付為藝,蘇偉,2,3*,母應(yīng)春,陳添艷,尹學(xué)東

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院,貴州 貴陽,550025) 2(貴州大學(xué)貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品儲藏加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室,貴州 貴陽,550025) 3(貴州大學(xué)辣椒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,貴州 貴陽,550025)4(貴三紅食品有限公司,貴州 遵義,563099)

糟辣椒是一種備受消費(fèi)者喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵制品,其以新鮮辣椒為原料,生姜、大蒜為輔料,剁碎后添加食用鹽和其他調(diào)味料拌勻,裝罐密封發(fā)酵,形成特有的香、辣、鮮、酸、咸等風(fēng)味。隨著人們對食品安全的重視,糟辣椒的研究不僅體現(xiàn)在加工方式的優(yōu)化上[1-2],其有害成分[3]、微生物污染[4]、生花[5-6]、產(chǎn)氣[7-8]等情況也受到業(yè)界的廣泛關(guān)注。市面上大多數(shù)糟辣椒產(chǎn)品為延長其貯存時間并穩(wěn)定風(fēng)味,通常添加適當(dāng)?shù)柠}和防腐劑抑制有害微生物的生長[9-10]。但夏季溫度下,糟辣椒品質(zhì)不穩(wěn)定,易出現(xiàn)產(chǎn)氣脹罐等現(xiàn)象,使風(fēng)味發(fā)生改變。因此,探究30 ℃貯存條件下糟辣椒的產(chǎn)氣和風(fēng)味變化的原因十分必要。

高通量測序(high-throughput sequencing,HTS)作為新一代分子生物學(xué)技術(shù),區(qū)別于傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法,可以快速全面地反映樣品微生物群落的組成情況[11],已廣泛用于多種發(fā)酵食品的微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)變化以及功能微生物的研究。母應(yīng)春等[12]通過高通量技術(shù)對貴州3種酒曲的優(yōu)勢細(xì)菌和真菌進(jìn)行分析,揭示了酒曲中微生物組成種類的復(fù)雜程度;NIU等[13]也通過此技術(shù)對紅辣椒醬中細(xì)菌群落進(jìn)行動態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)乳酸菌是腌制辣椒的核心細(xì)菌。頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME/GC-MS)也廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性和定量分析,例如四川泡菜[14]和銅仁糟辣椒[15]。目前,將高通量技術(shù)和GC-MS進(jìn)行結(jié)合,探究特色發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)與揮發(fā)性風(fēng)味之間的關(guān)系是代謝組學(xué)的常見方法。母雨等[16]從盤縣腐敗火腿中發(fā)現(xiàn)腸桿菌科微生物是造成腐敗的菌群,也是火腿揮發(fā)性風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者;XIAO等[17]發(fā)現(xiàn),在傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中,乳酸桿菌占很大比例,與20多種風(fēng)味化合物密切相關(guān)。

本研究對正常、微產(chǎn)氣、產(chǎn)氣脹罐的3種樣品進(jìn)行研究,并將微產(chǎn)氣樣品置于30 ℃貯存,加速發(fā)酵產(chǎn)氣,跟蹤指標(biāo)變化;采用高通量測序技術(shù),揭示糟辣椒中微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性變化,并利用HS-SPME/GC-MS對其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測,通過主成分分析和正交偏最小二乘判別篩選出重要風(fēng)味物質(zhì)。最后,通過相關(guān)性分析挖掘特征產(chǎn)氣微生物,探究微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的潛在相關(guān)性,以期為解決夏季糟辣椒產(chǎn)氣問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糟辣椒由貴州省貴三紅食品有限公司提供,辣椒品種為遵義線椒。生產(chǎn)工藝流程如下：

新鮮辣椒→清洗→剁碎→添加鹽、輔料拌勻→發(fā)酵→水洗脫鹽(無菌水)→配料裝罐→檢測→成品

對正常、微產(chǎn)氣和產(chǎn)氣脹罐樣品進(jìn)行取樣,分別標(biāo)記為ZC、LW、CQ,并將微脹氣樣品置于30 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵加速產(chǎn)氣過程,跟蹤其指標(biāo)變化至其破罐,分別在5、12、18 d樣品進(jìn)行取樣,標(biāo)記為L5、L12、L18。上述樣品均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù),在無菌條件下進(jìn)行取樣,并立即置于-80 ℃冰箱貯存待分析。

