王 威，季文斌，呂振宇，孫萬亮，邵 玉，劉 靜，楊 燕

1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004

2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，安徽 蚌埠 233004

3. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，安徽 蚌埠 233004

膽管癌是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的高度侵襲性惡性腫瘤，近年來總體發(fā)病率不斷攀升。雖然膽管癌的治療已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但患者整體存活率仍然較低，一個(gè)重要原因是膽管癌早期臨床特征不明顯，僅三分之一的患者可以通過手術(shù)治療，術(shù)后患者5年存活率為25%~40%［1］，而大多數(shù)患者確診時(shí)往往處于不可手術(shù)的晚期階段，治療選擇十分有限，5年存活率低于20%［2］。更重要的是，膽管癌缺乏敏感有效的預(yù)后生物標(biāo)志物或者預(yù)后預(yù)測(cè)模型，這些使得膽管癌患者的后續(xù)治療及疾病管理變得困難。因此，探索膽管癌診療靶點(diǎn)及預(yù)后預(yù)測(cè)工具具有重要意義。

SIRT2 是依賴NAD+的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶家族成員之一，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，可調(diào)控代謝和基因表達(dá)等多種生物過程［3］?，F(xiàn)有研究表明，SIRT2在不同惡性腫瘤中的表達(dá)存在差異，在卵巢癌、前列腺癌等腫瘤組織中，SIRT2的表達(dá)顯著低于正常組織；而在黑色素瘤、胃癌等腫瘤組織中，SIRT2 的表達(dá)高于正常組織［4］，這提示SIRT2可能既具有促瘤作用，又具有抑瘤作用。另外值得注意的是，在乳腺癌早期癌變過程中SIRT2 具有顯著的腫瘤抑制作用，而在晚期階段，其過表達(dá)則預(yù)示著腫瘤高侵襲性，抑制SIRT2 具有抗癌效應(yīng)［5］。此外，Li等［6］發(fā)現(xiàn)SIRT2 mRNA和蛋白水平在非小細(xì)胞肺癌中均顯著下調(diào)，而Luo 等［7］觀察到SIRT2在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)顯著升高。這表明SIRT2在惡性腫瘤中的作用是復(fù)雜的且存在爭(zhēng)議。在膽管癌中，SIRT2 被發(fā)現(xiàn)存在顯著過表達(dá)，并可能通過誘導(dǎo)代謝重編程［8］及調(diào)控乙?；疨53 水平［9］促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖、侵襲。鑒于SIRT2 在腫瘤中的復(fù)雜性及爭(zhēng)議性，本研究擬對(duì)SIRT2 在膽管癌中的價(jià)值進(jìn)行進(jìn)一步探究，并為探尋膽管癌術(shù)后生存預(yù)測(cè)模型增添新的數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

從TCGA 下載膽管癌數(shù)據(jù)集，從GEO 下載GSE107943 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，提取SIRT2mRNA 的表達(dá)量。TCGA數(shù)據(jù)集含有36個(gè)膽管癌組織，其中有配對(duì)正常膽管組織的9個(gè)；GSE107943數(shù)據(jù)集含有30個(gè)膽管癌組織，其中有配對(duì)正常膽管組織的27個(gè)。

收集2016年1月1日至2021年12月31日在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療且經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為膽管癌患者的蠟塊標(biāo)本或組織標(biāo)本?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)治療且術(shù)后病理確診為膽管癌；②術(shù)前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療；③重要臨床病理資料完整且可被追溯。排除標(biāo)準(zhǔn)：①多發(fā)癌，繼發(fā)性膽道系統(tǒng)惡性腫瘤；②組織標(biāo)本封存不佳。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共收集到89例術(shù)后膽管癌患者的標(biāo)本，其中有配對(duì)癌旁組織的44 例。本研究通過蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（BYYFY-2018KY46）。收集89 例膽管癌患者的臨床病理特征，包括年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤數(shù)、脈管侵犯情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、神經(jīng)侵犯情況、分化程度，臨床分期等，還有部分常見實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)如糖類抗原199、癌胚抗原、總膽紅素、總膽固醇、三酰甘油等。患者隨訪時(shí)間截至2022年6月1日，通過患者醫(yī)院病歷系統(tǒng)的個(gè)人就診記錄或電話隨訪獲得生存信息，記錄所有患者的總生存期，即手術(shù)日直至患者發(fā)生因?yàn)槿魏卧蛩劳龅臅r(shí)間。

