康艷慧，穆萍萍，張海雷

1.北京大學(xué)第一醫(yī)院太原醫(yī)院 太原市中心醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，山西 太原 030001

2.北京大學(xué)第一醫(yī)院太原醫(yī)院 太原市中心醫(yī)院 病理科，山西 太原 030001

3.太原市第四人民醫(yī)院 內(nèi)科，山西 太原 030053

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性進(jìn)行性的自身免疫性關(guān)節(jié)疾病，具有高發(fā)病率和高致殘率的特征。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者主要病因是成纖維樣滑膜（FLSs）細(xì)胞異常增殖和炎癥因子大量釋放，進(jìn)而破壞患者關(guān)節(jié)局部結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[1]。雷公藤是一種臨床上用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)中草藥，而雷公藤甲素是從雷公藤中分離鑒定出的一種主要活性成分，目前已有的研究表明，雷公藤具抗類風(fēng)濕、抗炎癥等作用，降低炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-18 和IL-1β 水平[2-3]。因此，雷公藤甲素治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有一定療效，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。近期，有研究表明雷公藤能夠通過抑制LC3B 蛋白表達(dá)，增強(qiáng)p62 表達(dá)抑制線粒體自噬，同時還減少NLRP3 表達(dá)進(jìn)而緩解結(jié)腸炎引發(fā)的炎癥損傷[4]。NLRP3 的表達(dá)和細(xì)胞焦亡息息相關(guān)，并且在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中檢測到細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白GSDMD-N 表達(dá)顯著上調(diào)[5]?；诖耍狙芯客ㄟ^比較不同質(zhì)量濃度的雷公藤甲素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 細(xì)胞線粒體自噬、NLRP3 炎癥小體的活化和細(xì)胞焦亡的影響，探討雷公藤甲素治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

FLSs 細(xì)胞（貨號ZY-R025）和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 細(xì)胞（貨號HZ-H197）購自上海滬震生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

雷公藤甲素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，貨號38748-32-2）購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO，貨號01934-1L）購自Sigma-Aldrich 公司；青霉素–鏈霉素溶液（貨號SV30010）、DMEM（貨號SH30022.01B）培養(yǎng)基購自Hyclone；細(xì)胞焦亡檢測試劑盒（貨號為ab39412）購自Abcam 公司；IL-1β、IL-18 ELISA 檢測試劑盒（貨號JC-E1109、JCA04206）購自上海機(jī)純實業(yè)有限公司。本研究所用抗體微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3B（LC3B，貨號ab192890）、聚集素-1（p62，貨號ab109012）、抑制素2（PHB2，貨號ab182139）、NOD 樣受體蛋白3（NLRP3，貨號 ab263199）、噬菌體溶解素 D（GSDMD，貨號ab219800）、噬菌體溶解素D N-末端片段（GSDMD-N，貨號ab215203）、糖酵解酶（GAPDH，貨號ab8245）、Goat Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor?488；貨號ab150077）和Goat Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor?488；貨號150113）均購自英國Abcam 公司。超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（貨號P0018M）購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司。

3111 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國熱電公司，HT 型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek 公司，CytoFLEX 型流式細(xì)胞儀購自美國Beckman 公司，24KS 型電泳儀購自北京六一公司，TE22 型轉(zhuǎn)膜儀購自美國Hoefer 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將FLSs 細(xì)胞和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 細(xì)胞置于含有10% FBS、100 μg/mL 青霉素–鏈霉素的DMEM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確保培養(yǎng)溫度為37 ℃、50%CO2。將培養(yǎng)3～8 代后的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測細(xì)胞線粒體自噬、NLRP3 炎癥小體激活和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 細(xì)胞采用0、10、20、40 ng/mL 雷公藤甲素處理48 h，F(xiàn)LSs 細(xì)胞添加等量的二甲基亞砜后常規(guī)培養(yǎng)48 h。細(xì)胞通過胰蛋白酶消化后，用磷酸緩沖液沖洗3 次后重懸細(xì)胞，用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用SDS-PAGE上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜后，將蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的洗滌液中，封閉，之后加入以下抗體進(jìn)行孵育：LC3B（1∶1 000；Abcam）、p62（1∶1 000；Abcam）、PHB2（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）、GSDMD-N（1∶1 000）或GAPDH（1∶1 000），洗滌后，加入以1∶20 000稀釋的以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG H&L 或羊抗鼠IgG H&L 二抗，室溫孵育1 h后，用ECL 發(fā)光試劑進(jìn)行蛋白檢測。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測NLRP3 炎癥小體相關(guān)通路、IL-1β 和IL-18 的水平

