裴少君 歐喜超

2022年,全球估算新發(fā)結(jié)核病患者1060萬例,其中,耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病患者45萬例[1]。推廣應(yīng)用快速準(zhǔn)確的藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)技術(shù)對于耐藥結(jié)核病患者早期診斷具有重要臨床意義。近些年,隨著快速分子藥敏檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用,利福平耐藥篩查率得到顯著提高[2]。2012年,全球僅7%的病原學(xué)陽性結(jié)核病患者接受利福平耐藥性檢測[3];到2022年,病原學(xué)陽性結(jié)核病患者利福平耐藥篩查率增加到73%[1],并且在此期間,開展耐多藥/利福平耐藥治療的患者從77 321例增加到175 650例,充分表明實(shí)驗(yàn)室診斷在指導(dǎo)結(jié)核病治療決策中的核心作用[1,3]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)建議對所有結(jié)核病患者進(jìn)行利福平和異煙肼耐藥性檢測,并且對耐多藥/利福平耐藥患者進(jìn)行氟喹諾酮類(fluoroquinolones,FQs)藥物耐藥性檢測[4]。已有商品化的分子藥敏檢測試劑盒可以完成上述藥物耐藥性的檢測[5-6],但目前尚缺乏能夠快速診斷抗結(jié)核新藥和再利用藥物耐藥性的分子檢測技術(shù)[7-9]。WHO在2023年7月發(fā)布《應(yīng)用新一代靶向測序技術(shù)檢測耐藥結(jié)核病:快速通告,2023》,推薦了幾種基于靶向測序的耐藥結(jié)核病分子診斷技術(shù)[10]。新一代靶向測序技術(shù)可以通過對臨床標(biāo)本直接檢測,實(shí)現(xiàn)對十幾種抗結(jié)核藥物耐藥性的快速判定,但基于目前對部分二線抗結(jié)核藥物尤其是新藥的耐藥分子機(jī)制仍然知之甚少,從而限制了靶向測序耐藥檢測技術(shù)的檢測效能。

2021年WHO發(fā)布第1版《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄》(以下簡稱《目錄》),第1版《目錄》包含高質(zhì)量、全面的表型耐藥相關(guān)基因突變列表及其置信度分級[11],但納入菌株的地理區(qū)域代表性較差,且有關(guān)新藥和再利用藥物耐藥相關(guān)基因突變的數(shù)據(jù)非常有限。因此,WHO于2023年修訂并發(fā)布《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄(第2版)》。新版《目錄》包含約52 000株結(jié)核分枝桿菌的全基因組測序數(shù)據(jù)及表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果,納入分析菌株數(shù)量較第1版增加14 000株,同時(shí),修訂的《目錄》創(chuàng)建了分析方法,藥物覆蓋范圍也更加全面,包括所有一線抗結(jié)核藥物(利福平、異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺),以及A組(左氧氟沙星、莫西沙星、貝達(dá)喹啉、利奈唑胺)、B組(氯法齊明)和C組(德拉馬尼、阿米卡星、鏈霉素、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺)二線藥物。筆者重點(diǎn)從第1、2版《目錄》差異入手,對《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄(第2版)》進(jìn)行解讀。

一、優(yōu)化分析流程

第2版《目錄》相較于第1版,提供了更加集中、高效、開源、可持續(xù)的分析流程,以減少未來《目錄》更新的工作量。在第1版《目錄》中,所有表型/基因型藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)和所有計(jì)算過程,均基于訪問受限的學(xué)術(shù)高性能計(jì)算集群。在第2版《目錄》中,所有數(shù)據(jù)和計(jì)算過程都轉(zhuǎn)移到WHO監(jiān)督的云服務(wù)器中,構(gòu)建基于開源關(guān)系型數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)的樣本標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(GenPhenSQL),并將后續(xù)生物信息學(xué)處理及耐藥相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分級的分析流程存儲(chǔ)在Github中(https://github.com/GTB-tbsequencing/mutation-catalogue-2023)。整個(gè)分析流程可移植到任何云服務(wù)器上運(yùn)行,實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)的規(guī)范化管理與標(biāo)準(zhǔn)化分析。

