宋紅亮，王建國(guó)，張 會(huì)，吳勇鋒，汪 愷，王曉波，徐 驍

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053

2. 浙江省腫瘤融合研究與智能醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310003

肝細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱肝癌）是中國(guó)60 歲以下成年男性病死率最高的腫瘤，且發(fā)現(xiàn)時(shí)患者往往已是晚期，失去了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)，因此肝癌的早篩早診至關(guān)重要。目前，臨床上用于篩查及診斷肝癌的血清學(xué)標(biāo)志物有AFP、PIVKA-Ⅱ和GPC-3 等［1］。血清AFP 水平是臨床上應(yīng)用最廣泛的肝癌血清學(xué)標(biāo)志物［1-2］，但其在妊娠期、慢性活動(dòng)性肝炎時(shí)也可顯著升高［3］，且有近50%的肝癌患者AFP 水平始終低于常用截?cái)嘀担?0 ng/mL）［4］，加之其敏感性較低，所以在篩查肝癌時(shí)需要與超聲等影像學(xué)檢查結(jié)合使用。PIVKA-Ⅱ在診斷肝癌時(shí)有較高的準(zhǔn)確性，但其表達(dá)水平與腫瘤大小相關(guān)［5］，因此用于診斷早期肝癌存在局限性。研究發(fā)現(xiàn)，GPC-3 在肝癌患者血清中表達(dá)上調(diào)［6］，目前已成為診斷肝癌的主要血清標(biāo)志物之一。但目前有關(guān)GPC-3 單獨(dú)用于肝癌診斷的研究結(jié)果差異較大，無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，仍需要進(jìn)一步研究。目前認(rèn)為，PIVKA-Ⅱ在單獨(dú)用于診斷肝癌時(shí)的診斷價(jià)值高于AFP 和GPC-3，且三者間任意兩者聯(lián)用診斷肝癌的準(zhǔn)確度均優(yōu)于單獨(dú)使用［7-9］。但三種標(biāo)志物聯(lián)用是否能進(jìn)一步提高肝癌診斷的準(zhǔn)確度目前尚無定論。本研究擬通過匯總?cè)N標(biāo)志物單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用的文獻(xiàn)，比較這三種標(biāo)志物單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于肝癌診斷的準(zhǔn)確度，以期為肝癌診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

檢索PubMed、Web of Science 和Embase 系統(tǒng)中2002年1月1日至2023年8月1日發(fā)表的關(guān)于AFP、PIVKA-Ⅱ和GPC-3 單獨(dú)或聯(lián)合診斷肝癌的文獻(xiàn)，檢索詞包括“AFP”“alpha-fetoprotein”“alpha fetoprotein”“PIVKA-Ⅱ”“des-gamma-carboxy-prothrombin”“protein induced by vitamin K absence”“GPC-3”“glypican-3”“glypican 3”“serums”“blood serum”“hepatomas”“hepatocellular carcinoma”“l(fā)iver cancer”“carcinoma，hepatocellular”“diagnosis”“diagnoses”“diagnoses and examinations”“sensitivity”“specificity”“ROC”“AUC”。檢索詞根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行調(diào)整，采用MeSH（PubMed）、Emtree（EMBASE）等主題詞與自由詞相結(jié)合的方式。同時(shí)，查閱相關(guān)文章的參考文獻(xiàn)，以發(fā)現(xiàn)可能漏掉的研究。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷性實(shí)驗(yàn)研究；②肝癌的診斷經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診或基于公認(rèn)指南的影像學(xué)（超聲、CT 或MRI）特征作出判斷；③經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診或基于公認(rèn)指南的影像學(xué)特征證實(shí)的肝癌患者為病例組，非肝癌患者為對(duì)照組；④能從文獻(xiàn)中完整提取真陽(yáng)性例數(shù)、假陽(yáng)性例數(shù)、假陰性例數(shù)和真陰性例數(shù)等數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)合并其他惡性腫瘤，無法獲取單獨(dú)的肝癌數(shù)據(jù)；②繼發(fā)性肝癌患者或采集血樣前經(jīng)歷過肝癌的相關(guān)治療；③無法完整提取數(shù)據(jù)；④動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；⑤重復(fù)、評(píng)論、薈萃分析、會(huì)議摘要、病例報(bào)告、信件或其他不完整的報(bào)告；⑥非診斷性研究；⑦樣本來源重復(fù)。

由兩位研究人員獨(dú)立按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)對(duì)查找到的文獻(xiàn)進(jìn)行篩選。若遇分歧，則由第三位研究者決定文獻(xiàn)是否納入研究。

