周偉杰, 梁紹波, 龍琴琴, 龐 峰

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系,貴州 貴陽 550025)

羊傳染性膿皰是由羊口瘡病毒(Orfvirus,ORFV)引起的人獸共患傳染病,俗稱羊口瘡[1]。ORFV主要侵害對象為山羊、綿羊等小反芻動物,感染后可造成動物口、唇、舌、鼻、乳房等部位皮膚及黏膜組織增生、潰瘍、化膿、結(jié)痂,并能反復(fù)感染,給畜牧業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失[2,3]。ORFV是痘病毒科、副痘病毒屬的重要成員,為線性雙鏈DNA病毒,基因組長度130～139 kb,由高度保守的中央編碼區(qū)ORF009～ORF111(負(fù)責(zé)調(diào)控病毒的復(fù)制、形態(tài)和結(jié)構(gòu))和兩端重復(fù)序列ORF001～ORF008、ORF112～ORF134(參與免疫調(diào)節(jié)、免疫逃逸和病毒毒力調(diào)控)構(gòu)成,編碼132種蛋白質(zhì)[4,5]。ORFV的114基因位于基因組末端,為ORFV早期基因,ORFV114蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)[6],但其功能未知。目前,疫苗免疫仍是防控羊口瘡的主要手段。滅活疫苗更傾向于誘導(dǎo)體液免疫,誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力相對較差;而弱毒苗可能存在毒力返強(qiáng)等安全問題[7]。抗原表位又稱抗原決定簇,是免疫細(xì)胞識別的靶結(jié)構(gòu),是激發(fā)特異免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。多表位疫苗包含了病原體的多個優(yōu)勢B、T細(xì)胞抗原表位,可克服單一抗原免疫原性較差、免疫保護(hù)有限等缺點(diǎn),可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答[8]。本研究使用多個免疫信息學(xué)在線軟件預(yù)測、篩選ORFV114蛋白的優(yōu)勢B、T細(xì)胞抗原表位,探究其作為ORFV表位疫苗靶標(biāo)的可能性,為ORFV多表位疫苗的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 ORFV114蛋白的氨基酸序列

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載ORFV-JS株114蛋白(Genbank 登錄號:WME00811.1)的氨基酸序列,包含346個氨基酸:MPLFRKLMVSRSLVKECLTLDFRQGERLPTRCFLPVPAGTTFHRVCDTSPLTNEVSRHVQEPVMGTGRVQYYYFESGQGMIGDNAGMPRMLVCTRSAYNGGDVVVRSTRSRADKTVVAPCQGMVLLLSPFCAFDITPVESGSAIFAEVIVTAPSMDHVEAVTGTGEAAVRIFNSHHPLWPRHGSNVCFALRLLRDVRTGERVVEQMFMDGRWHTVLRTSCGNKVCVPADLVGQTNLEEVPFCDVTPEIMRRALAIDPPYEAVAHPHRCVYGAMDVRCANEYLVYCTFKTEPARRSTSSPGPDGPLSPATPSTSRAAAARAPTTPQEVTSPTTRLVETCLRDALDGP

1.2 ORFV114蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

利用在線軟件ABCpred[9](https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/)預(yù)測ORFV114蛋白的B細(xì)胞抗原表位,表位長度設(shè)置為16 aa,得分閾值設(shè)為≥0.88,得分越高表示成為優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位的可能性越大。

1.3 ORFV114蛋白的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)抗原表位預(yù)測

利用在線軟件IEDB的MHC-Ⅰbinding server[10](http://tools.iedb.org/mhci/)預(yù)測ORFV114蛋白的CTL表位,預(yù)測方法選擇IEDB recommended 2020.09(NetMHCpan EL4.1),等位基因選擇HLA-A*01:01,表位長度選擇9 aa,得分閾值設(shè)為>0.50,百分位排名閾值設(shè)為前5.0%。得分越高且百分位排名越小表示成為優(yōu)勢CTL表位的可能性越大。

