蔣力維,霍雨萌,吳一荻,楊 哲,余 磊,孫小杰,呂建霞

1.國家毒品實(shí)驗(yàn)室北京分中心,北京 100164

2.SCIEX公司中國亞太應(yīng)用支持中心,上海 200050

精神活性物質(zhì)是一類攝入人體后會對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈精神藥理作用的化合物,具有易成癮性。濫用精神活性物質(zhì)可導(dǎo)致幻聽、妄想等多種神經(jīng)行為障礙。精神活性物質(zhì)與抗生素等其他藥物一樣[1-2],主要是通過與其生產(chǎn)、消費(fèi)等有關(guān)的人類活動進(jìn)入環(huán)境。環(huán)境中常見的精神活性物質(zhì)主要包括甲基苯丙胺、苯丙胺、氯胺酮、美沙酮和海洛因等[3-5]。精神活性物質(zhì)進(jìn)入生物體后不能被完全代謝,未被代謝的母體化合物或代謝產(chǎn)物可經(jīng)尿液或糞便等排泄物進(jìn)入污水系統(tǒng)[6]。我國污水處理廠主要采用的污水處理工藝目前還無法完全除去污水中的精神活性物質(zhì)及其代謝物。未被去除的精神活性物質(zhì)會隨污水進(jìn)入自然水體,甚至污染飲用水,對公眾健康和水生生態(tài)系統(tǒng)健康造成潛在危害[7]。精神活性物質(zhì)可調(diào)節(jié)生物體的中樞神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致暴露于環(huán)境中的生物體的行為(如晝夜節(jié)律、進(jìn)食速度、社會特征等)發(fā)生改變[8-9]。水生生物體若長期處于低濃度精神活性物質(zhì)環(huán)境中,可能會表現(xiàn)出慢性中毒現(xiàn)象。除此之外,水環(huán)境中存在的工業(yè)中間體、農(nóng)藥殘留、治療藥物、多環(huán)芳烴等有機(jī)污染物及重金屬可能會進(jìn)一步引發(fā)相加或協(xié)同作用,從而對水生生物產(chǎn)生更大的毒性[10-11]。自然界中的各類生物的生存都離不開水,因而所有生物都有可能會受到水環(huán)境中的精神活性物質(zhì)的直接或間接影響。綜上,精神活性物質(zhì)可被視為一類新型環(huán)境污染物。

開展水環(huán)境精神活性物質(zhì)研究不僅有利于完善環(huán)境監(jiān)測與生態(tài)安全評價(jià)體系,而且可在一定程度上為區(qū)域禁毒工作提供精準(zhǔn)線索,在預(yù)防和打擊毒品犯罪等方面發(fā)揮積極作用。因此,開發(fā)簡單、快速、高效的水環(huán)境精神活性物質(zhì)檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。截至目前,相關(guān)國家和地區(qū)針對水環(huán)境精神活性物質(zhì)檢測技術(shù)已開展了大量研究,其中氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法(GC-MS/MS)[12-13]與液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法(LC-MS/MS)[14-16]是較為常用的檢測技術(shù)。GC-MS/MS可對多種精神活性物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析,但由于水樣中的大多數(shù)化合物的極性太強(qiáng)或揮發(fā)性較差,故需要對分析物進(jìn)行衍生化反應(yīng)。然而,衍生過程煩瑣,往往需花費(fèi)大量時(shí)間,并可能引發(fā)副反應(yīng),進(jìn)而產(chǎn)生一系列干擾物。LC-MS/MS不僅具有較高的靈敏度和選擇性,而且無需對樣品進(jìn)行衍生化處理,分析過程操作簡便,能用于熱穩(wěn)定性、低揮發(fā)性、高極性化合物的測定,因而其在精神活性物質(zhì)檢測方面的應(yīng)用最為廣泛[17-20]。

由于水環(huán)境中精神活性物質(zhì)的濃度極低,僅為ng/L級別,故常需對樣品進(jìn)行液相萃取(LLE)或固相萃取(SPE)后才能進(jìn)樣分析[21-24],但此過程需要耗費(fèi)大量的時(shí)間與材料。本實(shí)驗(yàn)基于具有高靈敏度的質(zhì)譜系統(tǒng),探索不經(jīng)前處理富集而直接進(jìn)樣的方式,針對水中10種精神活性物質(zhì)開發(fā)了一套簡單、快速的LC-MS/MS方法。同時(shí),通過將本方法檢測結(jié)果與在線和離線SPE-LC-MS/MS檢測結(jié)果進(jìn)行對比,驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性和有效性,以更好地應(yīng)用于實(shí)際污水樣品分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