1.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)SIRT2表達(dá)

將組織塊進(jìn)行包埋、切片（4 μm 厚）、烘烤（75 ℃，6 h）后，按照脫蠟、梯度乙醇水化、修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷、封閉、抗原抗體反應(yīng)、DAB 顯色、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、透明、中性樹膠封片等步驟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其中SIRT2 一抗（德國(guó)Gene Tex 公司）稀釋比例為1∶200。由兩位病理學(xué)專家利用光學(xué)顯微鏡對(duì)標(biāo)本染色結(jié)果進(jìn)行盲評(píng)，并取平均值作為最后得分。每個(gè)切片隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍鏡視野（200×），以腫瘤細(xì)胞或癌旁組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為SIRT2 染色陽性。染色信號(hào)強(qiáng)度評(píng)分：無染色為0 分（陰性），淡黃色為1 分（弱，+），黃褐色為2 分（中等，++），褐色為3 分（強(qiáng)，+++）；染色陽性程度根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分：0%~25%為1 分，>25%~50%為2 分，>50%~75%為3 分，>75%為4 分。根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度以及細(xì)胞數(shù)占比的乘積進(jìn)行最終評(píng)分，評(píng)分范圍0~12，以中位數(shù)6 分作為截?cái)嘀担?0］，評(píng)分小于6 分為低表達(dá)組，大于等于6分為高表達(dá)組。

1.3 基因集富集分析及SIRT2關(guān)聯(lián)基因分析

利用R“clusterProfiler”包進(jìn)行基因集富集分析，并繪制富集結(jié)果圖（校正后的P<0.05、FDR<0.25和|NES|>1 認(rèn)為是顯著富集）。使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.linkedomics.org/login.php）探索膽管癌中SIRT2關(guān)聯(lián)基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0、R（3.6.3）及EXCL-VLOOKUP函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行配對(duì)差異分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)；使用Kaplan-Meier生存曲線、Log-Rank檢驗(yàn)及COX 回歸分析進(jìn)行生存分析，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)COX 回歸結(jié)果建立列線圖，R“rms”包、“survival”包進(jìn)行列線圖可視化，R“timeROC”包進(jìn)行時(shí)間依賴性ROC曲線數(shù)據(jù)分析，R“ggplot2”包繪制曲線。

2 結(jié) 果

2.1 SIRT2在膽管癌組織中表達(dá)變化

TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，SIRT2mRNA 在膽管癌組織中較癌旁組織表達(dá)顯著增高（均P<0.05），見圖1A、B。使用GSE107943 數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了無論非配對(duì)組織差異分析，還是配對(duì)組織差異分析，SIRT2mRNA 在膽管癌組織中均存在高表達(dá)（圖1C、D）。研究者隊(duì)列免疫組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示，SIRT2 陽性顆粒主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，多呈淡黃色或棕黃色（圖2）；無論基于非配對(duì)組織差異比較，還是配對(duì)組織差異分析，結(jié)果均顯示SIRT2 在膽管癌組織中的表達(dá)較癌旁組織顯著增高（圖1E、F）。以上結(jié)果提示，SIRT2在膽管癌中存在高表達(dá)。

圖1 膽管癌組織與正常組織中SIRT2 mRNA和蛋白表達(dá)比較Figure 1 Expression of SIRT2 mRNA and protein in cholangiocarcinoma tissues and normal tissues

圖2 兩個(gè)代表性膽管癌標(biāo)本及其配對(duì)癌旁組織中SIRT2的表達(dá)情況Figure 2 SIRT2 expression in two representative cholangiocarcinoma samples and their paired adjacent non-cancerous tissues