1.3 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)

利用Review Manager 5.4 軟件使用QUADAS檢查表評(píng)估研究的質(zhì)量。其中包含專門開發(fā)的四大類共14個(gè)項(xiàng)目，用于評(píng)估診斷測(cè)試主要研究的質(zhì)量。每個(gè)項(xiàng)目的評(píng)分為“是”、“否”或“不清楚”。

1.4 資料提取

從文獻(xiàn)中提取第一作者姓名、研究對(duì)象的國(guó)家/地區(qū)、文獻(xiàn)發(fā)表年份、研究對(duì)象數(shù)、AFP、PIVKA-Ⅱ及GPC-3 的檢測(cè)方法、敏感度、特異度、生物標(biāo)志物閾值等數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Meta Disc 軟件和Stata 15.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括閾值效應(yīng)分析、異質(zhì)性檢驗(yàn)、發(fā)表偏倚、匯總敏感度、匯總特異度以及匯總受試者工作特征曲線下面積等。采用敏感度對(duì)數(shù)與（1－特異度）對(duì)數(shù)之間的Spearman 相關(guān)系數(shù)來判斷有無閾值效應(yīng)。采用Cochran-Q檢驗(yàn)和I2進(jìn)行非閾值效應(yīng)異質(zhì)性檢驗(yàn)。當(dāng)I2值>50%時(shí)為異質(zhì)性顯著，采用隨機(jī)效應(yīng)模型；否則，選擇固定效應(yīng)模型。使用Deeks漏斗圖評(píng)估發(fā)表偏倚。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

共檢索到文獻(xiàn)3987篇，通過篩選及閱讀其他文獻(xiàn)最終納入32篇文獻(xiàn)［10-41］。篩選流程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖Figure 1 Literature screening process

2.2 納入文獻(xiàn)的基本特征

納入文獻(xiàn)的研究人群分布較為廣泛，其中以中國(guó)人群最多。32 篇研究文獻(xiàn)均涉及AFP 診斷效能研究，25篇文獻(xiàn)對(duì)PIVKA-Ⅱ的診斷效能進(jìn)行研究，14 篇文獻(xiàn)對(duì)GPC-3 的診斷效能進(jìn)行研究。在標(biāo)志物的檢測(cè)方法上，納入的文獻(xiàn)以常用的ELISA 為主，可以降低因檢測(cè)方式引起的偏倚。納入文獻(xiàn)中病例組共3453 例，對(duì)照組共4512 例。納入文獻(xiàn)的基本特征見附表1。

表1 閾值效應(yīng)異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 The Spearman correlation of markers studied

2.3 納入研究的質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

根據(jù)QUADAS 檢查表，本次研究納入的文獻(xiàn)均為質(zhì)量高、偏倚風(fēng)險(xiǎn)低及臨床適用性高的文獻(xiàn)（圖2和附圖1）。

圖2 QUADAS檢查表評(píng)價(jià)結(jié)果Figure 2 Quality evaluation of the included studies according to QUADAS

2.4 納入研究異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 閾值效應(yīng)異質(zhì)性 閾值效應(yīng)分析結(jié)果顯示，除AFP+PIVKA-Ⅱ聯(lián)合檢測(cè)存在閾值效應(yīng)（P<0.05）外，其他檢測(cè)方式均不存在閾值效應(yīng)（均P>0.05），見表1，提示納入研究的異質(zhì)性基本不受閾值效應(yīng)影響。

2.4.2 非閾值效應(yīng)異質(zhì)性 對(duì)三種標(biāo)志物單獨(dú)或聯(lián)合使用診斷肝癌的DOR 進(jìn)行Cochran-Q 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示P值均小于0.01，表明均存在非閾值效應(yīng)異質(zhì)性。除PIVKA-Ⅱ+GPC-3 的陰性似然比的I2值為30.3%外，所有檢測(cè)方式的敏感度、特異度、陽(yáng)性似然比、陰性似然比和DOR 的I2值均大于50%，表明研究存在較大異質(zhì)性，遂采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行以上五個(gè)效應(yīng)量的合并。

2.5 納入研究發(fā)表偏倚檢驗(yàn)結(jié)果

Deeks 漏斗圖顯示，AFP、PIVKA-Ⅱ、GPC-3、AFP+PIVKA-Ⅱ、AFP+GPC-3、PIVKA-Ⅱ+GPC-3 和AFP+PIVKA-Ⅱ+GPC-3 的P值均大于0.05，見圖3。表明研究均不存在發(fā)表偏倚。