氫氧化鈉,重慶川東化工有限公司;酚酞,成都金山化學(xué)試劑有限公司;E.Z.N.A.?soil試劑盒,美國Omega Bio-Tek;2%瓊脂糖凝膠,西班牙Biowest;FastPfuDNA聚合酶,中國TransGen;AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒,美國Axygen Biosciences;99.5%色譜級環(huán)己酮,中國上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004 N電子分析天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司;FieldScout SoilStik pH計,美國Spectrum公司;ABI GeneAmp?9700 PCR儀,美國ABI公司;NanoDrop2000超微量分光光度計、Trace1300-TSQ8000 HS-SPEM/GC-MS,美國Thermo Fisher Scientific公司;QuantiFluorTM-ST微型熒光劑,美國Promega公司;Illumina Miseq測序儀,美國Illumina公司;DYY-6C電泳儀,中國北京市六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 產(chǎn)氣及理化性質(zhì)

產(chǎn)氣高度測定：瓶口到封口膜頂點(diǎn)的高度;pH測定：參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》處理樣品,利用便攜式pH計測定;總酸測定：參考GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法。

1.3.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書提取糟辣椒樣品的總DNA,利用NanoDrop2000檢測DNA濃度和純度,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。細(xì)菌使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對16SrRNA基因的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;真菌用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)引物對ITS1-ITS2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min,細(xì)菌27個循環(huán),真菌35個循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL,4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。

1.3.3 高通量測序和生物信息學(xué)處理

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit對回收產(chǎn)物進(jìn)行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測后,利用QuantusTM熒光儀對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。利用Illumina公司Miseq PE300平臺進(jìn)行測序。數(shù)據(jù)處理使用QIIME2 dada2插件對序列進(jìn)行質(zhì)量控制、修剪、去噪、拼接、去嵌合體后,形成最終特征序列表格[18]。基于序列數(shù)據(jù)進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)等分析,并對物種注釋在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

1.3.4 GC-MS測定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

參照陳添艷等[19]方法。稱取2.5 g樣品置于20 mL頂空瓶,加入7.5 mL飽和食鹽水和20 μL環(huán)己酮(20 μg/mL,以色譜級無水乙醇作為溶劑),用PTFE硅膠隔膜密封。樣品在60 ℃下孵育10 min,將50/30 μm(DVB/CAR/PDMS)涂層纖維導(dǎo)入SPME裝置,插入頂空瓶并在60 ℃振搖提取40 min以吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。色譜條件：毛細(xì)管柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),氦氣(99.999%)為載氣,流速為1 mL/min,無分流模式。升溫程序：初始溫度40 ℃保持5 min,以5 ℃/min升至150 ℃,保持3 min,然后以5 ℃/min上升至240 ℃,保持5 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,傳輸線溫度240 ℃,在50～450 amu進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)據(jù)處理

定性分析：將實(shí)驗結(jié)果與NIST數(shù)據(jù)庫對比,保留匹配度大于700的化合物。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法對揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行定量,計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ci為任一組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù),μg/kg;Cis為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),μg/kg;Ai為任一組分的色譜峰面積;Ais為內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積;20為內(nèi)標(biāo)物體積,μL;2.5為待測樣品質(zhì)量,g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)至少測量3次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;Excel 2020用于統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù);IBMSPSS Statistics 26進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),確定差異顯著性(P<0.05);通過SIMCA 160軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)模型分析;繪圖使用Origin 2020bC;R軟件進(jìn)行相關(guān)性分析,并用Cytoscape軟件可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 糟辣椒的產(chǎn)氣、pH和總酸變化