(一)數(shù)據(jù)采集

第1版《目錄》涵蓋的菌株相關(guān)分析數(shù)據(jù)集主要來自出版物、CRyPTIC聯(lián)盟,以及各個(gè)國家為響應(yīng)WHO全球結(jié)核病規(guī)劃貢獻(xiàn)的呼吁而直接提交的數(shù)據(jù)集。第2版《目錄》在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了與國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)或歐洲核苷酸檔案館數(shù)據(jù)庫(European Nucleotide Archive,ENA)的同步更新,可以獲取更多公開數(shù)據(jù)。因此,第2版《目錄》納入菌株數(shù)量更多,67個(gè)國家貢獻(xiàn)菌株數(shù)量大于5株,耐藥菌株所占比例也有顯著提升,尤其是新藥及再利用藥物耐藥菌株。

(二)表型藥敏數(shù)據(jù)

第2版《目錄》對表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的可信度進(jìn)行了更細(xì)致分層。其根據(jù)WHO對不同藥敏試驗(yàn)方法的認(rèn)可程度,將表型藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)分為8個(gè)層級,前3個(gè)層級為使用WHO推薦試驗(yàn)方法得到的數(shù)據(jù)集(WHO數(shù)據(jù)集)。第1層級包括根據(jù)最新WHO推薦的關(guān)鍵濃度[5,12]所得到的基于固體培養(yǎng)或者M(jìn)GIT液體培養(yǎng)方法的藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù),以及以1 mg/L作為利福平關(guān)鍵濃度和以0.4 mg/L作為異煙肼關(guān)鍵濃度獲得的顯微鏡觀察藥敏試驗(yàn)(MODS)數(shù)據(jù)[13-14];第2層級為基于低于之前WHO推薦的關(guān)鍵濃度,但高于當(dāng)前WHO推薦的關(guān)鍵濃度獲得的莫西沙星藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)[15];第3層級包括根據(jù)基于之前的WHO推薦的關(guān)鍵濃度所得到的基于固體培養(yǎng)或者M(jìn)GIT、BACTECTM460液體培養(yǎng)方法的藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù);第4層級包括未標(biāo)注所采用WHO推薦關(guān)鍵濃度版本的基于固體培養(yǎng)或者M(jìn)GIT BACTECTM460液體培養(yǎng)方法獲得的藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù);第5～8層級為其他表型藥敏試驗(yàn)方法獲得的數(shù)據(jù),包括基于微量肉湯稀釋法的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)藥敏試驗(yàn)等。這種分層方式能夠創(chuàng)建更為標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)集,為后續(xù)分析奠定基礎(chǔ)。

(三)全基因組數(shù)據(jù)分析方法

第2版《目錄》對全基因組測序數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行了更新,采用Freebayes識別小于15 bp的變異,并加入delly識別大片段缺失,可獲得更為全面和準(zhǔn)確的變異列表。保留等位基因頻率≥75%(第1版為90%)的變異進(jìn)行后續(xù)關(guān)聯(lián)分析,同時(shí),對等位基因頻率閾值下調(diào)到25%進(jìn)行額外評估,有助于探究異質(zhì)性耐藥對藥敏試驗(yàn)結(jié)果的影響。除此之外,第2版《目錄》采用人類基因組變異協(xié)會(huì)命名法對變異進(jìn)行了規(guī)范化注釋。

(四)基因突變耐藥關(guān)聯(lián)分級方法

第2版《目錄》補(bǔ)充完善基因突變與耐藥相關(guān)性分級方法,擴(kuò)充了候選耐藥基因,并規(guī)范了其上游/增強(qiáng)子序列的范圍。第1版《目錄》僅包括了49個(gè)候選耐藥基因,第2版《目錄》擴(kuò)充到68個(gè),增加的基因包括參與甘油代謝的glpK,以及參與類固醇和有機(jī)酸代謝的Rv1129c等,部分基因從第1版《目錄》候選基因中移除,例如,fprA及aftB從阿米卡星的第2層級耐藥候選基因中移除。第1版《目錄》中候選耐藥突變的范圍包括各個(gè)耐藥候選基因及其上游100 bp的范圍,第2版《目錄》中對每個(gè)基因的上游區(qū)域都進(jìn)行了定義。第2版《目錄》進(jìn)一步完善“附加分級規(guī)則”。例如,修訂了功能缺失突變的定義,將框內(nèi)突變從功能缺失突變中移除;將交叉耐藥性加入附加規(guī)則中,Rv0678和pepQ突變會(huì)導(dǎo)致貝達(dá)喹啉和氯法齊明交叉耐藥,fabG1和inhA突變會(huì)導(dǎo)致乙硫異煙胺和異煙肼交叉耐藥(表1)。第2版《目錄》修改了第4/5組(可能與敏感相關(guān)的突變)算法,僅將在WHO數(shù)據(jù)集中,突變單獨(dú)發(fā)生時(shí)的陽性預(yù)測值95%置信區(qū)間上限小于10%的突變列為第4/5組,將不滿足上述要求的同義突變也歸為第4組。

