代 丹, 姬格金, 鄭維豪, 張煜杭, 羅 芬, 陸 建, 鮮思美,2*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025;2. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025)

羊口瘡病毒(ORFV)能引起羊的口、唇、舌、鼻、乳房等部位皮膚和黏膜形成丘疹、膿皰、潰瘍、疣狀厚痂,是1種接觸性、嗜上皮性、人獸共患傳染病,在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生,嚴(yán)重威脅養(yǎng)羊業(yè)[1,2]。F1L蛋白是ORFV的囊膜蛋白,是病毒表面微管的組分之一,在病毒入侵宿主的過程中起關(guān)鍵作用[3]。宿主細(xì)胞蛋白半乳糖凝集素1(LGALS1)與F1L蛋白互作可能是ORFV感染的重要原因。本試驗(yàn)通過制備兔抗LGALS1多克隆抗體,為研究LGALS1蛋白在ORFV的感染和增殖中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 LGALS1蛋白和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

LGALS1蛋白由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。健康新西蘭大白兔2只(雄性、6月齡、體重3.5 kg)及飼料均購于貴州鵬程農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)快速配制試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、特超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、抗熒光淬滅封片液(含DAPI),均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;彩虹180廣譜蛋白預(yù)染Marker(11～180 kDa)、0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF),均購自Solarbio公司;電泳儀(型號(hào):EPS300)、凝膠成像儀(型號(hào):Tanon-1600),購自Tanon公司;倒置熒光顯微鏡(型號(hào):BDS400),購自CNOPTEC公司。

1.3 兔抗LGALS1蛋白多克隆抗體的制備

按LGALS1蛋白0.8 mg/只劑量與佐劑以1∶1體積比乳化,背部皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔,共免疫3次,每次間隔14 d。第1次免疫采用弗氏完全佐劑,第2、3次免疫采用弗氏不完全佐劑。第3次免疫后第7 d心臟采血,分離血清,-80 ℃凍存。

1.4 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

以LGALS1蛋白(10 μg/mL)每孔100 μL包被ELISA板,4 ℃過夜,磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次,5%脫脂奶粉每孔200 μL,37 ℃封閉2 h,PBST洗滌3次,分離血清倍比稀釋(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800、1∶409 600)加入酶標(biāo)板,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h,PBST洗滌3次,二抗HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ig G 1∶4 000倍稀釋,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h,PBST洗滌3次,再加入顯色液每孔100 μL,37 ℃避光顯色15 min,加入終止液50 μL終止顯色,酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm值。

1.5 多克隆抗體的Western blot分析

10%SDS-PAGE電泳,LGALS1蛋白轉(zhuǎn)印PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h。以分離血清(1∶500稀釋)為一抗孵育PVDF膜,4 ℃過夜,Tris-HCl吐溫緩沖鹽溶液(TBST)洗滌3次,15 min/次,以HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)為二抗,室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,15 min/次,加ECL顯色液100 μL顯色。

1.6 多克隆抗體的驗(yàn)證

將羔羊睪丸細(xì)胞(LT)接種至12孔細(xì)胞板,待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%后棄掉原培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(PBS)潤(rùn)洗,4%多聚甲醛4 ℃固定30 min;0.5%Triton X-100穿孔10 min,5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min。以1∶200稀釋比的分離血清為一抗,4 ℃孵育30 min;以FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)為二抗(1∶200稀釋),37 ℃避光孵育1 h,DAPI孵育15 min(細(xì)胞核染色)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(PBS為一抗)。熒光顯微鏡分析LGALS1蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 多克隆抗體的效價(jià)

以純化LGALS1蛋白為抗原,利用間接ELISA法測(cè)定LGALS1蛋白多克隆抗體的效價(jià),當(dāng)陽性對(duì)照孔(P)與陰性對(duì)照孔(N)的D450 nm比值≥2.1時(shí),其血清的最高稀釋度為多克隆抗體的最高效價(jià)。由表1可見:稀釋比為1∶102 400時(shí),P/N值為3.778(>2.1);稀釋比為1∶204 800時(shí),P/N值為2.0(<2.1)。因此多克隆抗體的效價(jià)為1∶102 400。

2.2 多克隆抗體Western blot分析

由圖1可見:35 ku LGALS1蛋白處有特異的單一條帶,LGALS1蛋白多克隆抗體能特異性識(shí)別LGALS1蛋白。

1:蛋白Marker;2:B2L蛋白;3～5:LGALS1蛋白

2.3 多克隆抗體的驗(yàn)證

由圖2可見:間接免疫熒光分析表明,LT細(xì)胞質(zhì)中有特異綠色熒光,兔抗LGALS1多克隆抗體可有效識(shí)別LT細(xì)胞中的LGALS1蛋白。

FITC:綠色熒光LGALS1蛋白;DAPI:藍(lán)色熒光細(xì)胞核;Merge:DAPI和FITC的疊加組合

3 結(jié)論

本試驗(yàn)成功制備了兔抗LGALS1蛋白多克隆抗體,抗體特異性好,效價(jià)高。

4 討論

4.1免疫佐劑是抗體制備成功與否的重要因素,適當(dāng)?shù)拿庖咦魟┒靖弊饔幂^低,免疫效果好,可提升抗體的親和力和特異性。弗氏佐劑是目前最常用的免疫佐劑,包括含結(jié)核分枝桿菌的弗氏完全佐劑、不含結(jié)核分枝桿菌的弗氏不完全佐劑。弗氏不完全佐劑主要成分為油劑和乳化劑,與抗原完全混合后形成油包水乳液,緩慢釋放抗原,可刺激機(jī)體穩(wěn)定、長(zhǎng)期產(chǎn)生抗體。弗氏完全佐劑添加了滅活的結(jié)核分枝桿菌,免疫反應(yīng)更強(qiáng),但可導(dǎo)致注射部位局部肉芽腫、炎癥等不良反應(yīng),僅適用于初次免疫。2種佐劑的聯(lián)合使用可避免弗氏完全佐劑的副作用,同時(shí)又能產(chǎn)生高效價(jià)抗體。

4.2免疫原、佐劑乳化程度、免疫方式對(duì)抗體的產(chǎn)生及效價(jià)也有很大影響。本試驗(yàn)采取常用的注射器乳化法,該方法通過注射器來回抽吸使抗原充分乳化,形成油包水狀態(tài)。注射器乳化雖然耗時(shí)費(fèi)力,但易于實(shí)現(xiàn)無菌操作,且抗原損失較少,適合少量抗原的處理。此外,本試驗(yàn)采用皮下多點(diǎn)注射的免疫方法,可在動(dòng)物多個(gè)身體部位長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)刺激,獲得較高的抗體效價(jià)。