestern China. At present， the genomic information of this species is lacking and its phylogenetic relationships among Diospyros remain unclear. In this study， the ?chloroplast genome of D. sutchuensis was sequenced by Illumina platform， assembled and annotated by Getorganelle v1.7.3.4 and PGA， and analyzed by DnaSP 6.12.03 for sequence comparison， REPuter， Tandem Reapeats Finder， MISA for repetitive sequences， CodonW1.4 for codon usage bias， and EasyCodemL for selection pressure. Meanwhile， based on four different chloroplast genome sequence datasets， the phylogenetic relationships between D. sutchuensis and 11 Diospyros species were analyzed using IQtree. The results were as follows： （1） The chloroplast genome of D. sutchuensis was 157 917 bp in length， including two inverted repeats （IRs） of 26 111 bp， which was separated by large single copy （LSC） and short single copy （SSC） of 87 303 bp and 18 392 bp， respectively. The GC content was 37.4%. （2） The genome contained 113 genes， including 79 protein-coding genes， 30 tRNA genes， and 4 rRNA genes. A total of 49 long repeats， 27 tandem repeats， and 34 simple sequence repeats were identified. There were 31 high-frequency codons in protein-coding genes， most of them ended in A or U， and the most used codons were the ones encoding leucine. The coding regions were more conserved than the non-coding ones， and 10 regions were identified as most divergent hotspots for potential molecular markers. There had been positive selection on ndhB， ndhG， ndhI， rbcL， rpoB， petB， petD and rps12 among protein-coding genes. （3） Phylogenetic analyses showed that D. sutchuensis was closely related to D. rhombifolia and D. cathayensis. Together with D. hainanensis， these four species formed a monophyletic group. The phylogenetic tree constructed from the ?chloroplast genomes had the highest support values， indicating that the ?chloroplast genomes with most variable and informative sites are more suitable for phylogenetic studies of Diospyros. The results provide useful chloroplast genomic resources for germplasm identification， genetic diversity conservation， repopulation， and phylogenetic analysis of D. sutchuensis as well as Diospyros.

Key words： ?Diospyros sutchuensis， chloroplast genome， repeat sequence， selection pressure， phylogenetic analysis

柿科（Ebenaceae）是一個(gè)主要分布于熱帶和亞熱帶的木本植物科，包含3～4個(gè)屬（Wallnfer， 2001; Duangjai et al.， 2006）。柿屬（Diospyros）是柿科內(nèi)種類最多、分布最廣的屬，也是柿科在中國唯一的屬。同時(shí)，柿屬很多種類也是重要的經(jīng)濟(jì)樹種，在食用、藥用、木材、園藝等方面用途廣泛（左大勛等， 1984; Rauf et al.， 2017）。柿屬的系統(tǒng)分類研究主要集中在形態(tài)學(xué)和孢粉學(xué)（Utsunomiya et al.， 1998; Venkatasamy et al.， 2006; Akinsulire et al.， 2018; 胡超瓊等， 2018; 鄒璞等， 2022）。近年來，有學(xué)者陸續(xù)對柿屬不同類群開展了分子系統(tǒng)學(xué)和基因組學(xué)研究（Yonemori et al.， 2008; Turner et al.， 2013; 梁晉軍， 2014; 傅建敏等， 2015; 傅建敏等， 2017）。在國內(nèi)，柿屬包含的物種數(shù)量一直存有爭議，很多種類的系統(tǒng)地位也不明確（左大勛等， 1984; 吳征鎰和崔鴻賓， 1987; Li et al.， 1996）。Tang等（2019）通過資料分析、標(biāo)本查閱和實(shí)地調(diào)查，確認(rèn)了45種中國特有的柿屬種類，其中18種分布極為狹窄，川柿（Diospyros sutchuensis ）即為分布范圍狹窄的種類之一。