對糟辣椒樣品進(jìn)行產(chǎn)氣、pH和總酸的測定,結(jié)果如表1所示。微產(chǎn)氣樣品置于30 ℃培養(yǎng)箱加速發(fā)酵產(chǎn)氣,其產(chǎn)氣狀況用產(chǎn)氣高度進(jìn)行表征,各階段均差異顯著(P<0.05)。pH和總酸是確定發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)。ZC和CQ樣品的pH和總酸存在顯著差異(P<0.05),CQ總酸可達(dá)(12.42±0.2) g/kg,約為ZC和LW的3倍。ZC與LW的pH并無顯著差異(P>0.05),總酸略有升高。隨貯存時間延長,LW的pH和總酸呈現(xiàn)先慢后快的變化的趨勢,總酸持續(xù)上升至(5.29±0.12) g/kg,但與CQ相比還是有顯著差異(P<0.05)。大多數(shù)發(fā)酵食品在貯存期間都會發(fā)生pH降低和總酸升高的現(xiàn)象,如剁椒山筍和剁椒姜絲[19-20],最終都會趨于平緩,但30 ℃下,糟辣椒樣品的pH和總酸持續(xù)變化,沒有平緩的趨勢,可能導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)。

表1糟辣椒的產(chǎn)氣、pH和總酸變化Table 1 Changes in gas production, pH and total acidity of fermented peppers

2.2 糟辣椒中微生物的α多樣性分析

糟辣椒微生物的α多樣性指數(shù)如表2所示。Chao1指數(shù)反映物種豐富度,指數(shù)隨著菌群豐富度的升高而增加,Simpson和Shannon指數(shù)評估樣本的物種多樣性,指數(shù)越高,表明多樣性越復(fù)雜[21]。樣品產(chǎn)氣過程中,細(xì)菌的Chao1指數(shù)表明其豐富度隨時間呈現(xiàn)降低趨勢,真菌變化則相對平緩。此外,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)表明細(xì)菌群落多樣性也呈現(xiàn)下降趨勢,真菌群落多樣性僅有較小波動,說明糟辣椒貯存過程中細(xì)菌的多樣性變化較真菌更為顯著,這與YANG等[22]對6種不同的蘿卜泡菜中微生物多樣性研究結(jié)果一致。綜上所述,微生物豐富度和多樣性隨時間不斷降低,且所有階段細(xì)菌豐富度都高于真菌。稀釋曲線和香農(nóng)曲線(附圖1,https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034865)趨于平緩代表當(dāng)前測序數(shù)據(jù)量足夠大,可信度高,可進(jìn)行后續(xù)分析。

a-細(xì)菌門水平;b-真菌門水平;c-細(xì)菌屬水平;d-真菌屬水平圖1 糟辣椒中細(xì)菌門水平、真菌門水平、細(xì)菌屬水平、真菌屬水平的相對豐度

表2 糟辣椒中微生物α多樣性分析Table 2 Analysis of alpha diversity of microorganisms in fermented peppers

2.3 糟辣椒中微生物群落組成變化

圖1顯示了樣品的細(xì)菌和真菌群落組成情況,展示相對豐度大于0.01的優(yōu)勢門和屬,其余歸為others。由圖1-a可知,細(xì)菌門水平共鑒定出5個細(xì)菌門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和綠菌門(Chloroflexi)。CHEN等[23]研究表明,厚壁菌門和變形菌門在不同鹽度的剁辣椒中均為優(yōu)勢菌。在ZC和LW中變形菌門為優(yōu)勢菌群,分別占總數(shù)的77%和79%,而在CQ中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門,占總數(shù)的96%。微產(chǎn)氣樣品在30 ℃條件下貯存,產(chǎn)氣過程中厚壁菌門逐漸占據(jù)優(yōu)勢,L12、L18中占總數(shù)的98%和99%。糟辣椒產(chǎn)氣過程中優(yōu)勢菌門由變形菌門轉(zhuǎn)變?yōu)楹癖诰T。由圖1-c可知,共檢出12個細(xì)菌屬,ZC、LW中Unspecified_Enterobacteriaceae和Unspecified_Xanthomonadaceae分別占總數(shù)的27%和29%,Unspecified_Xanthomonadaceae和歐文氏菌屬(Erwinia)的比例都大于或等于總數(shù)的10%,而在CQ中優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌,占總數(shù)的95%。L5中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)逐漸占據(jù)優(yōu)勢(53%),在L12、L18中分別為98%、99%。糟辣椒等發(fā)酵蔬菜體系中,發(fā)酵前期以異型發(fā)酵菌株如腸膜明串珠菌、短乳桿菌占主導(dǎo)地位,啟動發(fā)酵;發(fā)酵中后期植物乳桿菌等同型發(fā)酵菌株占據(jù)優(yōu)勢,完成發(fā)酵[24]。在其他泡蘿卜、泡菜等[25-26]發(fā)酵食品中均發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬為優(yōu)勢菌株,在剁辣椒中其相對豐度可達(dá)45.52%[23]。RHEE等[27]提出韓國泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌會迅速繁殖并發(fā)展成優(yōu)勢菌群,抑制其他微生物的生長。乳酸桿菌屬微生物相對豐度過高,在貯存過程中過度產(chǎn)酸,產(chǎn)氣,使產(chǎn)品發(fā)生酸化和脹罐的情況。例如：乳酸桿菌屬的短乳桿菌耐酸能力強(qiáng),是異型乳酸桿菌,能利用葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣。顧雙等[28]對泡菜中的乳酸菌及其產(chǎn)氣特性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)短乳桿菌具有產(chǎn)氣特性。王向陽等[29]對胖袋的真空包裝蘿卜干中微生物進(jìn)行分離鑒定,發(fā)現(xiàn)短乳桿菌是引起胖袋的原因之一。