圖3 檢測(cè)文獻(xiàn)發(fā)表偏倚Deeks漏斗圖Figure 3 Estimation of the publication bias by Deek’s funnel plots

2.6 meta分析結(jié)果

由于三種標(biāo)志物單獨(dú)或聯(lián)合檢測(cè)均存在較強(qiáng)異質(zhì)性，遂采用隨機(jī)效應(yīng)模型對(duì)來自不同報(bào)告的數(shù)據(jù)進(jìn)行薈萃分析。

2.6.1 AUC 值 單個(gè)標(biāo)志物用于診斷肝癌時(shí)，PIVKA-Ⅱ的AUC 值最高，為0.88（95%CI：0.85~0.91），其次是GPC-3 和AFP。多個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合用于診斷肝癌的AUC 均高于單個(gè)標(biāo)志物，其中PIVKA-Ⅱ聯(lián)合GPC-3 診斷的AUC 值最高，為0.90（95%CI：0.87~0.92）。見表2和附圖2。

表2 三種標(biāo)志物單獨(dú)或聯(lián)合診斷肝癌的合并效應(yīng)量Table 2 Diagnostic values of AFP、PIVKA-Ⅱ、GPC-3 and their combinations for hepatocellular carcinoma

2.6.2 敏感度和特異度 由于不同AFP 研究使用的閾值不同，敏感度和特異度的范圍很廣，敏感度為28.80%~84.10%，特異度為29.00%~100.00%，匯總后的敏感度和特異度為0.64（95%CI：0.60~0.68）和0.87（95%CI：0.82~0.91）。單個(gè)標(biāo)志物用于診斷肝癌時(shí)，PIVKA-Ⅱ和GPC-3 的敏感度相對(duì)較高，但GPC-3 的特異度不如PIVKA-Ⅱ和AFP；多個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合用于診斷肝癌的敏感度較單個(gè)標(biāo)志物診斷時(shí)有所提高，但特異度無明顯提高。見表2和附圖3。

2.6.3 DOR、陽(yáng)性似然比和陰性似然比 單個(gè)標(biāo)志物用于診斷肝癌時(shí)，PIVKA-Ⅱ的DOR 最高，為22（95%CI：13~36），其后是GPC-3 和AFP；AFP 的陽(yáng)性似然比最高，PIVKA-Ⅱ和GPC-3 陰性似然比基本一致，且均低于AFP。兩個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合用于診斷肝癌的DOR均高于單個(gè)標(biāo)志物，其中AFP聯(lián)合GPC-3 診斷的DOR 最高，為25（95%CI：9~67）；AFP 聯(lián)合GPC-3 的陽(yáng)性似然比最高，PIVKA-Ⅱ聯(lián)合GPC-3 的陰性似然比最低。三個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合用于診斷肝癌時(shí)的DOR 為10（95%CI：7~45）。見表2。

綜上所述，單個(gè)標(biāo)志物診斷肝癌時(shí)PIVKA-Ⅱ的診斷價(jià)值最高；兩個(gè)標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用診斷價(jià)值優(yōu)于單個(gè)標(biāo)志物，其中PIVKA-Ⅱ聯(lián)合GPC-3 的診斷價(jià)值最高。

