羅青華, 羅東還, 溫貴蘭, 徐 飛

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)

禽腺病毒(Fowladenovirusserotype,FAdV)是腺病毒科、禽腺病毒屬、呈球形的雙股線性DNA病毒,無(wú)囊膜,直徑60～90 nm[1],分為 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 群。Ⅰ 群禽腺病毒分為5個(gè)亞群(A、B、C、D、E)和12個(gè)血清型(1～8a、8b～12)[2],其中FAdV-4屬于C亞群、血清4型。FAdV 由252個(gè)殼粒蛋白組成,其中240個(gè)非頂角殼粒組成大部分的結(jié)構(gòu)蛋白表殼,又稱六鄰體(Hexon),其余為12個(gè)頂角殼粒稱五鄰體(Penton),并有2根纖突蛋白(Fiber)通過(guò)五鄰體伸出[3]。六鄰體是1種偽六邊形三聚體,位于20面體衣殼的20個(gè)面上,分為H1、H2、H3、H4共4種六鄰體。相關(guān)研究表明,Hexon基因高度保守,并攜帶主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇,因此該基因能準(zhǔn)確區(qū)分FAdV的血清型[4]。1987年禽腺病毒病首次在巴基斯坦安加拉哥特發(fā)生,因此也被稱為安卡拉病,隨后相繼在印度、科威特、韓國(guó)等國(guó)家暴發(fā)[5]。2007—2013年該病在我國(guó)以散發(fā)為主,2015年6月以來(lái),由FAdV-4引起以心包積液為特征,伴隨肝臟腫大的雞疫病流行于我國(guó)山東、河南等省份的部分地區(qū)[6]。2016年貴州省首次報(bào)道該病,隨后有多個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)報(bào)道出現(xiàn)疑似病例,多地呈現(xiàn)局部流行的趨勢(shì)[7,8]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)貴州分離的FAdV-4毒株(GZ-B1株)Hexon基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定,分析其與國(guó)內(nèi)外流行毒株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系,探究FAdV的遺傳變異情況,為該病的防控和疫苗制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株來(lái)源

FAdV-4 GZ-B1株,保存于貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

pMD19-T載體、大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞[購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司],2×TaqPCR Master Mix、膠回收試劑盒、DL 2 000 DNA Marker、病毒核酸提取試劑盒(購(gòu)自上海生工生物有限公司),培養(yǎng)基配制所需的胰蛋白胨、瓊脂粉等(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 主要儀器

PCR擴(kuò)增儀(型號(hào):T-20,杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào):TGL-M18,上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、電泳儀(型號(hào):DYY-8C),北京市六一儀器廠)、高壓蒸汽滅菌鍋(型號(hào):BXM-30R,上海圣科儀器設(shè)備有限公司)。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中FAdV-4基因序列(登錄號(hào):GU188428.1),使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)Hexon基因特異擴(kuò)增引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

1.5 Hexon基因PCR和克隆

按照病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取GZ-B1株核酸。以提取的病毒核酸為模板,使用合成引物進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL:2×TaqPCR Master Mix 10 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 6 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min, 58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min,4 ℃保存。用1.2%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,膠回收。回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)2 h,涂布接種于含有氨芐西林(50 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12 h,挑取單菌落增菌培養(yǎng)12 h,通過(guò)菌液PCR篩選出克隆成功的陽(yáng)性菌液。將鑒定為陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.6 Hexon基因遺傳進(jìn)化分析

將克隆獲得的基因序列拼接后進(jìn)行BLAST比對(duì),用DNAStar將分離毒株的Hexon基因序列分別與GenBank中13株不同亞群FAdV-4參考毒株進(jìn)行同源性比較,運(yùn)用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。參考毒株信息見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hexon基因PCR與克隆結(jié)果

GZ-B1株P(guān)CR擴(kuò)增在327 bp處出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶(見(jiàn)圖1),與預(yù)擴(kuò)增片段相符。PCR產(chǎn)物T-A克隆菌液PCR鑒定顯示克隆成功(見(jiàn)圖2)。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:GZ-B1株;-:陰性對(duì)照

M:DL 2 000 DNA Marker;1～3:克隆菌液;-:陰性對(duì)照

2.2 Hexon基因的遺傳進(jìn)化情況

由圖3可見(jiàn):GZ-B1株與FAdV基因型C、血清4型的7株參考毒株同源性較高(95.8%～98.5%),其中與國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒株GDMZ、LC1611、SDSG、SDXL相似度最高,均達(dá)到98.5%。GZ-B1株與基因型A、B、D、E的6株參考毒株同源性較低(73.3%～77.5%)。由圖4可見(jiàn):GZ-B1株與國(guó)內(nèi)外基因型C毒株處于同一進(jìn)化分支,且與血清4型親緣關(guān)系最近,與A、B、D、E基因型處于不同進(jìn)化分支。GZ-B1株與國(guó)內(nèi)強(qiáng)度株FAdV-C LC1611的遺傳親緣關(guān)系最近,表明GZ-B1株屬于C基因型、血清4型禽腺病毒。

圖3 GZ-B1株與參考毒株的核苷酸序列同源性

圖4 GZ-B1株遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,FAdV-4 GZ-B1分離株屬于C基因型、血清4型,與國(guó)內(nèi)流行的強(qiáng)毒株FAdV-C LC1611親緣關(guān)系最近,同源性最高。

4 討論

4.1FAdV-4Hexon基因編碼937個(gè)氨基酸,其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度2 811 bp,包含種和屬的抗原決定簇,推測(cè)可能與致病性有關(guān)[9]。近年來(lái),FAdV-4在國(guó)內(nèi)的流行范圍持續(xù)擴(kuò)大,導(dǎo)致養(yǎng)殖肉雞和種雞批量死亡、種蛋質(zhì)量下降,造成重大經(jīng)濟(jì)損失。相關(guān)研究表明,FAdV-4滅活疫苗可對(duì)FAdV的多種血清型提供交叉免疫防護(hù)[10]。深入研究FAdV-4的致病機(jī)制和免疫方法對(duì)有效防控 FAdV-4感染具有重要意義。

4.2不同地區(qū)FAdV分離毒株有不同程度變異和致病性上的差異。本研究對(duì)貴州分離的FAdV-4 GZ-B1毒株進(jìn)行Hexon基因克隆及測(cè)序,發(fā)現(xiàn)其與國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒株LC1611同源性最高,親緣關(guān)系最近,推測(cè)二者可能來(lái)源一致,可為追蹤該分離株的傳播來(lái)源提供依據(jù)。此外,GZ-B1株與國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒株GDMZ、SDSG、SDXL處于同一進(jìn)化分支,同源性高;而國(guó)外弱毒株KR5、ON1也在同一進(jìn)化分支,同源性稍低,且報(bào)道時(shí)間在中國(guó)之前。推測(cè)GZ-B1株是從國(guó)外傳入后毒力增強(qiáng),并從疫區(qū)省份傳播至貴州。進(jìn)一步了解該分離毒株的遺傳進(jìn)化情況,可為FAdV-4的流行病學(xué)調(diào)查及防控提供參考。