章銅,沈央紅,張雯,朱軍莉*,陸海霞*,劉興泉

1(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州,310018) 2(浙江農(nóng)林大學(xué) 食品與健康學(xué)院,浙江 杭州,311300)

嘔吐毒素(deoxynivalenol,DON),即脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物,人和動(dòng)物誤食被該毒素污染的糧谷類后會(huì)產(chǎn)生各種急慢性中毒反應(yīng)[1]。近年來發(fā)現(xiàn)嘔吐毒素可能與人類食管癌和腎病有關(guān),已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為第三類致癌物[2],引起了各國的普遍重視,世界上超過37個(gè)國家和組織制定了谷物中DON的限量標(biāo)準(zhǔn),我國GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌霉素限量》規(guī)定谷物及其制品(玉米、小麥、小麥制品)中嘔吐毒素含量不超過1 000 μg/kg[3]。盡管已有高靈敏度檢測DON的方法,如高效液相色譜法[4]和氣相色譜法[5],但是這些方法存在儀器昂貴、操作繁瑣、耗時(shí)長且要求專業(yè)人員操作等限制,因此開發(fā)一種高靈敏度、低成本的DON快速、現(xiàn)場檢測方法具有重大意義。

側(cè)向流免疫檢測法(lateral flow immunoassay,LFIA)又稱免疫層析檢測法(immunochromatographic assay,ICA)[6],具有成本低、檢測快、分析過程簡便等獨(dú)特優(yōu)勢,已作為一種有效的現(xiàn)場分析方法廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域。LFIA的靈敏度受到多方面的影響,其中抗體標(biāo)記量以及信號(hào)標(biāo)簽的影響最為顯著[7-10]。因此,抗體標(biāo)記量優(yōu)化后提高檢測性能最有效的方法是尋找理想的標(biāo)記材料,不僅可以用較少數(shù)量的標(biāo)記抗體顯示出強(qiáng)信號(hào),同時(shí)也不需要復(fù)雜的合成過程。

普魯士藍(lán)納米粒子(Prussian blue nanoparticles,PBNPs),通式為Fe4[Fe(CN)6]3nH2O,由于其尺寸可控、環(huán)境友好、成本低和易于合成等特性而日益受到關(guān)注[11-12]。其具有優(yōu)異的物理化學(xué)功能,用于電化學(xué)免疫傳感器[13]和催化比色檢測[14]等食品分析方法中。并且,PBNPs具有獨(dú)特的立方體結(jié)構(gòu),尺寸從幾納米到幾百納米不等,由于大尺寸PBNPs的參與,即使只有少數(shù)抗體分子被標(biāo)記在每個(gè)PBNP上,在LFIA中也會(huì)看到明顯的色帶,成為硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC)上的明亮信號(hào)標(biāo)記物。ZHAO等[15]將PBNPs作為信號(hào)標(biāo)簽應(yīng)用于免疫層析試紙條中檢測鹽酸克倫特羅,發(fā)現(xiàn)比膠體金所需要的抗體標(biāo)記量更少,靈敏度更高。LU等[16]在磁性納米顆粒上原位生成PBNPs結(jié)合納米酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測黃曲霉毒素B1,實(shí)現(xiàn)超靈敏熒光檢測,比光熱分析和比色分析的靈敏度分別提高6 333倍和28倍。聚多巴胺(polydopamine,PDA)是一種新興的仿生黏附聚合物,具有制備工藝簡單、生物相容性好、黏附性強(qiáng)、易功能化等特性而受到廣泛關(guān)注。利用PDA結(jié)構(gòu)中的類兒茶酚胺基團(tuán),PDA可以很容易地通過靜電相互作用或共價(jià)鍵附著在納米粒子表面,常被用于表面修飾。YE等[17]和XU等[18]用PDA包裹AuNPs形成AuNP@PDA,均提高了對(duì)檢測物的靈敏度。

目前谷物和飼料中嘔吐毒素等真菌毒素污染仍較嚴(yán)重,有效控制DON危害的前提是能快速、準(zhǔn)確地檢測該毒素。鑒于此,本研究通過合成PBNPs和聚多巴胺包裹普魯士藍(lán)納米粒子(polydopamine coated Prussian blue nanoparticles,PB@PDA),并以其作為信號(hào)標(biāo)簽建立了一種信號(hào)放大的免疫層析模型,優(yōu)化和比較2種標(biāo)記物的檢測結(jié)果,評(píng)價(jià)了PBNPs和PB@PDA標(biāo)記的LFIA對(duì)小麥樣品中嘔吐毒素的快速檢測性能。