取雷公藤甲素（0、10、20、40 ng/mL）或二甲基亞砜處理后的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 和FLSs 細(xì)胞的上清，按照ELISA 試劑盒說明書測定各組中IL-1β和IL-18 水平。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞焦亡

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 細(xì)胞采用不同濃度的雷公藤甲素（溶解于二甲基亞砜，使終濃度分別達(dá)到0、10、20、40 ng/mL[6]）處理48 h，F(xiàn)LSs 細(xì)胞添加等量的二甲基亞砜后常規(guī)培養(yǎng)48 h。根據(jù)細(xì)胞焦亡檢測試劑盒說明指導(dǎo)，用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1）檢測試劑盒和碘化丙啶（PI）檢測試劑盒標(biāo)記各組細(xì)胞（6×104個/孔）并采用流式細(xì)胞儀檢測分析，統(tǒng)計Caspase-1＋PI＋細(xì)胞個數(shù)占總細(xì)胞個數(shù)的百分比即記為細(xì)胞焦亡水平[7]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雷公藤甲素對線粒體自噬線粒體的影響

與FLSs 組相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 組細(xì)胞的線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3B 表達(dá)升高，p62 和PHB2的表達(dá)顯著降低（P＜0.001）。采用10、20、40 ng/mL雷公藤甲素處理類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 后，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素各劑量組均能顯著下調(diào)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs細(xì)胞的線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3B 的表達(dá)，上調(diào)p62和PHB2 的表達(dá)（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，見圖1。

圖1 雷公藤甲素對線粒體自噬線粒體的影響（，n=3）Fig.1 Effect of triptolide on mitochondria autophagy (,n=3)

2.2 雷公藤甲素對NLRP3 炎癥小體激活情況的影響

與FLSs 組相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 組NLRP3表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）。與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 組相比，雷公藤甲素各劑量組NLRP3 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，見圖2。

圖2 雷公藤甲素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 細(xì)胞NLRP3 炎癥小體激活的影響（，n=3）Fig.2 Effect of triptolide on activation of NLRP3 inflammasome in rheumatoid arthritis FLSs cell (,n=3)

2.3 雷公藤甲素對炎癥因子IL-1β 和IL-18 水平的影響

與FLSs 組相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 組炎癥因子IL-1β 和IL-18 水平顯著升高（P＜0.001）。與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 組相比，雷公藤甲素各劑量組的IL-1β 和IL-18 水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，見圖3。

圖3 雷公藤甲素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 細(xì)胞IL-1β 和IL-18 水平的影響（，n=3）Fig.3 Effect of triptolide on IL-1β and IL-18 levels in rheumatoid arthritis FLSs cell (,n=3)

2.4 雷公藤甲素對細(xì)胞焦亡水平的影響

與FLSs 組相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 組細(xì)胞焦亡率顯著升高（P＜0.01）。與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 組相比，雷公藤甲素各劑量組細(xì)胞焦亡率顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，見圖4。

圖4 雷公藤甲素對細(xì)胞焦亡水平的影響（，n=3）Fig.4 Effect of triptolide on pyroptosis in rheumatoid arthritis FLSs cell (,n=3)

2.5 雷公藤甲素對細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與FLSs 組相比，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 組細(xì)胞GSDMD 蛋白表達(dá)顯著降低，GSDMD-N 蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.001）。與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 組相比，雷公藤甲素各劑量組細(xì)胞GSDMD 蛋白表達(dá)顯著上升，GSDMD-N 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，見圖5。

圖5 雷公藤甲素對細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n=3）Fig.5 Effect of triptolide on pyroptosis-related proteins expression (,n=3)

