李佳慧,張煥琪,施 佐,馬 巍,王春強(qiáng)

(錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧 錦州 121001)

熱應(yīng)激是指動(dòng)物在高溫環(huán)境下無法通過自身的調(diào)節(jié)機(jī)制維持正常的體溫,導(dǎo)致生理和行為上的改變[1]。熱應(yīng)激持續(xù)時(shí)間過長或溫度過高時(shí),可以引起動(dòng)物一系列生理和行為上的反應(yīng),如呼吸急促、翅膀張開、身體抽搐、昏昏欲睡、昏迷等現(xiàn)象,對(duì)動(dòng)物造成嚴(yán)重影響[2]。熱應(yīng)激可導(dǎo)致雄性動(dòng)物精液質(zhì)量、抗氧化指標(biāo)下降;誘導(dǎo)大骨雞機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激,對(duì)大骨雞繁殖性能造成嚴(yán)重影響。這些影響可能是由于熱應(yīng)激導(dǎo)致激素分泌變化而引起的[3]。為了緩解熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物繁殖性能造成影響,可以在飼料中添加一些抗應(yīng)激添加劑。

目前N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamate, NCG)已經(jīng)成為動(dòng)物日糧的常規(guī)添加劑。NCG為白色結(jié)晶粉末或無色透明晶體,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,是精氨酸的一種有效前體[4]。NCG是N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的功能類似物,成本低廉,在瘤胃中添加量較小。在妊娠母豬日糧中添加 NCG,能夠顯著降低胚胎死亡率,改善產(chǎn)仔性能,顯著增加窩產(chǎn)活仔數(shù)及窩重[5]。在大骨雞飼糧中添加NCG,可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體代謝增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力,減少因熱應(yīng)激引起的繁殖功能減退等[6]。因此,夏季高溫季節(jié)在大骨雞飼糧中添加NCG可以有效地緩解熱應(yīng)激造成的不良影響,促進(jìn)大骨雞生長速度和繁殖性能的提高,提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[7]。試驗(yàn)旨在研究熱應(yīng)激條件下日糧中添加不同濃度NCG對(duì)大骨雞精液品質(zhì)的影響,為進(jìn)一步提高大骨雞精液品質(zhì)及繁殖性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組情況

體重相近的25周齡雄性大骨雞48只,錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;NCG,江西省元昌工業(yè)有限公司提供。

將48只大骨雞機(jī)分成4組,每組12只,對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧,N1、N2、N3組分別在基礎(chǔ)日糧中添加NCG 0.08%、0.12%、0.16%。

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)模式采用單層籠養(yǎng),試驗(yàn)期間于每日08:00、12:00和18:00各喂一次,自由飲水,執(zhí)行常規(guī)免疫程序和飼養(yǎng)管理。試驗(yàn)共計(jì)90 d,其中適應(yīng)期30 d,飼喂基礎(chǔ)日糧,正試期60 d,進(jìn)行熱應(yīng)激處理。每周采集精液對(duì)大骨雞精液品質(zhì)進(jìn)行檢測。舍內(nèi)每天光照12 h。日常舍內(nèi)溫度30 ℃持續(xù)4～6 h,中午溫度可達(dá)35 ℃。為了避免溫度過高對(duì)大骨雞產(chǎn)生的危害,應(yīng)及時(shí)監(jiān)測舍內(nèi)溫度,保持4～6 h高溫后進(jìn)行降溫。

1.3 精液的采集

采用腹背式按摩法采集精液,將精液置于37 ℃恒溫箱進(jìn)行保溫,先取10 μL原精用顯微鏡初步觀察原精的活力與密度,進(jìn)行精液品質(zhì)評(píng)估,活力低于80%的精液棄用,將活力高于80%的精液按照1∶3比例加入稀釋液,再進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 精子活率

取潔凈試管,滴加1滴新鮮采集的精液和1～2滴伊紅染色液,混勻,靜置30 s后滴加3滴苯胺黑染色液,混勻放置30～60 s。在載玻片上滴加1滴染色后精液,于顯微鏡下計(jì)數(shù)。在1 000倍鏡下數(shù)200個(gè)精子,分別數(shù)出死精子和活精子,并計(jì)算各自的百分率?；罹拥念^部不易被染色,顯微鏡下觀察時(shí),精子的頭部呈透明且無色;而死亡精子則因伊紅染色液滲透到了細(xì)胞質(zhì),精子頭部被染為紅色,苯胺黑將背景染為黑色,使精子頭部清晰可見。

1.4.2 質(zhì)膜完整性

低滲腫脹試驗(yàn)(HOST)是一種評(píng)估精子質(zhì)膜完整性的試驗(yàn)方法,當(dāng)精子在低滲溶液中時(shí)水分子可以通過精子膜進(jìn)入精子,使精子體積增大而膨脹。因此,通過觀察精子的低滲膨脹情況可以評(píng)估精子膜的完整性。