川柿由森林植物學(xué)家楊銜晉于1945年在《華西邊疆研究學(xué)會雜志》上命名發(fā)表，模式標(biāo)本于1941年采自四川盆地東部華鎣山海拔1 300 m的雜木林中（Yang， 1945）。但是，自川柿發(fā)表后，幾十年來一直未在野外見到。研究人員曾去模式原產(chǎn)地調(diào)查，也未采到（方文培， 1985）。2017年，科研人員在重慶市江津區(qū)四面山林區(qū)再次調(diào)查到川柿，目前共發(fā)現(xiàn)6株個(gè)體，分散在3個(gè)分布點(diǎn)（劉燕琴等， 2021a，b）。川柿在野外分布范圍狹窄，種群數(shù)量極少，生境受威脅嚴(yán)重，根據(jù)極小種群野生植物（PSESP）的定義（孫衛(wèi)邦等， 2015; 楊文忠等， 2015），該種應(yīng)屬于極小種群野生植物。在2021年公布的《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》中（http：//www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2021-09/09/content_5636409.htm），柿科共有2種被列為國家二級保護(hù)植物，分別為川柿和小萼柿（D. minutisepala）。目前，僅有劉燕琴等（2021a，b）對川柿的生物學(xué)特性和種子萌發(fā)進(jìn)行了初步研究。在柿屬已有的系統(tǒng)分類學(xué)研究中，由于所涉及的類群均沒有包含川柿，因此該物種的系統(tǒng)親緣關(guān)系尚不明確。

葉綠體作為植物細(xì)胞特有的細(xì)胞器，擁有一套半自主性遺傳的基因組。與核基因相比，葉綠體基因組具有高度的保守性以及進(jìn)化相對獨(dú)立、基因組小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、突變率低等特點(diǎn)，已被越來越多用于植物分子進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育以及物種鑒定等研究中（Dong et al.， 2012; Daniell et al.， 2016）。同時(shí)，葉綠體基因組還可為重要經(jīng)濟(jì)植物及珍稀瀕危植物的保育提供分子信息（陸奇豐等， 2021）。在柿屬中，目前共報(bào)道了11個(gè)物種的葉綠體基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。其中，F(xiàn)u 等（2016）首次對4種和1品種柿屬植物，即柿（Diospyros kaki）、君遷子（D. lotus）、油柿（D. oleifera）、粉葉柿（D. glaucifolia）和金棗柿（Diospyros‘Jinzaoshi）進(jìn)行了葉綠體基因組測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示柿與油柿的親緣關(guān)系較近，而君遷子則與粉葉柿較近。Liu 等（2018）報(bào)道了瓊島柿（D. maclurei）和海南柿（D. hainanensis）兩個(gè)海南特有種的葉綠體基因組序列，發(fā)現(xiàn)兩者基因組特征相近，但親緣關(guān)系卻較遠(yuǎn)。

本文依托“中國西南地區(qū)極小種群野生植物調(diào)查與種質(zhì)保存”項(xiàng)目對重慶市四面山川柿的調(diào)查結(jié)果，以川柿葉片為研究材料，通過葉綠體基因組高通量測序、組裝和基因注釋，結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的其他11種柿屬植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，擬探討：（1）川柿的葉綠體基因組特征，包括基因重復(fù)序列、變異位點(diǎn)、密碼子偏好性和進(jìn)化選擇壓力；（2）川柿與部分柿屬種類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及不同葉綠體基因組序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹的比較。本研究結(jié)果有助于增加對川柿系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的理解，并為后續(xù)開展川柿及柿屬種質(zhì)資源鑒定、遺傳育種、遺傳多樣性保護(hù)以及種群恢復(fù)等研究提供分子信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料與DNA提取

川柿的葉片材料采自重慶市江津區(qū)四面山大窩鋪林場（28°34′34.48″ E、106°21′4.48″ N），用硅膠干燥保存，憑證標(biāo)本（BJFUZLC022）存放于北京林業(yè)大學(xué)植物標(biāo)本館（BJFC）。利用改良CTAB法（Pahlich & Gerlitz， 1980）提取川柿葉片總DNA，試劑盒采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 葉綠體基因組拼裝與注釋

葉綠體全基因組的測序分為五步，即基因組DNA質(zhì)檢、DNA片段化、文庫構(gòu)建、橋式PCR、Illumina Hiseq 4000 測序儀進(jìn)行雙端測序。共得到5.44 Gb原始數(shù)據(jù)（raw data），去除其中測序質(zhì)量較低的序列后得到clean data，利用Getorganelle v1.7.3.4軟件（Jin et al.， 2020），以柿的葉綠體全基因組作為參考，對所獲得的clean data進(jìn)行從頭拼接。