由圖1-b所示子囊菌門(Ascomycota)是真菌門水平中的優(yōu)勢菌門,在每個樣品中都約占總數(shù)的99%,Unspecified_Fungi和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)均主要在CQ中出現(xiàn)。圖1-d顯示真菌屬水平共檢出5種真菌屬,其中優(yōu)勢菌株為刺盤孢屬(Colletotrichum),在ZC-L18中均占總數(shù)的91%～98%,CQ中鏈格孢霉屬(Alternaria)也有明顯升高,占總數(shù)的15%。刺盤孢屬是十大植物病原真菌類群之一,會引起農(nóng)林作物的炭疽病及水果采后腐爛,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。辣椒炭疽病是辣椒栽培中一種常見的真菌性病害,主要危害果實(shí)和葉片,也可侵染莖部[30]。鏈格孢霉屬也是一類可能引起植物發(fā)生病變的病原菌,所以,樣品中的這類真菌可能是由辣椒原料污染所致。

2.4 糟辣椒揮發(fā)性風(fēng)味化合物變化情況

通過GC-MS對糟辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及含量進(jìn)行檢測,共檢測出39種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)(附表1,https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034865),醇類8種、烷烴類8種、酚類5種、醛類4種、酸類6種、酯類5種、其他類3種。圖2分別是揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量、數(shù)量、PCA、OPLS-DA和投影變量重要性因子(variable importance factor,VIP)>1的物質(zhì)聚類分析。由圖2-a可知,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中酸類物質(zhì)含量為85%以上,L12和L18中可達(dá)90%,酸類物質(zhì)隨時間延長逐漸增多,醇類和酚類的相對含量存在減少的趨勢。由圖2-b可知,ZC中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為25種,樣品產(chǎn)氣過程中風(fēng)味物質(zhì)逐漸增多,CQ中增加到29種。主成分結(jié)果如圖2-c所示,第一主成分(PC1)為48.2%,第二主成分(PC2)為14.7%,總貢獻(xiàn)度為62.9%,產(chǎn)氣過程中糟辣椒風(fēng)味差異顯著。為了更準(zhǔn)確地體現(xiàn)各樣品間的差異,采用有監(jiān)督的OPLS-DA建立代謝物表達(dá)量與樣本類別之間的關(guān)系模型,來實(shí)現(xiàn)對樣本類別預(yù)測分析。如圖2-d模型的自變量擬合指數(shù)(R2X)為0.927,因變量擬合指數(shù)(R2Y)為0.955,模型預(yù)測指數(shù)(Q2)為0.61,R2和Q2超過0.5表示模型擬合結(jié)果可接受[31]。通過VIP發(fā)現(xiàn)共有14種重要風(fēng)味物質(zhì)(VIP>1)可能反映出產(chǎn)氣糟辣椒的風(fēng)味變化情況,其聚類分析如圖2-e所示。

a-揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量;b-數(shù)量;c-主成分分析;d-正交偏最小二乘判別分析;e-VIP>1的風(fēng)味物質(zhì)聚類分析圖2 糟辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量、數(shù)量、主成分分析、正交偏最小二乘判別分析和VIP>1的風(fēng)味物質(zhì)聚類分析