1 材料與方法

1.1 試劑

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP K30,優(yōu)級(jí)純)、鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6,純度99.0%]、鹽酸多巴胺(dopamine hydrochloride,純度98.0%),上海麥克林生化有限公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,優(yōu)級(jí)純)、吐溫20(Tween-20,純度99.0%),上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DON-BSA抗原、DON單克隆抗體(DON-mAb)、羊抗鼠IgG,北京厚生正德科技有限公司;黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)、黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)、DON、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、赭曲霉毒素(ochratoxinA,OTA)、T-2標(biāo)準(zhǔn)品,青島普瑞邦生物工程有限公司;嘔吐毒素膠體金試紙條,深圳芬德生物技術(shù)有限公司。本實(shí)驗(yàn)所用試劑未經(jīng)說明者均為優(yōu)級(jí)純,所用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-15B高速冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器公司;Mastersizer 3000激光粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司;KQ3200超聲波清洗機(jī),昆山市超聲儀器有限公司;RO-MB-T臺(tái)式超純水器,杭州永杰達(dá)凈化科技有限公司;HGS510臺(tái)式劃膜噴金標(biāo)機(jī),杭州峰航科技有限公司;ZNCL-GS磁力攪拌器,河南愛博特科技發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PBNPs和PB@PDA的制備

PBNPs合成方法參考文獻(xiàn)[15],在磁力攪拌下將PVP K30 (6 g)和K3[Fe(CN)6] (264 mg)加到80 mL HCl溶液(0.01 mol/L)中。攪拌溶解后,將混合物放入80 ℃真空干燥箱中加熱20 h。室溫冷卻后離心收集沉淀物,并用乙醇和超純水洗滌數(shù)次。最后在60 ℃烘箱中干燥24 h后獲得PBNPs,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻(xiàn)[19]方法合成PB@PDA,取10 mL (1 mg/mL)普魯士藍(lán)溶液添加到含有1 mg/mL的鹽酸多巴胺(pH 8.5)的Tris溶液中,超聲反應(yīng)20 min,邊攪拌邊用碳酸鉀調(diào)節(jié)pH,反應(yīng)6 h后所得溶液在10 000 r/min離心25 min,沉淀物重懸在2 mL超純水中,所得溶液即為PB@PDA溶液。

1.3.2 PB-mAb和PB@PDA-mAb的制備

兩者都是采用經(jīng)典的靜電吸附方法將嘔吐毒素單克隆抗體連接在顆粒表面。以PB@PDA為例：取1 mL制備的PB@PDA置于蒸餾水中,超聲并渦旋后加入DON的抗體溶液,渦旋混合;在室溫下孵育1 h后,加入200 μL BSA(0.1 g/mL)溶液并再反應(yīng)1 h以封閉顆粒表面多余的結(jié)合位點(diǎn);將該混合物置于10 000 r/min離心25 min以除去未結(jié)合的抗體和 BSA,重復(fù)一次后,將PB@PDA-mAb 探針沉淀物重懸在100 μL PBS中,在 4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 表征方法

為觀察PBNPs和PB@PDA形貌特征,采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)進(jìn)行觀察。通過X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)表征來獲得PBNPs和PB@PDA的相對(duì)純度,結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)卡片進(jìn)行比較。為驗(yàn)證抗體是否成功結(jié)合到材料上,通過Zeta電位分析儀和紫外掃描光譜進(jìn)行表征,來觀察材料和探針之間的電勢和吸收峰是否有變化。

1.3.4 免疫層析試紙條的組裝及封閉液的選擇

試紙條由吸收墊、NC膜、結(jié)合墊和樣品墊四部分組成(圖1-a)。將質(zhì)量濃度總共1 mg/mL的DON Ag (DON-BSA生物綴合物)和0.5 mg/mL的山羊抗小鼠IgG沉積在NC膜上,分別以0.8 μL/cm的分配速率形成T線和C線(約4 mm距離)。然后,將處理過的膜在室溫下干燥2 h。樣品結(jié)合墊浸泡在封閉緩沖液(含2%(體積分?jǐn)?shù))BSA的0.01 mol/L PBS)中,37 ℃干燥過夜后,吸收墊按原樣使用。將樣品墊、NC膜、吸水墊依次搭粘到襯板上進(jìn)行組裝。最后,用切條機(jī)切成3 mm寬的試紙條,并貯存在干燥器中備用。

a-聚多巴胺包裹普魯士藍(lán)形成原理;b-免疫層析試紙條的檢測原理圖1 基于PB@PDA免疫層析試紙條競爭檢測DON

以DON-BSA偶聯(lián)物和PBNPs探針分別作為捕獲試劑和檢測試劑。樣品墊用不同的封閉緩沖液處理,37 ℃干燥過夜后,組裝試紙條。將試紙條插入到含有等量PBNPs探針的100 μL PBS 溶液中,15 min 后觀察顯色結(jié)果,確定最優(yōu)封閉液組成。