將所獲得的川柿葉綠體全基因組序列使用軟件PGA（Plastid Genome Annotator）進(jìn)行注釋，參照柿的葉綠體全基因組注釋信息，得到注釋結(jié)果。注釋結(jié)果經(jīng)過NCBI中Blast比對，比對正確后提交至GenBank，得到基因序列號OK641590。使用在線網(wǎng)站OG DRAW （https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de /OGDraw.html），參數(shù)為默認(rèn)值，繪制川柿葉綠體全基因組圖譜。

1.3 多序列對比分析

使用DnaSP6.12.03軟件（Librado & Rozas， 2009）對11個(gè)柿屬物種的葉綠體基因組進(jìn)行滑動(dòng)窗口分析，計(jì)算核苷酸多樣性（Pi）。步長設(shè)定為100 bp，窗口長度為300 bp。使用MAFFT 7軟件（Katoh & Standley， 2013）分別對編碼區(qū)與非編碼區(qū)進(jìn)行同源位點(diǎn)比對，計(jì)算每段序列的變異位點(diǎn)百分比。

1.4 重復(fù)序列與SSR分析

使用REPuter軟件（Kurtz et al.， 2001）查找川柿葉綠體全基因組中的散在重復(fù)序列 （dispersed repeats），海明距離（Hamming distance）設(shè)置為3。串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeats）通過Tandem Reapeats Finder（Benson， 1999）進(jìn)行分析。簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats， SSR）的檢測利用MISA軟件（Beier et al.， 2017），參數(shù)設(shè)置為單核苷酸重復(fù)≥10，二核苷酸重復(fù)≥6，三核苷酸重復(fù)≥5，四核苷酸重復(fù)≥4，五和六核苷酸重復(fù)≥3。

1.5 密碼子偏好分析

使用CodonW1.4軟件分析川柿葉綠體基因組中蛋白編碼基因同義密碼子的相對使用度（relative synonymous codon usage， RSCU），通過RSCU值判斷密碼子使用偏好。當(dāng)RSCU＞1時(shí)，說明該密碼子被高頻使用；當(dāng)RSCU=1時(shí)，說明密碼子沒有使用偏好；當(dāng)RSCU＜1時(shí)，說明該密碼子使用頻率較低。軟件參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)，并根據(jù)所獲得的參數(shù)繪制相關(guān)堆積柱形圖。

1.6 選擇壓力分析

選擇川柿以及與川柿親緣關(guān)系較近的老鴉柿（D. rhombifolia）、烏柿（D. cathayensis）、海南柿，對其葉綠體全基因組的78個(gè)共有蛋白編碼基因進(jìn)行選擇壓力計(jì)算與分析。利用EasyCodemL軟件（Gao et al.， 2019），選擇預(yù)置模式（preset mode）與位點(diǎn)模型（site model），對這些基因的非同義突變率（dN）與同義突變率（dS）及其比值（ω=dN/dS）進(jìn)行計(jì)算。為了檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的顯著性，進(jìn)行LRT檢驗(yàn)（liklihood ratio tests）。此外，選取PamlX 軟件（Xu & Yang， 2013）中的YN00模塊計(jì)算4個(gè)物種兩兩對比后每個(gè)蛋白編碼基因的dN、dS及ω值，所得結(jié)果與EasyCodeml所得結(jié)果進(jìn)行比較，以確認(rèn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中下載柿屬已經(jīng)過驗(yàn)證的11個(gè)物種的葉綠體全基因組序列，包括分布于中國的柿（NC_030789.1）、君遷子（NC_030786.1）、烏柿（NC_039554.1）、粉葉柿（NC_030784.1）、油柿（NC_030787.1）、海南柿（NC_042160.1）、瓊島柿（NC_042161.1）、老鴉柿 （NC_039556.1），以及分布于東南亞的D. blancoi （NC_033502.1）、D. celebica（NC_046040.1）和分布于北美的美洲柿（D. virginiana）（NC_039555.1），與本研究川柿的葉綠體全基因組序列一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。由于安息香科與柿科存在較近的親緣關(guān)系，選用中華安息香（Styrax chinensis）（MT648752.1）作為外類群。使用Phylosuite 軟件（Zhang et al.， 2020）篩選出編碼區(qū)序列與非編碼區(qū)序列，并進(jìn)行序列串聯(lián)，用于后續(xù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。