質(zhì)膜完整率(%)=卷尾精子數(shù)/總精子數(shù)×100。

1.4.3 精子形態(tài)學(xué)

采用G250染色法染色,觀察精子形態(tài)是否為正常。

畸形率(%)= 畸形精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)×100。

1.4.4 精子運(yùn)動(dòng)性能

使用邁朗動(dòng)物精子全自動(dòng)分析儀檢測精子活力、鞭打頻率、直線速率、路徑速率、曲線速率、側(cè)擺幅值、移動(dòng)角度、前向性。

1.4.5 抗氧化指標(biāo)

將解凍后的精子按比例稀釋至檢測樣品濃度,按試劑盒說明測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析,平均數(shù)比較采用方差分析檢驗(yàn),結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 精子活率檢測與分析

大骨雞適應(yīng)期飼養(yǎng)30 d后,每周進(jìn)行精液品質(zhì)檢測,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)取各周測定的平均值進(jìn)行分析。精子活率測定結(jié)果見表1,伊紅-苯胺黑染色圖見圖1。由表1可以看出:與對(duì)照組相比,添加NCG的3個(gè)試驗(yàn)組精子活率均提高,其中N2、N3組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),N1組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

注:箭頭所示紅色精子為死亡精子,白色精子為活精子。

表1 精子活率測定結(jié)果

2.2 熱應(yīng)激對(duì)精子質(zhì)膜完整性和畸形率的影響

精子質(zhì)膜完整性和畸形率結(jié)果見表2。由表2可以看出:與對(duì)照組相比,N1、N2、N3組精子質(zhì)膜完整性均有提高,其中N3組顯著高于對(duì)照組(P<0.05),N1、N2組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05);N1、N2、N3組精子畸形率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 精子質(zhì)膜完整性、畸形率測定結(jié)果

2.3 添加不同濃度NCG在熱應(yīng)激下對(duì)精子運(yùn)動(dòng)性能的影響

采用邁郎精子分析系統(tǒng)分析了熱應(yīng)激條件下大骨雞精子的活力、活率和運(yùn)動(dòng)性能,結(jié)果見表3。 精子運(yùn)動(dòng)軌跡見圖2。由表3可以看出:與對(duì)照組相比,N1、N2、N3組精子活力均有提高,其中N2、N3組顯著高于對(duì)照組(P<0.05);N1、N2、N3組鞭打頻率、直線速率、路徑速率均有提高,但與對(duì)照組相比均差異不顯著(P>0.05);N1、N2、N3組精子曲線速率均有提高,其中N3組顯著高于對(duì)照組(P<0.05); N1、N2、N3組側(cè)擺幅值與對(duì)照組均差異不顯著(P>0.05);N2、N3組移動(dòng)角度顯著高于對(duì)照組(P<0.05); N3組前向性顯著高于N1組(P<0.05)。說明大骨雞精液中添加NCG能夠顯著提高精子的運(yùn)動(dòng)性能,減緩高溫下熱應(yīng)激對(duì)大骨雞精液品質(zhì)造成的危害。

注:A圖上面箭頭處為活精子運(yùn)動(dòng)路徑,為綠色;下面箭頭處為死亡精子,為紅色。

表3 精子運(yùn)動(dòng)性能測定結(jié)果

2.4 熱應(yīng)激對(duì)精液抗氧化指標(biāo)的影響

熱應(yīng)激對(duì)精液抗氧化指標(biāo)的影響見表4。由表4可以看出:N1、N2、N3組MDA含量均低于對(duì)照組(P>0.05),其中N3組最低; N3組SOD活性最高,顯著高于N1組,但與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05);N1、N2、N3組CAT活性均高于對(duì)照組,但均與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。

表4 精液抗氧化指標(biāo)測定結(jié)果

3 討 論

在高溫?zé)釕?yīng)激條件下大骨雞的精液品質(zhì)受到極大損害,嚴(yán)重影響其繁殖性能的發(fā)揮。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼糧中添加不同濃度NCG,使高溫應(yīng)激狀態(tài)下大骨雞的精子活率、運(yùn)動(dòng)性能、質(zhì)膜完整性、畸形率均有所改善。有研究顯示,在飼糧中添加NCG能夠促進(jìn)內(nèi)源精氨酸合成,生成NO和多胺,NO 催化鳥苷酸(GMP)的產(chǎn)生[8],導(dǎo)致血管內(nèi)皮肌肉放松、血流量增大。多胺是一種促進(jìn)細(xì)胞生長和分裂的物質(zhì),有助于促進(jìn)動(dòng)物的生長和發(fā)育[9],還可以增加蛋白質(zhì)的合成,提高動(dòng)物的營養(yǎng)吸收能力,這些物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用[5]。因此,日糧中添加NCG可以改善動(dòng)物的生長性能和繁殖性能,提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益;NCG參與性行為的調(diào)控、睪丸微循環(huán)的調(diào)節(jié)、睪酮的分泌,這些對(duì)大骨雞精子的產(chǎn)生及活力都具有重要的調(diào)控作用。