表1 世界衛(wèi)生組織《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄(第2版)》基因突變與耐藥相關(guān)性分級候選耐藥基因

二、更新耐藥基因突變目錄

(一)基因突變及其分級列表

第2版《目錄》共有246個(gè)1組(與耐藥相關(guān))突變,其中,包括53個(gè)第1版的2組突變及18個(gè)第1版的3組突變,另有8個(gè)突變未出現(xiàn)在第1版《目錄》。第2版《目錄》共有1122個(gè)2組(暫定與耐藥相關(guān))突變,包括107個(gè)第1版3組突變,126個(gè)未在第1版《目錄》中出現(xiàn)的突變。需要注意的是,第1版《目錄》中有13個(gè)1組突變下調(diào)到了2/3組。此外,第1版《目錄》的106個(gè)2組突變下調(diào)到第 3/4 組,主要是框內(nèi)突變(表2)。新藥和再利用藥物耐藥相關(guān)基因突變顯著增多,其中,貝達(dá)喹啉、氯法齊明在第1版《目錄》中未找到滿足1/2組要求的突變,第2版《目錄》中貝達(dá)喹啉增加了5個(gè)1組突變和81個(gè)2組突變,氯法齊明增加了2個(gè)1組突變及56個(gè) 2組突變。對于利奈唑胺,第1版《目錄》有1個(gè) 1組突變,第2版《目錄》在此基礎(chǔ)上增加了7個(gè)2組突變。對于德拉馬尼,第1版《目錄》有1個(gè)2組突變,第2版《目錄》在此基礎(chǔ)上又增加了23個(gè)2組突變。除此之外,第2版《目錄》對異煙肼和莫西沙星的耐藥相關(guān)突變進(jìn)行了高/低水平耐藥的標(biāo)注。

(二)基因型耐藥預(yù)測性能

第2版《目錄》對大多數(shù)藥物基因型耐藥預(yù)測效能值與第1版《目錄》較為接近,1組和2組突變組合預(yù)測的敏感度≥70%,特異度≥90%(表3)。2組突變對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及氟喹諾酮類藥物的耐藥預(yù)測效能無明顯影響,但對于吡嗪酰胺和乙硫異煙胺,2組突變能夠明顯增加其耐藥預(yù)測效能。第2版《目錄》對新藥和再利用藥物的基因型耐藥預(yù)測效能均明顯提升,但耐藥檢測敏感度仍不足50%,對新藥和再利用藥物的耐藥機(jī)制還有待深入研究。

表3 世界衛(wèi)生組織《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄(第2版)》基因型耐藥預(yù)測效能

三、未來《目錄》研究展望

(一)完善數(shù)據(jù)集

通過收集更多菌株全基因組測序和抗結(jié)核藥物MIC數(shù)據(jù),用以探究基因突變與耐藥水平高低的相關(guān)性?！督Y(jié)核病整合指南模塊3:診斷:結(jié)核病快速診斷》中表明,異煙肼和莫西沙星的耐藥水平對治療效果具有明顯影響[4],但目前關(guān)于不同耐藥基因突變類型所造成的耐藥程度差異還有待進(jìn)一步證實(shí)。例如,是否所有katG突變都會(huì)賦予高水平異煙肼耐藥性,對于較罕見的氟喹諾酮類藥物耐藥突變,需要更多的MIC值去確定其耐藥水平的高低[15-16]。一些突變僅造成MIC值的小幅升高,如果僅升高到臨界濃度附近,則很難對其進(jìn)行耐藥與敏感的精準(zhǔn)判讀[17-18]。需要進(jìn)一步增加納入分析數(shù)據(jù)的代表性,降低數(shù)據(jù)偏倚;同時(shí),還要覆蓋更多譜系菌株以探究譜系對耐藥性的影響[19-20],并收集更多既有耐藥菌株又有敏感菌株的數(shù)據(jù)集,以降低對耐藥性的高估。