1.4 ORFV114蛋白的輔助性T細(xì)胞(HTL)抗原表位預(yù)測

利用在線軟件IEDB的MHC-Ⅱbinding server[10](http://tools.iedb.org/mhcii/)預(yù)測ORFV114蛋白的HTL表位,預(yù)測方法選擇IEDB recommended 2023.05(NetMHCⅡpan EL4.1),等位基因選擇HLA-DRB1*01:01,表位長度選擇15 aa,得分閾值設(shè)為>0.50,百分位排名閾值設(shè)為前5.0%。得分越高且百分位排名越小表示成為優(yōu)勢HTL表位的可能性越大。

1.5 ORFV多表位疫苗的構(gòu)建

參考文獻(xiàn)中的方法分別使用KK、AAY和GPGPG柔性短肽接頭連接ORFV114蛋白的優(yōu)勢B細(xì)胞、CTL和HTL抗原表位,構(gòu)建ORFV多表位疫苗[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORFV114蛋白的優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位

由表1可見: ORFV114蛋白包含12個優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位,分別位于292～307 aa、264～279 aa、146～161 aa、331～346 aa、113～128 aa、298～313 aa、35～50 aa、324～339 aa、281～296 aa、162～177 aa、315～330 aa、204～219 aa。

2.2 ORFV114蛋白的優(yōu)勢CTL抗原表位

由表2可見:ORFV114蛋白含有1個優(yōu)勢CTL抗原表位,位于65～73 aa。

2.3 ORFV114蛋白的優(yōu)勢HTL抗原表位

由表3可見:ORFV114蛋白含有5個優(yōu)勢HTL抗原表位,分別位于69～83 aa、68～82 aa、70～84 aa、48～62 aa、284～298 aa。

2.4 ORFV多表位疫苗的構(gòu)建

使用KK、AAY和GPGPG柔性短肽接頭連接ORFV114蛋白的12個優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位、1個優(yōu)勢CTL抗原表位、5個優(yōu)勢HTL抗原表位,構(gòu)建了ORFV多表位疫苗(見圖1)。

圖1 ORFV多表位疫苗的構(gòu)建

注:綠色、紅色、藍(lán)色序列分別為ORFV114蛋白的優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位、CTL抗原表位、HTL抗原表位;KK、AAY、GPGPG為柔性短肽接頭。

3 結(jié)論

ORFV114蛋白包含多個優(yōu)勢B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位,本試驗(yàn)構(gòu)建了由ORFV114蛋白的12個B細(xì)胞抗原表位、1個CTL抗原表位和5個HTL抗原表位組成的ORFV多表位疫苗,具有誘導(dǎo)強(qiáng)烈體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)的可能性。

4 討論

多表位疫苗被稱為“精確制導(dǎo)”疫苗,是疫苗研究的新方向。近年來,科學(xué)家利用免疫信息學(xué)工具成功設(shè)計(jì)和構(gòu)建了針對新型冠狀病毒[12]、猴痘病毒[13]、牛病毒性腹瀉病毒[14]等多個病毒的多表位疫苗,但目前尚未有ORFV多表位疫苗的報(bào)道。本研究通過多個免疫信息學(xué)在線軟件預(yù)測,篩選出ORFV114蛋白的優(yōu)勢B、T細(xì)胞抗原表位,發(fā)現(xiàn)ORFV114蛋白包含12個優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位、1個優(yōu)勢CTL抗原表位和5個優(yōu)勢HTL抗原表位,可作為ORFV表位疫苗的潛在靶標(biāo)。由于免疫信息學(xué)軟件預(yù)測的準(zhǔn)確性并不完美,后續(xù)將對構(gòu)建的ORFV多表位疫苗進(jìn)行理化性質(zhì)、二級與三級結(jié)構(gòu)建模、免疫受體結(jié)合能力預(yù)測、免疫效果模擬等分析,并通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證疫苗的免疫保護(hù)效果及安全性。此外,具體哪些抗原表位能夠有效激發(fā)宿主特異免疫應(yīng)答也需要進(jìn)一步研究。