為比較不同基因組序列，本研究對川柿的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析采用了4個(gè)不同的數(shù)據(jù)集：（1）葉綠體全基因組序列；（2）編碼區(qū)序列；（3）非編碼區(qū)序列；（4）非編碼區(qū)20個(gè)變異熱點(diǎn)區(qū)域的一致性序列。使用MEGA X軟件（Kumar et al.， 2018）對序列進(jìn)行比對，每個(gè)數(shù)據(jù)集的最適模型選擇采用Model-Finder（Kalyaanamoorthy et al.， 2017）進(jìn)行計(jì)算。利用IQtree （Nguyen et al.， 2015）構(gòu)建基于最大似然法（maximum-likelihood）的系統(tǒng)發(fā)育樹。5 000 次自展分析檢驗(yàn)，計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的靴帶支持率（bootstrap values， BS），同時(shí)采用貝葉斯方法（Bayesian inference）（Posada et al.， 2004），重復(fù)1 000次，通過貝葉斯后驗(yàn)概率（Bayesian posterior probabilities， PP）對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 川柿葉綠體全基因組基本特征

川柿葉綠體全基因組呈現(xiàn)閉合環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，包含一個(gè)大單拷貝區(qū)（LSC）、一個(gè)小單拷貝區(qū)（SSC）和一對反向重復(fù)區(qū)IR（IRa、IRb）（圖1）?；蚪M序列全長157 917 bp，其中LSC區(qū)、SSC區(qū)、IR區(qū)長度分別為87 303、18 392、26 111 bp?；蚪M總GC堿基含量為37.4%，LSC區(qū)、SSC區(qū)、IR區(qū)GC含量分別為35.4%、30.9%、43.0%。

川柿葉綠體全基因組中共注釋到113個(gè)基因，包括79個(gè)蛋白編碼基因、30個(gè)tRNA基因和4個(gè)rRNA基因。IR區(qū)重復(fù)的基因分別為7個(gè)蛋白編碼基因（rpl2、rpl23、ycf15、ndhB、rps7、rps12、ycf2），7個(gè)tRNA （trnV-GAC、trnI-GAU、trnA-UGC、trnR-ACG、trnN-GUU、trnI-CAU、trnL-CAA）、4個(gè)rRNA（rrn16、rrn4.5、rrn23、rrn5）。含有1個(gè)內(nèi)含子的基因有15個(gè)（rpl16、rpl2、ndhB、rps16、atpF、rpoC1、trnA-UGC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC、rps12、trnG-UCC、petB、petD），含有2個(gè)內(nèi)含子的基因有2個(gè)（ycf3、clpP）。根據(jù)基因功能的不同，川柿葉綠體基因組基因可分為與表達(dá)有關(guān)的基因（59個(gè)）、光合作用相關(guān)基因（46個(gè)）以及其他基因（8個(gè)）（表1）。川柿與已報(bào)道的其他11個(gè)柿屬物種葉綠體全基因組特征比較見附表1。

2.2 重復(fù)序列和SSR分析

通過鑒定得到川柿葉綠體基因組中的長重復(fù)序列共49個(gè)，長度在18～30 bp之間，包括正向重復(fù)序列（forward）18個(gè)、反向重復(fù)序列（reverse）7個(gè)、回文重復(fù)（palindromic）24個(gè)，未檢測到互補(bǔ)序列（complement）。共檢測到串聯(lián)重復(fù)序列27個(gè)，長度在4～32 bp之間，其中19個(gè)序列重復(fù)了2次、3個(gè)序列重復(fù)了3次、2個(gè)序列重復(fù)了6次、2個(gè)序列重復(fù)了4次、1個(gè)序列重復(fù)了12次、1個(gè)序列重復(fù)了5次。17個(gè)串聯(lián)重復(fù)發(fā)生在基因間隔區(qū)（IGS）、7個(gè)發(fā)生在基因ycf2上、1個(gè)位于基因ndhF、其余2個(gè)分布在基因ndhA的內(nèi)含子上。在川柿葉綠體基因組共檢測到34個(gè)簡單重復(fù)序列SSR，其中33個(gè)為單核苷酸重復(fù)序列，另外1個(gè)為復(fù)合SSR（表2）。單核苷酸重復(fù)序列的重復(fù)單元大部分為堿基A或堿基T，只在LSC區(qū)出現(xiàn)了一個(gè)G堿基的重復(fù)單元。五核苷酸重復(fù)序列1個(gè)，重復(fù)單元為AGTTT。