1.3.5 待測和加標(biāo)樣品的制備

DON標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.01 mol/L PBS (pH 7.4)緩沖液中稀釋至一系列不同濃度。將100 μL指定濃度的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液與2 μL PB-mAb和2 μL PB@PDA-mAb探針滴加到試紙條上用于檢測。同時(shí),選擇PBS (pH 7.4)作為空白對(duì)照。反應(yīng)15 min后觀察T線和C線測試結(jié)果(圖1-b)。當(dāng)存在較高濃度的DON 時(shí),形成 PB@PDA-mAb-DON,T 線無色,C 線有色;在沒有DON的情況下,T線和C線都顯色。DON的濃度可用Image J判斷,T 線的顏色強(qiáng)度隨著DON的濃度升高而減弱。

為驗(yàn)證試紙條實(shí)用性,購買了市售小麥樣本,所選小麥樣本均為DON陰性。稱取5.0 g碾碎的小麥樣品,向其中加入 DON 標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得 0.25～100 ng/g和0.1～100 ng/g的最終濃度,根據(jù)文獻(xiàn)[20]進(jìn)行預(yù)處理,具體步驟如下：取上述加標(biāo)樣品1 g置于10 mL離心管中,用3 mL 60%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇水溶液進(jìn)行提取。然后將混合物振蕩混勻5 min,于8 000 r/min離心10 min。收集上清液用0.01 mol/L PBS稀釋5倍后,用制備的試紙條進(jìn)行樣品分析,重復(fù)3遍,結(jié)果與市場上現(xiàn)有的膠體金試紙條相比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組樣品均設(shè)置3個(gè)平行,采用 Adobe Illustrator作圖并分析,通過 SPSS Statistics 26進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表征結(jié)果

用TEM觀察合成的PBNPs和PB@PDA形貌(圖2),如圖2-a和圖2-e所示,PBNPs和PB@PDA粒徑均一,PBNPs的平均粒徑在100 nm左右,而PB@PDA的平均粒徑穩(wěn)定在130 nm左右,且分散性良好。如圖2-b和圖2-f所示,對(duì)比普魯士藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS No.73—0687)可以看出2種納米材料的 XRD 吸收峰位置和強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)卡片一致,可以得出納米材料為純度較高的普魯士藍(lán)納米顆粒,而聚多巴胺包裹的普魯士藍(lán)納米粒子雖然吸收峰與普魯士藍(lán)一致,其吸收峰強(qiáng)度明顯比普魯士藍(lán)高,與其包裹一層多巴胺有關(guān)。進(jìn)一步比較2種離子PBNPs、PB@PDA以及連接抗體PB-mAb、PB@PDA-mAb后的 Zeta電位(圖2-c和圖2-g),PBNPs溶液的電位值為-24.9 mV,而連接抗體后的電位值為-19.8 mV,表明添加帶有正電的嘔吐毒素單克隆抗體后,抗體與帶有負(fù)電荷的 PBNPs發(fā)生靜電吸附,使其電位值發(fā)生變化,提示抗體與PBNPs成功結(jié)合, PB@PDA表現(xiàn)相似的現(xiàn)象。如圖2-d和圖2-h所示,PBNPs和PB-mAb在400～800 nm波長的紫外掃描光譜中均出現(xiàn)了強(qiáng)烈吸收峰,在標(biāo)記完抗體后都發(fā)生了吸收峰的偏移,而PB@PDA和PB@PDA-mAb紫外峰完全不一樣,這可能是因?yàn)榘谄蒸斒克{(lán)表面的聚多巴胺外殼改變了吸收波長和吸光強(qiáng)度導(dǎo)致的。

a-PBNPs TEM表征圖;b-PBNPS的XRD圖;c-PBNPs Zeta電位;d-PBNPs紫外掃描光譜;e-PB@PDA TEM電鏡圖;f-PB@PDA的XRD圖;g-PB@PDA Zeta電位;h-PB@PDA紫外掃描光譜圖2 PBNPs和PB@PDA的表征圖