2.2 膽管癌組織中基因集富集分析及SIRT2 關(guān)聯(lián)基因分析結(jié)果

SIRT2 高表達(dá)患者膽管癌組織中核糖體、氧化磷酸化、脂肪酸代謝、氨基酸代謝、丙酮酸代謝等途徑顯著富集（圖3），提示SIRT2 高表達(dá)可能參與調(diào)控膽管癌患者腫瘤組織代謝。進(jìn)一步基于LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到SIRT2 正負(fù)相關(guān)的蛋白，正相關(guān)分子包括ATG4A、SMPD1、NFKBIB等（圖4A），負(fù)相關(guān)分子包括ZNF624、SMARCC1、ACVR2B等（圖4B）。

圖3 膽管癌組織中SIRT2高表達(dá)的主要基因集富集分析結(jié)果Figure 3 Main results of gene set enrichment analysis in cholangiocarcinomain with up-regulated SIRT2

圖4 膽管癌組織中SIRT2關(guān)聯(lián)分子熱圖Figure 4 Heat map of SIRT2-associated molecules in cholangiocarcinoma

2.3 SIRT2 表達(dá)與膽管癌患者臨床病理特征的關(guān)系

針對(duì)膽管癌患者的研究者隊(duì)列數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，SIRT2 表達(dá)與膽管癌患者術(shù)前血三酰甘油水平、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和腫瘤大小顯著相關(guān)（均P<0.05），表現(xiàn)為SIRT2 低表達(dá)患者更易出現(xiàn)高甘油三酯血癥，SIRT2 高表達(dá)患者更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和負(fù)荷更大的腫瘤。見表1。

表1 SIRT2表達(dá)與膽管癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 The relationship between SIRT2 expression level and the clinicopathological characteristics in patients with cholangiocarcinoma[n(%)]

2.4 SIRT2 表達(dá)與膽管癌患者術(shù)后總生存期的關(guān)系

89 例膽管癌手術(shù)患者中位總生存期為23 個(gè)月。Kaplan-Meier 生存分析提示，SIRT2 高表達(dá)組總生存期較低表達(dá)組明顯縮短（分別為21 和29 個(gè)月，HR=1.71，95%CI：1.06~2.77，P<0.05），見圖5。結(jié)果提示SIRT2 表達(dá)與膽管癌患者術(shù)后總生存期相關(guān)。

圖5 基于研究者隊(duì)列SIRT2高、低表達(dá)組膽管癌患者Kaplan-Meier生存曲線Figure 5 Kaplan-Meier survival curves in high and low SIRT2 expression groups based on the study cohort

2.5 影響膽管癌患者術(shù)后總生存期的單因素和多因素COX回歸分析

單因素COX 回歸分析結(jié)果顯示，組織分化程度（HR=1.981，95%CI：1.181~3.323，P<0.05）、TNM分期（HR=2.521，95%CI：1.392~4.566，P<0.01）、是否接受后續(xù)治療（HR=0.586，95%CI：0.351~0.977，P<0.05）及SIRT2 表達(dá)（HR=1.897，95%CI：1.127~3.193，P<0.05）與膽管癌術(shù)后患者總生存期顯著相關(guān)（表2）；多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期（HR=2.100，95%CI：1.129~3.904，P<0.05）和SIRT2 表達(dá)（HR=1.726，95%CI：1.102~2.944，P<0.05）是膽管癌術(shù)后患者總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（表3）。

表2 影響膽管癌患者預(yù)后的單因素回歸分析結(jié)果Table 2 Univariate regression analysis results of prognostic factors in patients with cholangiocarcinoma

表3 影響膽管癌患者預(yù)后的多因素回歸分析結(jié)果Table 3 Multivariate regression analysis results of prognostic factors in patients with cholangiocarcinoma