3 討 論

作為發(fā)生率和病死率均較高的惡性腫瘤［42］，肝癌的早篩、早診極為重要。長(zhǎng)期以來，血清學(xué)標(biāo)志物AFP因其具有樣本易獲得、創(chuàng)傷小、可重復(fù)等特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于肝癌的篩查和預(yù)警［43-45］。1956年，AFP 在人胎兒血清中首次發(fā)現(xiàn)［46］。從妊娠第四周開始，由于胎兒肝臟等器官的分泌，AFP水平持續(xù)升高［47］，待胎兒出生后則持續(xù)下降并維持在極低水平，但在肝癌發(fā)生時(shí)其水平又會(huì)異常上升。有研究認(rèn)為，肝癌患者血清AFP 水平升高與位于人類4號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的相關(guān)基因有關(guān)，該基因上的獨(dú)立增強(qiáng)子抑制的阻斷和沉默子的缺失導(dǎo)致啟動(dòng)子的活性恢復(fù)，最終使得AFP過表達(dá)［1，48］。也有研究證明，AFP 可以通過啟動(dòng)環(huán)AMP-蛋白激酶A途徑、鈣離子內(nèi)流和caspase-3 介導(dǎo)的凋亡信號(hào)促進(jìn)腫瘤增殖［49-51］。但是，臨床上有約30%的AFP陰性肝癌患者，且其特異度較低，所以目前AFP用于診斷肝癌飽受爭(zhēng)議［52］。目前研究顯示，PIVKA-Ⅱ診斷肝癌的效能高于AFP，有著較高的敏感度和特異度［5］。PIVKA-Ⅱ可通過增強(qiáng)細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成等方式促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移［53］。目前，PIVKA-Ⅱ在肝癌中過表達(dá)的機(jī)制尚無定論，肝癌中PIVKA-Ⅱ過表達(dá)可能與缺氧微環(huán)境、維生素K 代謝受損及凝血酶原前體過表達(dá)相關(guān)。但是，PIVKA-Ⅱ水平不僅在肝癌患者血清中升高，在維生素K 缺乏癥及服用維生素K 拮抗劑患者的血液中也會(huì)異常升高，這也使得PIVKA-Ⅱ在診斷肝癌時(shí)存在一定局限［54］。GPC-3 是GPC家族一員，在正常肝臟組織中幾乎不表達(dá)，但其在肝癌組織中的陽(yáng)性率高達(dá)90%。其通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與肝癌的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移，是肝癌的重要血清標(biāo)志物之一［55］。

為了更好地在臨床實(shí)踐中對(duì)肝癌血清標(biāo)志物進(jìn)行選擇，本研究采取薈萃分析來研究AFP、PIVKA-Ⅱ和GPC-3 及其聯(lián)合在診斷肝癌時(shí)的效能。與之前的薈萃分析比較，本研究納入了更多的近期相關(guān)研究，且增加了三個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合（AFP+PIVKA-Ⅱ+GPC-3）的比較。本文資料顯示，應(yīng)用單個(gè)標(biāo)志物診斷肝癌時(shí)，PIVKA-Ⅱ的AUC 值為0.88，高于AFP的0.78和GPC-3的0.84；在匯總特異度相近的情況下，PIVKA-Ⅱ的匯總敏感度為0.75，明顯優(yōu)于AFP。

從檢驗(yàn)診斷學(xué)角度來看，PIVKA-Ⅱ的敏感度和診斷準(zhǔn)確度最高。然而，單一標(biāo)志物對(duì)于腫瘤的檢測(cè)往往存在敏感度或特異度的不足，因此需要在單一標(biāo)志物檢測(cè)基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高肝癌的診斷準(zhǔn)確度。分析以往的研究發(fā)現(xiàn)，AFP 聯(lián)合PIVKA-Ⅱ診斷肝癌的AUC 值多介于0.85~0.90［7，56-57］，而AFP 聯(lián)合GPC-3 的AUC 值多介于0.75~0.90［58-60］，本研究分析結(jié)果與其接近，但三種標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用并未進(jìn)一步提高診斷準(zhǔn)確度。綜合之前的一些薈萃分析結(jié)果，本研究認(rèn)為在臨床上使用兩個(gè)標(biāo)志物的聯(lián)合可以在一定程度上增加診斷效能。雖然本文資料顯示PIVKA-Ⅱ聯(lián)合GPC-3 的AUC 值最高，但相比AFP 聯(lián)合PIVKA-Ⅱ提高較少，同時(shí)AFP 早已廣泛應(yīng)用于臨床，而GPC-3 的臨床應(yīng)用很少，再加上其高昂的檢測(cè)價(jià)格，難以在臨床推廣應(yīng)用。綜合上述考慮，本研究建議臨床診斷肝癌時(shí)可以聯(lián)合應(yīng)用AFP 和PIVKA-Ⅱ這兩個(gè)指標(biāo)，PIVKA-Ⅱ可以降低對(duì)AFP陰性肝癌患者漏診的可能，AFP 可以減少對(duì)維生素K缺乏及服用維生素K拮抗劑患者的誤診。

但是，本研究仍有一定的局限性。首先，納入的GPC-3 相關(guān)研究較少，可能會(huì)使GPC-3 相關(guān)結(jié)果存在誤差。其次，納入的都是回顧性研究，且有個(gè)別研究是在肝癌高危人群中進(jìn)行的，使得研究資料存在異質(zhì)性。因此，本研究結(jié)果還需要通過臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本文附表和附圖見電子版。

志謝研究得到浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019C03050）支持

AcknowledgementsThis work was supported by the Key R&D Plan of Zhejiang Province (2019C03050)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2024. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)