2.2 樣品墊封閉液組成的優(yōu)化

用5種不同的封閉液對(duì)樣品墊浸泡處理,其中稀釋液均為 PBS 溶液(0.01 mol/L,pH 7.4),之后組裝試紙條并進(jìn)行空白樣品檢測,結(jié)果如表1所示?？梢钥吹綐悠穳|封閉液2% BSA+0.05%吐溫+1% PVP可以使試紙條的T線和C線顯色效果最好。

表1 樣品墊的最佳封閉液選擇Table 1 Selection of the best sealing solution for the sample pad

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 抗體標(biāo)記量的影響

如圖3-a所示,兩者都會(huì)隨著抗體標(biāo)記量的增加顏色發(fā)生改變,當(dāng)PBNPs-mAb在抗體標(biāo)記量達(dá)到12 μg時(shí)T線強(qiáng)度最佳,PB@PDA在抗體標(biāo)記量為9 μg時(shí)T線強(qiáng)度最佳。在基于競爭檢測原理的免疫層析試紙條中,當(dāng) T 線與 C 線明顯時(shí),抗體的用量越少,T 線上包被的抗原與待檢測物質(zhì)競爭越激烈,試紙條的檢測靈敏度就越高。此外,抗體的用量減少還可以大大降低免疫層析檢測成本。因此,選用 12 μg 嘔吐毒素單克隆抗體作為 1 mL PBNPs-mAb中抗體的最終標(biāo)記量,選用9 μg嘔吐毒素單克隆抗體作為 1 mL PB@PDA的最終標(biāo)記量。

a-2種試紙條抗體標(biāo)記量的優(yōu)化;b-2種試紙條探針用量的優(yōu)化;c-2種試紙條pH的優(yōu)化圖3 兩種試紙條帶的3種參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.3.2 探針用量的影響

在測試溶液中添加2種探針量也影響試紙條的靈敏度和信號(hào)強(qiáng)度。如圖3-b所示,當(dāng)PBNP-mAb和 PB@PDA-mAb 探針體積從 1 μL 增加至 2 μL時(shí),試紙條 T 線與 C 線的顏色強(qiáng)度逐漸加深,當(dāng)探針濃度為 2、2.5、3 μL時(shí),T 線與 C 線的顏色強(qiáng)度幾乎保持一致。基于最少探針量獲得最佳信號(hào)響應(yīng)的原則,選用2 μL PBNPs和PB@PDA-mAb 作為該試紙條中最優(yōu)探針添加量。

2.3.3 pH的影響

試紙條的檢測線和質(zhì)控線強(qiáng)度在一定程度上取決于探針溶液中pH的大小,如圖3-c所示,當(dāng)探針溶液的pH從酸性變?yōu)橹行詴r(shí)試紙條T 線與 C 線的顏色強(qiáng)度逐漸增高,而當(dāng)pH由中性逐漸變?yōu)樗嵝詴r(shí)T線與 C 線的顏色強(qiáng)度會(huì)逐漸降低。當(dāng)pH值達(dá)到7時(shí)2種條帶顏色都達(dá)到最高強(qiáng)度。這可能是因?yàn)樵谒嵝詶l件下探針粒子聚集成團(tuán)塊導(dǎo)致在結(jié)合墊前造成了太多滯留使得聚集在檢測區(qū)的探針數(shù)量變少,從而導(dǎo)致顏色強(qiáng)度變低[21]。而在堿性條件下普魯士藍(lán)納米粒子的分解導(dǎo)致顏色褪色,從而降低 T線與 C線的顏色強(qiáng)度。

2.4 試紙條的靈敏度分析

在最優(yōu)檢測條件下,通過檢測不同濃度的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液來確定2種免疫層析試紙條對(duì)DON的檢測靈敏度。如圖4所示,隨著檢測樣品中DON的濃度逐漸增加,PBNPs免疫層析試紙條T線上顏色條帶也逐漸減弱。當(dāng)DON質(zhì)量濃度達(dá)到1 ng/mL時(shí),T線上顏色明顯淺于陰性對(duì)照的T線顏色,而DON質(zhì)量濃度達(dá)到7 ng/mL時(shí),T線顏色完全消失。而PB@PDA的試紙條在DON質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 ng/mL時(shí)T線上顏色明顯淺于陰性對(duì)照的T線顏色,當(dāng)DON質(zhì)量濃度達(dá)到1 ng/mL時(shí),T線顏色完全消失。因此,基于PBNPs的免疫層析試紙條對(duì)DON的可視化檢出限和消線質(zhì)量濃度分別為1 ng/mL和7 ng/mL。PB@PDA免疫層析試紙條對(duì)DON的可視化檢出限和消線質(zhì)量濃度分別為0.2 ng/mL和1 ng/mL。

a-PB-LFIA檢測嘔吐毒素靈敏度結(jié)果;b-PB-LFIA對(duì)嘔吐毒素的線性方程分析;c-PB@PDA-LFIA檢測嘔吐毒素靈敏度結(jié)果;d-PB@PDA-LFIA對(duì)嘔吐毒素的線性方程分析圖4 PBNPs和PB@PDA的檢測靈敏度評(píng)估結(jié)果