2.6 膽管癌術(shù)后患者預(yù)后列線圖模型的構(gòu)建及驗(yàn)證

根據(jù)上述COX 回歸分析得出的影響膽管癌術(shù)后患者預(yù)后的因素，并結(jié)合有意義的重要臨床病理參數(shù)構(gòu)建列線圖模型（圖6），預(yù)測(cè)模型顯示得分越高的患者，所對(duì)應(yīng)的預(yù)后越差。利用校準(zhǔn)曲線驗(yàn)證該預(yù)測(cè)模型的性能，發(fā)現(xiàn)與參考曲線擬合度較高，C 指數(shù)=0.675（0.638~0.712）（圖7）。列線圖模型、AJCC 第八版TNM 分期系統(tǒng)預(yù)測(cè)膽管癌患者1、2、3年存活的ROC 曲線顯示，列線圖模型預(yù)測(cè)患者1、2、3年預(yù)后的AUC 分別為0.879、0.778、0.953，AJCC 第八版TNM 分期系統(tǒng)預(yù)測(cè)患者1、2、3年預(yù)后的AUC分別為0.745、0.621、0.612（圖8），提示該模型預(yù)測(cè)膽管癌術(shù)后患者生存較傳統(tǒng)TNM分期效能更佳。

圖6 基于研究者隊(duì)列膽管癌患者預(yù)后因素構(gòu)建的列線圖模型Figure 6 Prognostic nomogram of cholangiocarcinoma patients based on the study cohort

圖7 列線圖模型用于預(yù)測(cè)膽管癌患者術(shù)后總存活率的校準(zhǔn)曲線Figure 7 Calibration plots of the developed nomogram model for predicting overall survival rate of postoperative patients with cholangiocarcinoma

圖8 列線圖模型及TNM 分期系統(tǒng)預(yù)測(cè)膽管癌患者術(shù)后預(yù)后情況的ROC曲線Figure 8 Receiver operating characteristic curves for predicting the postoperative prognosis of patients with cholangiocarcinoma using nomogram model and TNM staging system

3 討 論

SIRT2 是NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶，其表達(dá)異常與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病有關(guān)［11］。本研究通過TCGA、GEO 公共數(shù)據(jù)庫(kù)組學(xué)數(shù)據(jù)及研究者隊(duì)列免疫組織化學(xué)染色結(jié)果綜合分析表明，膽管癌患者腫瘤組織中SIRT2 表達(dá)較癌旁組織顯著增高。這一結(jié)果與既往關(guān)于SIRT2在膽管癌中的初步探索結(jié)果一致［8］，證實(shí)了SIRT2 在膽管癌中顯著過表達(dá)，提示SIRT2 高表達(dá)可能促進(jìn)了膽管癌的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)，SIRT2可以通過去乙酰化不同的內(nèi)源性底物，參與糖、脂代謝等生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)［12］。在膽管癌中，Xu等［8］發(fā)現(xiàn)SIRT2/cMYC誘導(dǎo)的代謝重編程可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡；王平安［9］發(fā)現(xiàn)，SIRT2可能通過調(diào)控乙?；疨53水平影響肝內(nèi)膽管癌腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究通過基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，SIRT2高表達(dá)顯著富集多種代謝相關(guān)通路，如核糖體、脂肪酸代謝、氧化磷酸化、氨基酸代謝、丙酮酸代謝等。眾所周知，腫瘤細(xì)胞在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中可以通過代謝重編程賦予腫瘤細(xì)胞存活和增殖的能力。如癌細(xì)胞會(huì)通過“Warburg效應(yīng)”促進(jìn)糖酵解，從而提供腫瘤增殖所需的養(yǎng)分及能量［13］。此外，研究發(fā)現(xiàn)某些脂肪酸和氨基酸如谷氨酰胺、絲氨酸和甘氨酸是促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝調(diào)節(jié)劑［14-15］。結(jié)合現(xiàn)有研究及本文生物信息學(xué)分析結(jié)果，推測(cè)SIRT2 可能在膽管癌中通過調(diào)控糖、脂質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)的異常代謝促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這值得進(jìn)一步研究。

本研究臨床病理特征分析提示，SIRT2 的表達(dá)與患者術(shù)前血三酰甘油水平、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和腫瘤大小存在相關(guān)性。既往研究發(fā)現(xiàn)，SIRT2 表達(dá)與腫瘤分化程度、腫瘤大小存在關(guān)聯(lián)［8］，本研究結(jié)果與其部分一致，共同提示SIRT2可能與膽管癌患者某些惡性表型相關(guān)。針對(duì)SIRT2 表達(dá)與膽管癌患者血清三酰甘油水平的關(guān)系，與基因集富集分析結(jié)果部分相符，進(jìn)一步佐證了SIRT2 可能參與了膽管癌患者的脂質(zhì)代謝紊亂調(diào)控。本研究基于大數(shù)據(jù)分析得到了SIRT2 的關(guān)聯(lián)分子，為后續(xù)SIRT2 的深入機(jī)制研究提供了方向。