2.3 序列變異分析

通過計(jì)算比較了12個(gè)柿屬物種葉綠體全基因組序列間的核苷酸多樣性 （Pi）。圖2結(jié)果顯示，Pi值區(qū)間為0～0.053 59，平均值為0.006 99。各分區(qū)中，LSC區(qū)Pi值為0～0.053 59，SSC區(qū)Pi值0～0.038 63，IR區(qū)Pi值為0～0.015 7。LSC區(qū)的高變區(qū)域（Pi＞0.03）包括trnH-GUG-psbA、trnT-UGU-trnL-UAA、petA-psbJ、psbE-petL、ycf2，SSC區(qū)的高變區(qū)域（Pi＞0.02）為ndhF-rpl32、rpl32-trnL-UAG、ccsA-ndhD、ycf1，IR區(qū)的高變區(qū)域（Pi＞0.01）為rpl2。

此外，還分別統(tǒng)計(jì)了12個(gè)柿屬物種葉綠體全基因組、編碼區(qū)、非編碼區(qū)，以及LSC區(qū)、SSC區(qū)、IR區(qū)變異位點(diǎn)的數(shù)量和百分比。葉綠體全基因組共發(fā)現(xiàn)3 980個(gè)變異位點(diǎn)，占比2.43%；編碼區(qū)變異位點(diǎn)1 141個(gè)，占比1.23%；非編碼區(qū)變異位點(diǎn)2 444個(gè)，占比3.09%。在4個(gè)分區(qū)中，LSC區(qū)變異位點(diǎn)數(shù)量最多，為1 588個(gè)，占比1.78%；其次是SSC區(qū)，為863個(gè)，占比4.60%；IR區(qū)變異位點(diǎn)最少，僅有119個(gè)，占比0.45%。

在12種柿屬植物葉綠體基因組中，編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)含有變異位點(diǎn)的基因21個(gè)，不同基因變異位點(diǎn)從高到低占比為25.94%～1.15%（附表2）。其中，psbK變異位點(diǎn)百分比最高，為25.94%。在21個(gè)基因中，16個(gè)位于LSC區(qū)、3個(gè)位于IR區(qū)、2個(gè)位于SSC區(qū)。非編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)含變異位點(diǎn)的基因序列118條，不同序列變異位點(diǎn)從高到低占比為49.30%～0.18%。其中，rps12-2-rps12-1變異位點(diǎn)百分比最高，為49.30%。非編碼區(qū)變異位點(diǎn)百分比最高的20個(gè)基因序列如表4所示。

2.4 密碼子偏好性分析

川柿葉綠體全基因組序列中的蛋白編碼基因共包含52 639個(gè)密碼子，高頻密碼子（RSCU＞1）共有31個(gè)。其中，以A結(jié)尾的13個(gè)、以U結(jié)尾的12個(gè)、以C結(jié)尾的3個(gè)、以G結(jié)尾的3個(gè)（圖3）。密碼子Aug、Trp的RSCU值為1，表示其無偏好性。在這些密碼子所編碼的蛋白質(zhì)中，亮氨酸（Leu）所占數(shù)量最多，含5 096個(gè)密碼子，占比9.68%；色氨酸（Trp）所占數(shù)量最少，含689個(gè)密碼子，占比1.31%。