由于糟辣椒為開放式自然發(fā)酵,不同批次樣品的風(fēng)味不穩(wěn)定,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成存在差異,但物質(zhì)變化趨勢相同,可分為四類。正辛酸、正十六烷、羥基十一烷酸內(nèi)酯聚為一類,在CQ中含量較高;2,4-二叔丁基苯酚、正十二烷、油酸甲酯、辛酸乙酯聚為一類,含量隨產(chǎn)氣逐漸降低;1-甲基萘和視黃醛在產(chǎn)氣前期含量較高,山梨酸、二氫丁香酚、1-十五醇、正己醇主要集中產(chǎn)氣后期。

酸類物質(zhì)中山梨酸的含量最高,作為一種國際上廣泛使用的防腐劑,山梨酸具有較高抗菌性能,能有效抑制霉菌、酵母菌和好氧性細(xì)菌的活性,但對厭氧芽孢菌與嗜酸乳桿菌等有益微生物幾乎無效[32]。乙酸、反式-2-甲基-2-戊烯酸和正辛酸在貯存過程中含量顯著上升(P<0.05),其中乙酸和反式-2-甲基-2-戊烯酸僅在產(chǎn)氣的中后期(L12、L18)和CQ中檢測到,ZC及產(chǎn)氣初期(LW、L5)并未檢測到,乙酸等物質(zhì)的增多會給糟辣椒帶來刺激性酸味[33]。除酸類物質(zhì),LW及其產(chǎn)氣過程中存在的1-甲基萘是一種閾值極低的多環(huán)芳烴類化合物,具有“刺鼻、酸味”的氣味特征[34]。

醇類和酯類是構(gòu)成糟辣椒風(fēng)味的主要物質(zhì)[15]。本次樣品中共檢測出8種醇類,其中含量最高的物質(zhì)是芳樟醇,具有鈴蘭等花香味[35],XU等[36]發(fā)現(xiàn),芳樟醇是發(fā)酵辣椒中關(guān)鍵香味物質(zhì)之一。ZC中芳樟醇含量為(44.06±1.65) μg/kg而在CQ中含量減少至(36.9±12.16) μg/kg,LW的產(chǎn)氣過程也證實(shí)芳樟醇含量具有減少的趨勢。此外,具有清甜玫瑰花香的苯乙醇含量在LW、L12、L8中逐漸減少,豐富糟辣椒滋味的乙醇含量在此過程中先升高,后減少。酯類化合物大多數(shù)都具有水果香味,氣味閾值較低。樣品中多數(shù)酯類物質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢,如油酸甲酯、辛酸乙酯和2-甲基丁酸丁酯。2-甲基丁酸丁酯是泡椒中散發(fā)花香、果香的酯類之一[37],其含量在ZC中為(5.83±3.32) μg/kg,CQ中為(1.96±0.9) μg/kg,具有菠蘿的水果香氣的辛酸乙酯[38]在ZC中含量為(1.06±0.21) μg/kg,CQ未檢出,2種風(fēng)味物質(zhì)含量在LW產(chǎn)氣過程中逐漸減少。

糟辣椒中烴類主要有烯烴和飽和烷烴兩類,其中飽和烷烴大多數(shù)由于脂肪酸烷氧自由基的斷裂形成,閾值較高,對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大,而烯烴類物質(zhì)閾值較低,會影響整體風(fēng)味[39]。異松油烯呈現(xiàn)木香味和微微的柑橘甜味,α-萜品烯具有柑橘和檸檬似香氣,2-蒈烯有植物香味。酚類物質(zhì)閾值較低,對糟辣椒風(fēng)味有較大貢獻(xiàn),RAO等[25]發(fā)現(xiàn)2,4-二叔丁基苯酚是四川泡菜中的主要化合物之一,比較各階段發(fā)現(xiàn),其含量隨產(chǎn)氣逐漸降低,ZC中含量為(56.29±12) μg/kg,CQ中含量為(22.6±5.2) μg/kg。醛類的主要來源是脂肪酸氧化和氨基酸降解,閾值較低,能帶來清香或果香味。ZHONG等[40]發(fā)現(xiàn)視黃醛是由蔬菜中的β-胡蘿卜素在微生物作用下水解產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。CQ中出現(xiàn)的壬醛具有柑橘香味,2-乙基丁烯醛具有可可香氣,在榨菜和萵筍等其他發(fā)酵蔬菜制品[14]中發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)主要來源于原料本身。