本研究分析了SIRT2 表達(dá)與膽管癌術(shù)后患者預(yù)后的相關(guān)性。國(guó)外一項(xiàng)最新研究報(bào)道了1124 例切緣陰性的膽管癌患者中位總生存期為45.1個(gè)月［16］。本研究納入的89例膽管癌患者中位總生存期為23個(gè)月，較前者總生存期短，可能與本研究納入膽管癌患者病例數(shù)較少、樣本特點(diǎn)不同以及國(guó)內(nèi)外疾病的綜合管理差異有關(guān)。與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究報(bào)道膽管癌患者術(shù)后中位總生存期為13個(gè)月［17］，與本研究相比較低，可能原因是該研究納入人群時(shí)間跨度較大（2013—2021年），而近些年國(guó)內(nèi)膽管癌的治療有所發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT2高表達(dá)的膽管癌患者預(yù)后較SIRT2低表達(dá)患者差，這與Xu 等［8］的研究一致，共同揭示了SIRT2在膽管癌患者中的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值?；谘芯空哧?duì)列的膽管癌患者預(yù)后單因素COX回歸分析表明，TNM分期、SIRT2表達(dá)、腫瘤分化程度、是否接受后續(xù)治療與膽管癌患者生存相關(guān)，多因素COX回歸分析結(jié)果提示SIRT2表達(dá)和TNM分期是術(shù)后膽管癌患者生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素?？梢姡瑹o論從單因素還是多因素COX分析結(jié)果來看，SIRT2均有預(yù)測(cè)膽管癌術(shù)后患者預(yù)后的重要價(jià)值。探尋有效的生存預(yù)測(cè)模型對(duì)于膽管癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、疾病分層管理以及改善預(yù)后尤為重要。因此，本研究最后基于SIRT2 構(gòu)建了一個(gè)新型列線圖預(yù)后模型，并且該模型被證實(shí)有較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，可能較AJCC第八版TNM 分期系統(tǒng)預(yù)測(cè)效能更佳。但本研究仍存在部分不足：①本研究數(shù)據(jù)基于生物信息學(xué)分析及單中心隊(duì)列研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在推廣前仍需進(jìn)一步驗(yàn)證；②本研究納入人群為膽管癌患者，尚未對(duì)亞類進(jìn)行細(xì)分，因此結(jié)果的廣泛適用性存在一定局限；③本研究雖然揭示了SIRT2 在膽管癌中的預(yù)后價(jià)值并基于生物信息學(xué)分析初探了其可能的作用機(jī)制，但具體分子機(jī)制仍有待設(shè)計(jì)精良的體內(nèi)外研究進(jìn)一步揭示。

綜上所述，本研究通過公共數(shù)據(jù)庫(kù)及研究者隊(duì)列數(shù)據(jù)揭示了SIRT2在膽管癌中的表達(dá)及臨床價(jià)值，并基于SIRT2構(gòu)建了有效生存預(yù)測(cè)模型，研究不僅豐富了膽管癌發(fā)病機(jī)制研究，也為臨床醫(yī)生更好地管理該類疾病患者提供新的預(yù)后預(yù)測(cè)工具。

志謝研究得到安徽省教育廳高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（2023AH040291）、安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃（gxyq2022042）、蚌埠醫(yī)學(xué)院“512人才培育計(jì)劃”（by51202 208）支持

AcknowledgementsThis study was supported by the Natural Science Research Major Project of Universities of Anhui Province (2023AH040291), Excellent Youth Talents Support Program in Higher Education Institutions of Anhui Province (gxyq2022042), and 512 Talent Cultivation Plan of Bengbu Medical College (by51202208)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2024. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)