2.5 選擇壓力分析

對川柿、老鴉柿、烏柿、海南柿葉綠體基因組的78個(gè)共有蛋白編碼基因進(jìn)行選擇壓力檢測（圖4）。圖4結(jié)果表明，在兩兩物種的比較中，各基因的dN平均值為0.470 0，dS平均值為0.652 1，dN最高的基因?yàn)閜etD（2.054 9），dS最高的基因?yàn)閞poC1（3.352 4），ω（dN/dS）平均值為0.720 8。共有8個(gè)基因（ndhB、ndhG、ndhI、rbcL、rpoB、petB、petD、rps12）的ω平均值大于1，41個(gè)基因的ω等于0，其余基因的ω平均值均小于1。對于川柿而言，兩兩物種比較中，基因rps12的ω最大，為3.957 3，出現(xiàn)在川柿與海南柿的比較中?；騨dhG和ndhI的ω較大，分別為2.589 0和2.563 9，出現(xiàn)在川柿與烏柿及川柿與海南柿的比較中。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

分別以葉綠體全基因組、非編碼區(qū)序列、非編碼區(qū)20個(gè)變異熱點(diǎn)區(qū)域的一致性序列以及編碼區(qū)序列4個(gè)不同的數(shù)據(jù)集，進(jìn)行包括川柿在內(nèi)的12種柿屬植物的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖5：a-d）。全基因組、非編碼區(qū)序列、非編碼區(qū)變異熱點(diǎn)序列3個(gè)系統(tǒng)樹（圖5：a-c）均強(qiáng)烈支持川柿與烏柿和老鴉柿親緣關(guān)系最為接近，烏柿與老鴉柿互為姐妹種，川柿與這2個(gè)種形成姐妹群（支持率均為PP/BS： 1/100）。這3個(gè)種又與海南柿形成姐妹群，共同構(gòu)成一個(gè)單系分支。在以上4個(gè)物種構(gòu)成的分支中，海南柿位于基部，較先分化。海南柿與其他3個(gè)種的姐妹關(guān)系在全基因組系統(tǒng)樹上表現(xiàn)為強(qiáng)支持（圖5：a），但在非編碼區(qū)及其變異熱點(diǎn)系統(tǒng)樹上的靴帶支持率卻較弱（圖5：b， c）。

在編碼區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹上，川柿的近緣類群與以上3個(gè)數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)樹相比有一些差異（圖5：d）。老鴉柿先與美洲柿（Diospyros virginiana）形成姐妹群，二者再與烏柿形成姐妹群，川柿則是這3個(gè)種的姐妹群。海南柿與川柿、烏柿、老鴉柿及美洲柿共同構(gòu)成一個(gè)單系分支。

3 討論與結(jié)論

3.1 葉綠體基因組特征分析

本研究中，川柿葉綠體全基因組為典型的四分體結(jié)構(gòu)，基因組全長157 917 bp，共編碼113個(gè)基因，沒有發(fā)生基因重排現(xiàn)象。經(jīng)比較，在基因組結(jié)構(gòu)、大小及基因類型和排列順序等方面，川柿與柿屬其他11個(gè)物種的葉綠體全基因組非常相似。周曉君等（2020）研究表明基因組的GC含量是判斷物種間親緣關(guān)系的重要指標(biāo)，本研究川柿葉綠體基因組的GC含量與其他11個(gè)物種一致，均為37.4%。這表明柿屬物種的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)較為保守。

基因組中存在的重復(fù)序列在序列變異中發(fā)揮著重要作用，其長度影響基因組的結(jié)構(gòu)和功能（Weng et al.， 2014）。在許多已知的被子植物中都發(fā)現(xiàn)葉綠體基因組具有不同類型的重復(fù)序列，特別是在基因間隔區(qū)中（Daniell et al.， 2016）。本研究川柿葉綠體基因組的長重復(fù)序列中，63.0%的重復(fù)序列位于非編碼區(qū)，在串聯(lián)重復(fù)序列中也得到了類似的結(jié)果，70.0%的序列位于非編碼區(qū)。檢測到的3種重復(fù)序列類型中，回文序列占比最高，為49.0%。這一結(jié)果與柿屬其他一些種類相似，在柿、油柿、金棗柿、粉葉柿、君遷子中，重復(fù)序列同樣主要分布于非編碼區(qū)，并且回文序列占比最高 （Fu et al.， 2016）。