此外,采用Image J軟件分析計(jì)算T線條帶的強(qiáng)度值,并分析其與DON濃度的關(guān)系。由圖4-b顯示,T線強(qiáng)度值與DON濃度呈負(fù)相關(guān),并且DON質(zhì)量濃度為0.5～3.0 ng/mL時(shí),T線強(qiáng)度值與DON質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2為0.992。而PB@PDA的試紙條的檢出限和消線質(zhì)量濃度分別為0.2 ng/mL和1 ng/mL(圖4-d),比PBNPs試紙條靈敏度提高了5倍,此外,PB@PDA在DON質(zhì)量濃度為0.1～0.5 ng/mL時(shí)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2為0.990。

2.5 試紙條的特異性

選取 FB1、AFB1、OTA、T-2和 ZEN 5 種常見的真菌毒素進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn),質(zhì)量濃度均為 10 ng/mL。肉眼觀察后結(jié)合 Image J 軟件分析檢測線的強(qiáng)度值。如圖5所示,含有FB1、AFB1、OTA、T-2、ZEN的檢測試紙條均在T線上顯示清晰的顏色,只有樣品中含有DON時(shí),在試紙條T線處觀察不到明顯的顏色,表明2種方法的特異性良好,不受其他真菌毒素干擾。

a-2種試紙條檢測特異性結(jié)果;b-2種試紙條特異性結(jié)果分析圖圖5 基于PBNPs和PB@PDA的免疫層析試紙條的特異性檢測結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品中的應(yīng)用

為驗(yàn)證該方法的實(shí)用性,將不同濃度DON添加到小麥中進(jìn)行檢測。如圖6-a所示,PB-LFIA對(duì)小麥DON的視覺檢出限和消線濃度分別為20、60 ng/g,而PB@PDA-LFIA對(duì)小麥DON的視覺檢測限和消線濃度分別為5 ng/g和20 ng/g(圖6-b)。進(jìn)一步與商品化膠體金檢測試紙條比較,如圖6-c可以發(fā)現(xiàn)膠體金的視覺檢測限和消線濃度分別為10 ng/g和50 ng/g,略高于PBNPs的靈敏度,但低于PB@PDA的靈敏度,3種試紙條的檢測限均低于我國對(duì)小麥中DON殘留限量1 000 μg/kg。PB@PDA-LDFIA與膠體金免疫層析法相比優(yōu)點(diǎn)有：a)普魯士藍(lán)和鹽酸多巴胺等材料價(jià)格低廉,合成只需簡單的離心便可獲得,制備過程省時(shí)省力;b)PBNPs穩(wěn)定性良好,具有更好的應(yīng)用前景;c)PBNPs能夠?qū)崿F(xiàn)量產(chǎn)化,能夠減少工藝損耗和生產(chǎn)時(shí)間。

a-PB-LFIA對(duì)小麥樣品中嘔吐毒素的檢測;b-PB@PDA-LFIA對(duì)小麥樣品中嘔吐毒素的檢測;c-膠體金對(duì)小麥樣品中嘔吐毒素的檢測圖6 三種免疫層析法對(duì)小麥樣品中嘔吐毒素的檢測

3 結(jié)論

本文以 PB@PDA為標(biāo)記物,通過競爭抑制模式建立了一種新型的 PB@PDA -LFIA,實(shí)現(xiàn)了對(duì)小麥中DON 的快速靈敏檢測。與傳統(tǒng)的PBNPs相比,合成的 PB@PDA 顏色亮度更強(qiáng),消線效果更好,顯著提高免疫層析的靈敏度。在最優(yōu)參數(shù)下,對(duì) DON 檢測的定性裸眼判斷閾值為 1.0 ng/mL,定量檢測限為 0.2 ng/mL。對(duì)小麥樣品的定量檢測限為5 ng/g。相比于商品化的膠體金和PB-LFIA,PB@PDA檢測靈敏度更高,對(duì)食品基質(zhì)有良好的抗干擾性,為快速、靈敏地檢測農(nóng)產(chǎn)品和食品中的真菌毒素提供了良好的應(yīng)用前景。