液相色譜儀-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國SCIEX,Triple Quad 7500),超純水發(fā)生器(美國Millipore,Milli-Q Reference),超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,KQ-500E)。甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(色譜純)均購自美國Thermo Scientific公司。10種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液(1.0 mg/mL,純度>99%)以及相應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)物溶液(100 μg/mL,純度>99%)購于美國Sigma-Aldrich公司,具體信息見表1。

表1 精神活性物質(zhì)及其氘代內(nèi)標(biāo)物基本信息

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取濃度為1.0 mg/mL的嗎啡、苯丙胺和甲基苯丙胺等10種單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液,用甲醇配制成濃度為250 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液,密封并0～4 ℃保存。

混合氘代內(nèi)標(biāo)工作溶液：分別移取濃度為100 μg/mL的嗎啡、苯丙胺和甲基苯丙胺等10種單一標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)物溶液,用甲醇配制成濃度為12.5 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)工作溶液,密封并0～4 ℃保存。

1.3 測定方法

1.3.1 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源(ESI)：正離子模式(+);監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓(IS)：1 500 V;氣簾氣壓力(CUR)：32 psi(1 psi=6.895 kPa);碰撞氣壓力(CAD)：9 psi;霧化氣壓力(GS1)：40 psi;輔助加熱氣壓力(GS2)：70 psi;輔助氣溫度：500 ℃。各化合物的具體質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 10種精神活性物質(zhì)及其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.2 色譜條件

研究組:該組患者在參照組治療基礎(chǔ)上與消化內(nèi)鏡聯(lián)合使用,首先對患者胃臟內(nèi)出血位置予以明確,之后利用氯化鈉注射液沖洗出血位置。待充分顯露后予以凝血酶和去甲腎上腺素冷進(jìn)行止血?；颊咄瓿墒中g(shù)后需告知禁食,時(shí)間為2天。

選用Kinetex Biphenyl色譜柱(美國Phenomenex,100 mm×3.0 mm,2.6 μm),柱溫為35 ℃,流動相A為1 mmol/L甲酸銨-0.01%甲酸水溶液,流動相B為乙腈,流速為0.4 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL。梯度洗脫程序：0～1.0 min,5%B;1.0～2.0 min,5%B～40%B;2.0～3.0 min,40%B～90%B;3.0～6.0 min,90%B～95%B;6.0～7.0 min,95%B;7.0～7.1 min,95%B～5%B。

1.4 樣品采集和保存

使用玻璃瓶收集24 h混合水樣500 mL,酸化到pH為2并冷藏(4 ℃)。如果樣品不能酸化,建議在進(jìn)行樣品處理前將其于-20 ℃條件下冷凍保存,并在一周內(nèi)完成相關(guān)前處理[25]。

1.5 樣品前處理

取10 mL污水,加入100 μL一定濃度的甲酸銨與甲酸緩沖溶液,使污水中甲酸銨的最終濃度為1 mmol/L,甲酸含量為0.01%。加入20 μL濃度為12.5 μg/L的混合氘代內(nèi)標(biāo),使內(nèi)標(biāo)物的最終濃度為25 ng/L。樣品經(jīng)離心后,過0.22 μm濾膜,待LC-MS/MS進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于目標(biāo)物均有含氮的堿性基團(tuán),所以選用正離子模式電噴霧離子源。在質(zhì)荷比(m/z)為100～350的范圍內(nèi)進(jìn)行母離子掃描,找到每種分析物的穩(wěn)定準(zhǔn)分子離子([M+H]+)峰,然后分別以得到的分子離子作為母離子進(jìn)行子離子掃描分析,選擇兩對最佳子離子作為定量與定性子離子。通過優(yōu)化碰撞能量等參數(shù),確保每種化合物的特征碎片離子對的效果達(dá)到最好。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2。

2.2 色譜條件優(yōu)化

色譜柱類型對分析物的分離度、對稱性、保留時(shí)間及響應(yīng)值有關(guān)鍵影響。Kinetex Biphenyl色譜柱利用核-殼技術(shù),在硅膠表面修飾具有芳香族選擇性的基團(tuán),具備疏水性選擇性、芳香族選擇性和增強(qiáng)的極性選擇性等,可以為本實(shí)驗(yàn)中的10種目標(biāo)物質(zhì)提供較好的分離效果。