簡單重復(fù)序列SSR具有含量豐富、多態(tài)性高、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用作分子標(biāo)記（羅冉等， 2010）。戚建鋒等（2018）已將SSR成功應(yīng)用于柿地方品種的鑒定中。在所有SSR類型中，A和T是最常用的堿基，很少包含堿基G或C重復(fù)，這可能是因?yàn)閴A基A/T比堿基G/C更容易改變（Kuang et al.， 2011）。本研究川柿葉綠體基因組鑒定出的34個(gè)SSR中，僅一個(gè)位點(diǎn)由堿基C、G組成。此外， 非編碼區(qū)SSR位點(diǎn)出現(xiàn)的數(shù)量占比61.8%，遠(yuǎn)多于編碼區(qū)。川柿SSR以上特點(diǎn)與其他很多被子植物葉綠體基因組SSR序列組成的規(guī)律基本一致（Sun et al.， 2021），這可能是導(dǎo)致葉綠體基因組具有較強(qiáng)保守性的原因之一。這些SSR序列為川柿的遺傳多樣性研究提供了候選的分子標(biāo)記。

密碼子的使用偏好性與物種長期的進(jìn)化過程密切相關(guān)，能夠?qū)蚬δ芗捌渚幋a蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響（冉然等， 2022）。川柿葉綠體基因組密碼子具有明顯的A/U偏好性，此特征與其他柿屬植物及很多雙子葉植物相似（Lin et al.， 2016; 傅建敏等， 2017）。與已報(bào)道的5種柿屬（柿、油柿、君遷子、金棗柿、粉葉柿）葉綠體基因組密碼子比較發(fā)現(xiàn)（傅建敏等， 2017），在共有密碼子中，有8個(gè)密碼子的使用頻率不同：在GGU、AGU、CGU中，這5個(gè)柿屬植物的RSCU＞1，而川柿RSCU＜1；在AUA、GGG、AGG、CCC、ACC中，這5個(gè)柿屬植物的RSCU＜1，而川柿RSCU＞1，顯示川柿對這些密碼子的使用頻率有一定的獨(dú)特性。

本研究中，對川柿及其他11種柿屬植物葉綠體基因組序列的變異分析顯示，LSC 區(qū)包含最多核苷酸變異值高的序列，表明LSC 區(qū)具有更高的序列多樣性水平。在編碼區(qū)與非編碼區(qū)的比較中，非編碼區(qū)變異位點(diǎn)數(shù)量和比例明顯高于編碼區(qū)，表明編碼區(qū)更加保守，這與大多數(shù)被子植物的結(jié)果相一致（Daniell et al.， 2016）。通過比較共選定了10個(gè)高變熱點(diǎn)區(qū)域，其中LSC區(qū)5個(gè)、SSC區(qū)4個(gè)、IR區(qū)1個(gè)。這些高變熱點(diǎn)區(qū)域提供了非常有價(jià)值的變異信息，可作為潛在的分子標(biāo)記用于柿屬物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究。

不同的環(huán)境會對物種產(chǎn)生不同的選擇壓力，蛋白編碼基因中非同義突變率（dN）與同義突變率（dS）的比值ω是一個(gè)衡量分子進(jìn)化選擇壓力的重要指標(biāo)（Dos reis， 2015）。ω=1表示基因受到中性選擇，ω>1表示基因受到正選擇，ω<1表示基因受到負(fù)選擇。本研究對川柿、老鴉柿、烏柿、海南柿4個(gè)物種共有的78個(gè)葉綠體蛋白編碼基因進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)41個(gè)基因的ω平均值為0，意味著在適應(yīng)性進(jìn)化過程中，多數(shù)基因并沒有發(fā)生同義和非同義替換，在一定程度上表明了柿屬基因的穩(wěn)定性。對于川柿而言，rps12、ndhG和ndhI的ω＞2，顯示這幾個(gè)基因受到較強(qiáng)烈的正選擇壓力。rps12基因在所有葉綠體基因中結(jié)構(gòu)極為特殊且高度保守（平晶耀等， 2021）。Martín和Sabater（2010）的研究表明ndh基因可能參與葉綠體對光氧化脅迫的保護(hù)，同時(shí)植物抗氧化脅迫能力與其對其他環(huán)境條件的抗性密切相關(guān)。因此，rps12和ndh基因?qū)ρ芯看ㄊ梁褪翆僦参锶~綠體基因組適應(yīng)性進(jìn)化過程以及進(jìn)化速率具有重要價(jià)值。