(二)優(yōu)化分析流程

關(guān)于測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析流程,應(yīng)進(jìn)一步加入大片段插入(如IS6110)分析,研究其對藥物耐藥性的影響[21],并從核苷酸水平探究核苷酸突變對耐藥性的影響,包括導(dǎo)致同一氨基酸突變的不同核苷酸突變對耐藥性的影響[22-23]。現(xiàn)有生物信息學(xué)分析流程主要針對二代高通量測序數(shù)據(jù),未來應(yīng)考慮構(gòu)建同時(shí)適用于三代測序數(shù)據(jù)的分析流程。對于基因突變耐藥關(guān)聯(lián)分級方法,一方面要繼續(xù)優(yōu)化“附加分級規(guī)則”,例如rpoBT427A雖然在利福平耐藥性決定區(qū)(RRDR)中,但可能不導(dǎo)致利福平耐藥[24-25]。還需要繼續(xù)更新候選耐藥基因,例如,dprE2(Rv3791)可能是德拉馬尼和普托馬尼的潛在耐藥相關(guān)基因[26]。未來建議通過加入回歸等其他的分級方法,對補(bǔ)償性及上位性突變進(jìn)行深入研究與分類。

四、結(jié)語

目前,商品化分子藥敏檢測試劑盒已廣泛應(yīng)用于臨床耐藥結(jié)核病診斷。隨著測序技術(shù)的普及,以高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)的新一代靶向測序試劑盒也將逐步應(yīng)用于耐藥結(jié)核病診斷。這些技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)獲得多種藥物的耐藥性信息,進(jìn)而指導(dǎo)治療決策。分子藥敏檢測技術(shù)可靠性和實(shí)用性的提高取決于對抗結(jié)核藥物耐藥機(jī)制研究的不斷進(jìn)步,《目錄》可為分子藥敏檢測靶標(biāo)選擇提供標(biāo)準(zhǔn)化參考。但當(dāng)前《目錄》的算法僅考慮藥物候選基因突變與耐藥的相關(guān)性,未能對新的耐藥相關(guān)基因進(jìn)行挖掘?；凇赌夸洝匪a(chǎn)生的海量數(shù)據(jù),未來在機(jī)器學(xué)習(xí)及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法的支持下,可以嘗試從基因組學(xué)出發(fā),對新的耐藥相關(guān)基因進(jìn)行探究[27-28]。此外,《目錄》在實(shí)用性上也有待進(jìn)一步提升?！赌夸洝分?組和2組突變位點(diǎn)與目前商品化分子檢測試劑盒的檢測靶點(diǎn)存在一定的差異(如ahpC突變位點(diǎn)),且《目錄》中包含的耐藥突變位點(diǎn)數(shù)目眾多,但商品化分子藥敏檢測所能覆蓋的檢測靶點(diǎn)有限,需要篩選出發(fā)生頻率高、與高水平耐藥相關(guān)等特征的突變位點(diǎn)作為商品化分子藥敏檢測試劑盒的檢測靶點(diǎn)。因此,建議未來《目錄》對目前已有的分子藥敏檢測技術(shù)覆蓋的檢測靶點(diǎn)進(jìn)行評估,并且對耐藥相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行靶點(diǎn)推薦性排序。除此之外,還需要考慮《目錄》在更新過程中的一致性。例如,第2版《目錄》與第1版《目錄》在突變的命名上有較大的改變,不利于對兩版《目錄》進(jìn)行對照。建議對每次更新過程中新增和移除的耐藥相關(guān)突變進(jìn)行額外評估,為更新的必要性提供更多的證據(jù)支撐。未來,相信《目錄》在更多數(shù)據(jù)集的支持下,將能夠進(jìn)一步提高通過耐藥基因突變預(yù)測抗結(jié)核藥物耐藥性的效能,尤其是對新藥和再利用藥物耐藥性的預(yù)測。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)裴少君:采集數(shù)據(jù)、起草文章;歐喜超:起草文章、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱和指導(dǎo)