2.2.1 流動相的選擇

當(dāng)使用水和甲醇為流動相時(shí),部分物質(zhì)的峰形并不理想。實(shí)驗(yàn)考察了甲酸、甲酸銨等添加劑對色譜分離效果及靈敏度的影響,發(fā)現(xiàn)在流動相中加入甲酸與甲酸銨后,不僅各物質(zhì)的拖尾現(xiàn)象能得到明顯改善,而且響應(yīng)也顯著增強(qiáng)。出現(xiàn)該情況一方面是由于甲酸與甲酸銨組成的緩沖體系可使各化合物的電離狀態(tài)保持一致,從而改善具有含氮堿性基團(tuán)的目標(biāo)物的峰形;另一方面則是由于甲酸能夠在正離子模式下提供H+,從而提高各物質(zhì)的離子化效率?？紤]到使用乙腈為有機(jī)相時(shí)的系統(tǒng)壓力比使用甲醇時(shí)小,本實(shí)驗(yàn)最終采用含1 mmol/L甲酸銨-0.01%甲酸的水溶液與乙腈為流動相。通過優(yōu)化梯度洗脫程序,10種目標(biāo)物在10 min內(nèi)即可完成快速分離。優(yōu)化條件下的提取離子流色譜圖見圖1。

圖1 10種精神活性物質(zhì)的多反應(yīng)監(jiān)測模式色譜圖

2.2.2 進(jìn)樣量的選擇

進(jìn)樣量在一定程度上會影響方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。當(dāng)進(jìn)樣量過多時(shí),易使樣品過載,超過線性范圍,影響物質(zhì)定量,嚴(yán)重時(shí)會造成色譜柱或檢測器污染;但進(jìn)樣量太少時(shí),又會使低含量的組分因檢測器靈敏度不夠而無法出峰。在優(yōu)化好的LC-MS/MS條件下,實(shí)驗(yàn)考察了不同進(jìn)樣量對低濃度樣品(1 ng/L)信噪比的影響。由表3可知,隨著進(jìn)樣量的增加,各物質(zhì)的信噪比逐漸增大。當(dāng)進(jìn)樣量增至20 μL時(shí),各物質(zhì)的信噪比均大于10,能滿足定量要求。綜合考慮進(jìn)樣量對樣品檢測結(jié)果的影響,選擇20 μL的進(jìn)樣量較為合適。

表3 進(jìn)樣量對靈敏度的影響

2.3 樣品pH的影響

有機(jī)物的存在形態(tài)受溶液pH影響較大,不同的pH可能會使本實(shí)驗(yàn)所考察的10種具有含氮堿性基團(tuán)的精神活性物質(zhì)發(fā)生不同程度的電離。當(dāng)溶液pH小于有機(jī)物pKa2個(gè)pH單位時(shí),堿性有機(jī)物主要以離子形態(tài)存在;當(dāng)溶液pH大于有機(jī)物pKa2個(gè)pH單位時(shí),堿性有機(jī)物主要以分子形態(tài)存在?？紤]到不同來源的環(huán)境水樣的pH變化范圍較大,因此,為了確保方法的準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性,本研究選擇在水樣中加入與流動相一致的甲酸-甲酸銨緩沖液,以維持樣品的酸堿度,從而進(jìn)行測定分析。

2.4 方法評價(jià)

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

由于污水的組成復(fù)雜,某些干擾成分可能會與分析物共流出,影響電噴霧效率,從而導(dǎo)致強(qiáng)烈的基質(zhì)效應(yīng),影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。選取某地區(qū)實(shí)際生活污水作為基質(zhì)效應(yīng)的供試水樣,加入一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,采用相對響應(yīng)值法評價(jià)基質(zhì)效應(yīng),即基質(zhì)效應(yīng)值=(目標(biāo)物在基質(zhì)中的響應(yīng)值/目標(biāo)物在純水中的響應(yīng)值)×100%?；|(zhì)效應(yīng)值大于1表示基質(zhì)對信號有增強(qiáng)作用,小于1則表明基質(zhì)對信號有抑制作用,越接近1表明基質(zhì)效應(yīng)越微弱[26]。由圖2可知,10種精神活性物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)值均處于40%～80%之間,即存在一定程度的抑制效應(yīng)。因此,為克服基質(zhì)效應(yīng),本實(shí)驗(yàn)采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

圖2 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果

2.4.2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

向純水中加入不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、固定體積的混合氘代內(nèi)標(biāo)工作溶液(20 μL)及甲酸銨與甲酸緩沖溶液(100 μL),得到濃度范圍為1～250 ng/L的系列混合工作溶液,用于定量分析。表4顯示,10種目標(biāo)物在1～250 ng/L線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均在0.992以上。分別以信噪比為3和10時(shí)對應(yīng)的濃度計(jì)算檢出限與定量限,各物質(zhì)的檢出限和定量限分別低于0.15 ng/L和0.5 ng/L,表明該方法的靈敏度較高。