2.5 微生物屬間及其與重要揮發(fā)性風(fēng)味化合物的相關(guān)性分析

探究產(chǎn)氣糟辣椒中微生物群落相關(guān)性及其與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的潛在相關(guān)性可以為兩者提供調(diào)控指南,改善產(chǎn)品品質(zhì)?；赑earson相關(guān)性分析對微生物屬間和微生物屬與VIP>1的14種重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析,并使用Cytoscape可視化。由圖3-a可知,16個微生物屬間共有6個相關(guān)性(|r|>0.8,P<0.05),乳酸桿菌屬(Lactobacillus)作為優(yōu)勢細(xì)菌屬與其他細(xì)菌存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,刺盤孢屬(Colletotrichum)也與其他真菌微生物屬為負(fù)相關(guān)關(guān)系,細(xì)菌屬與真菌屬間并無相關(guān)性。

a-微生物屬間的相關(guān)性分析;b-微生物屬和重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析圖3 微生物屬間的相關(guān)性分析、微生物屬和重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析

微生物屬與重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間共51個相關(guān)性(|r|>0.8,P<0.05)。如圖3-b所示,在微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間共有43個正相關(guān)(紅色實(shí)線)和8個負(fù)相關(guān)(綠色虛線)。12種細(xì)菌屬和4種真菌屬對7種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響較大。YE等[41]在腌制辣椒中也發(fā)現(xiàn),與真菌群落相比,細(xì)菌群落與風(fēng)味的相關(guān)性更強(qiáng)。51個相關(guān)性關(guān)系中,23個都是酯類物質(zhì)和細(xì)菌之間產(chǎn)生的,如明串珠菌屬(Leuconostoc)與油酸甲酯和辛酸乙酯存在強(qiáng)正相關(guān)性(|r|>0.95),優(yōu)勢細(xì)菌屬乳酸桿菌屬(Lactobacillus)與這2種酯類存在負(fù)相關(guān),這表明糟辣椒中細(xì)菌群落的變化對酯類物質(zhì)的影響最大。此外,乳酸桿菌屬與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的5種相關(guān)性都屬于負(fù)相關(guān),這表示在貯藏過程中乳酸桿菌屬的生長使大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)都有減少的趨勢。MONTANARI等[42]研究發(fā)現(xiàn),乳酸桿菌通過分解碳水化合物產(chǎn)生乳酸,從而影響碳水化合物向酯類或其他途徑的轉(zhuǎn)化。其余3種負(fù)相關(guān)都發(fā)生在正己醇與真菌微生物之間,表明醇類的減少可能是多種真菌共同作用的結(jié)果。

3 結(jié)論

綜上所述,糟辣椒產(chǎn)氣過程中總酸顯著上升,pH呈下降趨勢。優(yōu)勢細(xì)菌門由變形菌門轉(zhuǎn)變?yōu)楹癖诰T,優(yōu)勢細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬;優(yōu)勢真菌門為子囊菌門,優(yōu)勢真菌屬為刺盤孢屬。貯存過程中乳酸桿菌屬微生物迅速繁殖并發(fā)展成優(yōu)勢菌群,相對豐度過高,并快速產(chǎn)酸,產(chǎn)氣,使產(chǎn)品發(fā)生酸化和脹罐的情況。通過HS-SPME/GC-MS檢測到39種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括醇類8種、烷烴類8種、酚類5種、醛類4種、酸類6種、酯類5種、其他類3種。貯存前后化合物由25種增加到29種,酸類物質(zhì)種類增加,酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)種類減少,使糟辣椒產(chǎn)生刺鼻的酸味,花香、果香味減弱,對風(fēng)味的影響較大。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬與其他細(xì)菌屬為負(fù)相關(guān)關(guān)系,刺盤孢屬也與其他真菌微生物屬存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。微生物屬與14種重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性中,細(xì)菌演替對酯類物質(zhì)的影響最大,真菌的演替對醇類物質(zhì)的影響較大;乳酸桿菌屬與5種風(fēng)味物質(zhì)都呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。此研究為糟辣椒夏季產(chǎn)氣脹罐的微生物變化和風(fēng)味改變提供參考,并可結(jié)合產(chǎn)氣糟辣椒有害微生物、生物胺等食品安全指標(biāo),為后續(xù)糟辣椒質(zhì)量安全控制提供依據(jù)。