3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

近年來，對于柿屬的部分種類，國內(nèi)外基于葉綠體全基因組、葉綠體基因片段以及核基因片段，已進(jìn)行了一些分子系統(tǒng)學(xué)研究，為了解柿屬的系統(tǒng)發(fā)育提供了重要線索。雖然川柿早在1945年即已發(fā)表，但直到近年才在野外被再次發(fā)現(xiàn)，目前對川柿的研究極少，其系統(tǒng)親緣關(guān)系也不明確。

本研究中，葉綠體全基因組、非編碼區(qū)以及非編碼區(qū)變異熱點(diǎn)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹均顯示川柿與老鴉柿和烏柿親緣關(guān)系最為接近，并且支持率均為最高。老鴉柿與烏柿的形態(tài)特征非常相似，以至于過去老鴉柿的標(biāo)本常被誤定為烏柿（吳征鎰和崔鴻賓， 1987）。本研究中，二者的果實(shí)均較小，直徑1.5～3 cm，比川柿果實(shí)略小，其他形態(tài)特征與川柿很相似。在地理分布上，川柿、老鴉柿和烏柿在中國均分布于亞熱帶山地，在生境上非常相似。這3種柿樹進(jìn)而與分布于海南熱帶常綠闊葉林的海南柿組成一個(gè)單系，顯示有最近的共同祖先。海南柿果實(shí)直徑3～4 cm且幼時(shí)密被毛，與川柿果實(shí)大小相近。

在編碼區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)樹中，美洲柿與老鴉柿聚為同一分支，與烏柿形成姐妹群，進(jìn)而與川柿匯于同一分支。然而，美洲柿的染色體為6倍體（2n=90），而老鴉柿染色體為4倍體（2n=60）（Tamura et al.， 1998）。其他葉綠體和核基因片段分子證據(jù)顯示，美洲柿與柿、油柿和君遷子關(guān)系密切，而與老鴉柿關(guān)系較遠(yuǎn)（Yonemori et al.， 2008; Turner et al.， 2013）。張永芳等（2016）和胡超瓊等（2018）對部分柿屬植物花粉形態(tài)的觀察顯示，美洲柿、柿、油柿、粉葉柿在花粉表面紋飾上非常相似，而烏柿花粉表面呈現(xiàn)較多的褶皺，與這些種類有較大差異。編碼區(qū)系統(tǒng)樹的不一致可能是因葉綠體基因組編碼區(qū)序列較為保守、變異信息位點(diǎn)較少而導(dǎo)致。

另外，由分布于東南亞的D. blancoi和D. celebica以及中國海南的瓊島柿（D. maclurei）組成的分支，與其他國內(nèi)種類分支的拓?fù)潢P(guān)系在4個(gè)系統(tǒng)樹中并不完全一致，并且支持率均很低，顯示葉綠體基因組數(shù)據(jù)尚不能闡明這3種柿樹的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，基于葉綠體全基因組、非編碼區(qū)及其變異熱點(diǎn)所得到的川柿系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果與其他已有證據(jù)的相一致。因此，在這11個(gè)柿屬物種中，與川柿親緣關(guān)系最近的是烏柿和老鴉柿。在全基因組、非編碼區(qū)及其變異熱點(diǎn)建立的3個(gè)系統(tǒng)樹中，全基因組系統(tǒng)樹的支持率最高，顯示應(yīng)該優(yōu)先選擇信息位點(diǎn)最多的葉綠體全基因組進(jìn)行柿屬的系統(tǒng)發(fā)育研究。

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（ 責(zé)任編輯 蔣巧媛 ）

收稿日期： ??2023-10-11

基金項(xiàng)目： ??國家科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項(xiàng)“中國西南地區(qū)極小種群野生植物調(diào)查與種質(zhì)保存” （2017FY100100）。

第一作者： ?楊楠（1999-），碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锇l(fā)育與進(jìn)化，（E-mail）nanmuyi@163.com。

* 通信作者： ??趙良成，博士，教授，主要從事植物系統(tǒng)進(jìn)化生物學(xué)研究，（E-mail）lczhao@bjfu.edu.cn。