本試驗(yàn)通過檢測大骨雞精子活率、運(yùn)動(dòng)性能、質(zhì)膜完整性、畸形率,判斷精液品質(zhì)的優(yōu)劣程度。精子向前運(yùn)動(dòng)的能力一般分a、b、c、d四級(jí),a級(jí)為精子快速前向運(yùn)動(dòng),b級(jí)是指慢或呆滯地前向運(yùn)動(dòng),c級(jí)為非前向運(yùn)動(dòng),d級(jí)是不動(dòng)的精子,本試驗(yàn)主要參考a級(jí)、b級(jí)精子的運(yùn)動(dòng)軌跡。熱應(yīng)激下添加不同濃度NCG使大骨雞精液品質(zhì)均有提升,其中添加0.16% NCG的N3組的a級(jí)精子運(yùn)動(dòng)性能提高最為顯著;對(duì)照組b級(jí)精子較多。添加NCG的3個(gè)試驗(yàn)組精子活率較對(duì)照組精子顯著升高,畸形率下降,質(zhì)膜完整性升高。精子質(zhì)膜是精子最易損傷的部位,精子質(zhì)膜損傷、精子膜滲透性增加會(huì)使細(xì)胞內(nèi)離子(如鈣離子)泄漏和抗氧化酶等酶活性降低[10],發(fā)生嚴(yán)重代謝紊亂,影響精子的運(yùn)動(dòng)和活力。精子的質(zhì)膜完整性能直接反映精子損傷的程度。在本試驗(yàn)中,添加NCG的3個(gè)試驗(yàn)組精子頭膜與尾膜的完整性都有所提高。頭膜與尾膜結(jié)構(gòu)都完整的精子活力和受精能力最強(qiáng)。綜上所述,添加NCG的3個(gè)試驗(yàn)組精子活率、運(yùn)動(dòng)性能、質(zhì)膜完整性都有提高。

精液及精子的抗氧化相關(guān)酶類參與雞的熱應(yīng)激反應(yīng)[11]。飼糧中添加NCG能有效提高精子過氧化氫酶活性,也可減緩脂質(zhì)過氧化的程度。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)被氧化時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的MDA,這進(jìn)一步加劇了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激程度。脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生大量的MDA,引發(fā)精子的過氧化反應(yīng),飼糧添加NCG可以降低精液中MDA含量,減少過氧化應(yīng)激對(duì)精子造成的損害[12]。SOD在精子中起著重要的抗氧化作用。它可以清除超氧陰離子并將超氧化物轉(zhuǎn)化為氧和過氧化氫[13],從而調(diào)控多種活性氧(ROS)水平。這有助于保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激的傷害[14],維持其正常的形態(tài)和功能。在精漿中,SOD可以防止精子樣本中的磷脂和與磷脂結(jié)合的脂肪酸過氧化[15],這是精子發(fā)育和成熟過程中的重要保護(hù)機(jī)制[16]。此外,SOD還可以減少氧化核酸損傷,這對(duì)于維持基因組的穩(wěn)定性非常重要,缺乏SOD等抗氧化酶可能會(huì)導(dǎo)致DNA損傷的修復(fù)機(jī)制受損[17]。CAT在精子中催化過氧化氫分解成水和氧氣的反應(yīng)、維持較高過氧化氫酶活性,可以使精子免受氧化應(yīng)激損害。過氧化氫是一種強(qiáng)氧化劑,可以對(duì)精子造成氧化損傷,影響精子的運(yùn)動(dòng)能力、形態(tài)和遺傳物質(zhì)的完整性。CAT通過分解過氧化氫維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),不僅可以反映細(xì)胞的抗氧化水平,還可以與其他抗氧化酶協(xié)同作用,共同抵御氧化應(yīng)激對(duì)精子的損傷,維持精子的正常功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在飼糧中添加不同濃度NCG對(duì)熱應(yīng)激下精子抗氧化指標(biāo)均有不同程度的緩解作用。

在高溫天氣應(yīng)采取適當(dāng)措施緩解熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物繁殖功能的影響[16],飼糧中添加不同濃度的NCG可有效緩解精子氧化反應(yīng),提高精子活率、質(zhì)膜完整性、運(yùn)動(dòng)性能,從而緩解熱應(yīng)激對(duì)大骨雞精液品質(zhì)造成的危害。

4 結(jié) 論

大骨雞飼糧中添加不同水平NCG后,均可緩解由于熱應(yīng)激導(dǎo)致的精液品質(zhì)及繁殖性能下降,其中0.16% NCG對(duì)緩解動(dòng)物熱應(yīng)激效果最佳。