3 討論

雷公藤性寒，具有祛風(fēng)濕、消腫解毒、通經(jīng)活絡(luò)的功效[8]。其中，雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分之一，是一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在藥物。正常FLSs 是一種能夠分泌滑液使關(guān)節(jié)潤滑，防止關(guān)節(jié)黏連的一類細(xì)胞。但是，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者FLSs 不僅異常增殖和侵襲，而且能釋放大量致炎因子介導(dǎo)關(guān)節(jié)破壞，最終對患者造成不可逆的關(guān)節(jié)損傷[9]。線粒體自噬是一種修復(fù)細(xì)胞損傷，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種方式，它主要的作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)線粒體的融合和分裂，清除發(fā)生損傷或多余的線粒體，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)線粒體的更新，維持細(xì)胞內(nèi)線粒體的動態(tài)平衡[10]。近期研究發(fā)現(xiàn)，外濕可以加劇類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的線粒體自噬和損傷線粒體的堆積[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 與FLSs 相比，線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3B 表達(dá)升高、p62 和PHB2 的表達(dá)顯著降低，表明線粒體自噬水平增強(qiáng)。究其原因，可能是由于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 細(xì)胞為了維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)則增強(qiáng)線粒體自噬水平，代償細(xì)胞損傷機(jī)制。在線粒體自噬中，p62 和LC3B 蛋白分別發(fā)揮著標(biāo)記并聚集受損蛋白和線粒體的作用，并能參與和促進(jìn)自噬小體的形成。而PHB2 是分布于線粒體內(nèi)膜上的蛋白，其獨有的LC3 結(jié)構(gòu)域能夠幫助受損的線粒體被自噬小體錨定并降解[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素能夠抑制LC3B 蛋白表達(dá)上調(diào)，同時增強(qiáng)p62 和PHB2 表達(dá)，表明雷公藤甲素能夠減弱線粒體自噬水平，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎引發(fā)的線粒體自噬水平失衡得到緩解。

研究指出，線粒體是NLRP3 功能的中心調(diào)控因子，線粒體DNA 的釋放可以促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的組裝和激活[13]。當(dāng)NLRP3 炎癥小體活化后，通過轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB（NF-κB）輕鏈增強(qiáng)子激活的B 細(xì)胞觸發(fā)pro IL-1β 和pro IL-18 的表達(dá)，最終誘導(dǎo)促炎因子IL-1β 和IL-18 的成熟和分泌[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在促進(jìn)FLSs 線粒體自噬的同時，還能增強(qiáng)NLRP3 的表達(dá)，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能通過促進(jìn)線粒體自噬促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的活化。此外，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎還能促進(jìn)IL-1β 和IL-18 炎癥因子的表達(dá)，激活炎癥反應(yīng)。雷公藤甲素是一種抗炎中藥，在給予不同劑量的雷公藤甲素處理后，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 細(xì)胞的NLRP3 炎癥小體的活化作用被有效地抑制，部分恢復(fù)到正常FLSs 細(xì)胞的水平，表明雷公藤甲素能夠作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在藥物可能是通過抑制線粒體自噬，進(jìn)而抑制NLRP3 炎癥小體的活化作用，最終抑制促炎癥因子高表達(dá)引發(fā)的炎癥反應(yīng)。臨床上，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者檢出滑膜組織的NLRP3 炎癥小體被顯著激活，并發(fā)現(xiàn)IL-1β 和IL-18 的高表達(dá)，這與本研究結(jié)果一致[15-16]。

細(xì)胞焦亡是一種特殊的細(xì)胞死亡方式，其特征為細(xì)胞核溶解、細(xì)胞膜溶脹以及細(xì)胞質(zhì)和其內(nèi)容物外泄。細(xì)胞焦亡的最經(jīng)典途徑是依賴于Caspase-1 介導(dǎo)的，而GSDMD 是最主要的效應(yīng)分子。Caspase-1可以通過裂解GSDMD，產(chǎn)生GSDMD-N 作為活性結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜上聚合形成孔道，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性和細(xì)胞溶脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡。此外，GSDMD-N 形成的孔道也是釋放炎癥因子的重要途徑之一[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLSs 細(xì)胞中GSDMD 表達(dá)降低，而GSDMD-N 表達(dá)顯著升高，表明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎能夠促進(jìn)細(xì)胞焦亡。最新研究發(fā)現(xiàn)，新風(fēng)膠囊能抑制FLSs 細(xì)胞焦亡，同時下調(diào)炎癥細(xì)胞因子分泌，減輕關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)[18]。同樣本研究也發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素能夠有效地抑制細(xì)胞焦亡，同時觀察到焦亡相關(guān)蛋白GSDMD 表達(dá)升高，GSDMD-N 降低，表明雷公藤甲素通過抑制GSDMD 的裂解抑制細(xì)胞焦亡。

綜上所述，雷公藤甲素能通過抑制線粒體自噬、NLRP3 炎癥小體激活和細(xì)胞焦亡，抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突