2.4.3 準(zhǔn)確度及精密度

選取某地區(qū)實(shí)際生活污水(未檢出目標(biāo)物),分別加入不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和20 μL混合氘代內(nèi)標(biāo)工作溶液,在1、10、100 ng/L 3個(gè)濃度點(diǎn)平行測定3次,進(jìn)行加標(biāo)回收率測試和精密度試驗(yàn)。由表5可知,所有分析物的加標(biāo)回收率均在87.2%～114%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.53%～3.60%之間,表明本方法準(zhǔn)確、可靠,完全能夠滿足污水中嗎啡、甲基苯丙胺、苯丙胺等10種精神活性物質(zhì)的檢測要求。

表5 10種精神活性物質(zhì)在不同濃度點(diǎn)下的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.5 與常用SPE法的比較

分別考察了采用直接進(jìn)樣法和SPE法時(shí),污水中精神活性物質(zhì)的加標(biāo)回收率(10 ng/L)。HLB柱是親水親脂反相SPE柱,采用多聚相二乙烯苯結(jié)合極性物質(zhì)(如N-乙烯吡咯烷酮)為填料,對極性物質(zhì)有一定的保留效果。MCX柱是強(qiáng)陽離子交換SPE柱,采用水可浸潤性聚合物為吸附劑,對堿性化合物具有較高的選擇性和靈敏度。這兩種小柱是精神活性物質(zhì)前處理中最常采用的SPE柱。本實(shí)驗(yàn)將在線SPE法(美國Waters,Oasis HLB柱)、離線SPE法(美國Waters,Oasis MCX柱)和直接進(jìn)樣法3種前處理方法進(jìn)行了比較。其中,在線SPE法所需水樣量為10 mL,完成檢測所需總時(shí)長約為25 min,而離線SPE法所需水樣量為50 mL,完成檢測所需總時(shí)長約為80 min。

圖3比較了3種前處理方法的回收率數(shù)據(jù)。研究結(jié)果表明,直接進(jìn)樣法的回收率處于90.8%～114%之間,SPE法的回收率則處于80.9%～115%之間?？傮w來說,直接進(jìn)樣法的回收率略優(yōu)于SPE法。這不僅是因?yàn)槭艿搅薙PE柱自身吸附性質(zhì)的影響,而且由于直接進(jìn)樣法不需要對SPE柱進(jìn)行活化、上樣、洗脫等處理,前處理過程少,從而使目標(biāo)化合物的損失更少。相比于SPE法,直接進(jìn)樣法所需的樣品量、有機(jī)溶劑量和耗材量更少,更符合經(jīng)濟(jì)節(jié)約的要求,并且其前處理過程簡單,能將分析時(shí)長控制在10 min以內(nèi)。因此,該方法有望應(yīng)用于大批量水環(huán)境樣品中精神活性物質(zhì)的快速測定。

圖3 采用不同前處理方法的10種精神活性物質(zhì)回收率的比較

2.6 實(shí)際樣品分析

采用上述直接進(jìn)樣-LC-MS/MS方法,對從某地區(qū)隨機(jī)抽取的10份生活污水進(jìn)行10種精神活性物質(zhì)檢測分析。結(jié)果顯示,3份水樣中檢出了精神活性物質(zhì),其余水樣中均未檢出,具體檢測結(jié)果見表6。

表6 10種精神活性物質(zhì)的實(shí)際樣品分析結(jié)果

此外,在檢出精神活性物質(zhì)的3份水樣中,主要檢出物有嗎啡、甲基苯丙胺、氯胺酮,檢出的濃度范圍分別為3.41～9.55、0.90～1.63、1.06～1.78 ng/L。由表6可知,嗎啡的含量稍高,說明該地區(qū)嗎啡的使用量較大,嗎啡是該地區(qū)涉及的主要精神活性類藥物種類。這也符合我國的實(shí)際情況[27]。

3 結(jié)論

采用內(nèi)標(biāo)法定量,建立了直接進(jìn)樣檢測水體中10種精神活性物質(zhì)的LC-MS/MS方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本方法可在10 min內(nèi)完成一次樣品分析,實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為87.2%～114%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53%～3.60%,檢出限為0.05～0.14 ng/L,定量限為0.16～0.46 ng/L。本方法在前處理操作步驟和分析時(shí)長等方面具有顯著的優(yōu)勢,能滿足大批量實(shí)際污水樣品的快速檢測要求。開展污水中精神活性物質(zhì)的常態(tài)化監(jiān)測,不僅有利于完善環(huán)境監(jiān)測與生態(tài)安全評價(jià),而且能及時(shí)掌握區(qū)域內(nèi)的毒情變化趨勢,有效推動毒品案件的偵辦,為區(qū)域禁毒工作提供靶向性指引,更好地服務(wù)于禁毒實(shí)戰(zhàn)。