李鵬，劉怡，王鳳嬋，趙國(guó)靜，韓萍，周佩夏，葉海燕，王坤，胡海波，陸學(xué)超

青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院 青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266033

肺纖維化是許多間質(zhì)性肺部疾病的終末結(jié)局，可導(dǎo)致呼吸困難或呼吸衰竭，確診后平均預(yù)期壽命僅為3 年[1]。盡管當(dāng)前有大量關(guān)于肺纖維化的研究，但通過(guò)化學(xué)藥治療肺纖維化的效果并不理想[2]。面對(duì)逐年上漲的肺纖維化發(fā)病率，以其關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制為出發(fā)點(diǎn)，著力于研發(fā)高效治療藥物對(duì)于改善肺纖維化患者預(yù)后，提高其生活質(zhì)量具有重要的意義。

補(bǔ)肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂組成，可益氣活血、補(bǔ)肺固腎，常用于臨床肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、重癥肺炎等疾病的治療。研究表明，補(bǔ)肺活血膠囊可以減少肺組織中炎性因子的分泌，改善肺炎性損傷及纖維化樣變的程度[3]，一定程度上能延緩肺功能下降，改善臨床癥狀[4]。然而其具體的作用機(jī)制尚不明確。本研究擬通過(guò)博來(lái)霉素建立小鼠肺纖維化模型，并用補(bǔ)肺活血膠囊進(jìn)行治療。通過(guò)小鼠存活率、鼠肺泡灌洗液（BALF）總細(xì)胞與總蛋白、肺組織濕干質(zhì)量比（W/D）與羥脯氨酸（HYP）和肺組織病理學(xué)變化研究補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)肺纖維化小鼠的治療作用，并基于Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）通路研究補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)肺纖維化小鼠上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，以期闡明補(bǔ)肺活血膠囊治療肺纖維化的機(jī)制，為補(bǔ)肺活血膠囊臨床應(yīng)用治療肺纖維化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

90 只SPF 級(jí)健康雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)買于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008。每5 只小鼠一籠，飼養(yǎng)于室溫（21±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，明暗12 h/12 h 的環(huán)境并使小鼠自由進(jìn)食飲水。本研究經(jīng)青島市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批號(hào)2024HC01LS12。

1.2 藥品與試劑

NLRP3 抑制劑MCC950（貨號(hào)S8930，美國(guó)Selleck 公司）；博來(lái)霉素（貨號(hào)M2100，美國(guó)AbMole公司）；補(bǔ)肺活血膠囊（規(guī)格0.35 g/粒，批號(hào)155532，廣東雷允上藥業(yè)有限公司）；BCA 法微量蛋白檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)W041-1-1，南京建成生物工程研究所）；牛血清白蛋白（BSA，貨號(hào)W071-1-1，南京建成生物工程研究所）；Masson 染液（貨號(hào)D026-1-3，南京建成生物工程研究所）；蘇木素–伊紅（HE）染液（貨號(hào)D006-1-4，南京建成生物工程研究所）；HYP 檢測(cè)試劑盒（堿水解法，貨號(hào)A030-2-1，南京建成生物工程研究所）；羊抗鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶（HRP，貨號(hào)KS001，南京建成生物工程研究所）；羊抗兔IgG-HRP（貨號(hào)KS002，南京建成生物工程研究所）；抗體：β-肌動(dòng)蛋白（β-actin，貨號(hào)3700）、E-鈣黏蛋白（E-cad，貨號(hào)14472）、波形蛋白（Vim，貨號(hào)3932）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA，貨號(hào)69319）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β，貨號(hào)3711）、NLRP3（貨號(hào)15101）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC，貨號(hào)67824）、cleaved-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1，貨號(hào)89332）、mature-白細(xì)胞介素（IL）-1β（貨號(hào)63124）、mature-IL-18（貨號(hào)57058），Cell Signaling Technology；試劑盒：總RNA 提取試劑盒（貨號(hào)#DP419）、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)#KR116-02）、SYBR 擴(kuò)增試劑盒（貨號(hào)#P205-02，天根生化科技（北京）有限公司）。

1.3 儀器

LP-5117 型多功能酶標(biāo)儀（長(zhǎng)春樂鏷科技有限公司）；PowerPAC Basic 電泳儀和ChemiDoc XRS凝膠成像自動(dòng)分析儀（Bio-Rad 公司）；H3-18KR 型高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；MDF-C8V(N)型?80 ℃冷凍冰箱（日本SANYO 公司）；LEPGEN-96 熒光定量PCR 儀[樂普（北京）醫(yī)療器械股份有限公司]。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、NLRP3 抑制劑（MCC950）組及補(bǔ)肺活血膠囊低、中、高（0.32、0.63、1.26 g/kg）組，每組15 只。通過(guò)對(duì)小鼠氣管內(nèi)單次注射2.5 mg/kg 博來(lái)霉素來(lái)誘導(dǎo)肺纖維化。對(duì)照組小鼠接受單次氣管內(nèi)注射等體積的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。在接受氣管注射后第1 天開始，MCC950 組每天ip 10 mg/kg MCC950，補(bǔ)肺活血膠囊組每天分別ig 0.32、0.63、1.26 g/kg補(bǔ)肺活血膠囊。補(bǔ)肺活血膠囊劑量根據(jù)等效劑量換算公式（等效劑量＝成人每日劑量/70×9.1）計(jì)算得出，其中中劑量為人等效劑量，低劑量為等效劑量的1/2 倍，高劑量為等效劑量的2 倍。給藥前確定小鼠體質(zhì)量，以便準(zhǔn)確計(jì)算所需藥物量。將膠囊中的細(xì)粉顆粒按照高劑量濃度溶于生理鹽水，之后使用生理鹽水分別梯度稀釋為中劑量和低劑量，按照每只小鼠接受0.2 mL 藥物溶液進(jìn)行配制。對(duì)照組與模型組每天分別ig 等體積的生理鹽水，整個(gè)給藥過(guò)程持續(xù)21 d。給藥過(guò)程中，每天統(tǒng)計(jì)各組小鼠存活的數(shù)量。在接受氣管注射后第22 天，小鼠以頸椎脫臼法被處死，稱質(zhì)量并收集樣本。

2.2 肺組織標(biāo)本采集與病理學(xué)染色

小鼠處死后，切開胸腔并充分暴露頸部氣管。結(jié)扎右肺后，用4 ℃的PBS 對(duì)左肺進(jìn)行3 次灌洗，每次0.5 mL，回收的液體即為BALF，灌洗后的左肺摘下在?80 ℃冰箱保存。然后將BALF 在4 ℃下以150×g離心5 min，并將灌洗液的上清液儲(chǔ)存在?80 ℃，用總蛋白測(cè)定試劑盒分析總蛋白含量。將BALF 樣品的細(xì)胞顆粒重新懸浮在PBS 中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

BALF 收集完成后，摘取結(jié)扎的右肺放入4%多聚甲醛固定，取下葉稱取濕質(zhì)量（W），然后置于60 ℃烘箱中烘干72 h 后稱取干質(zhì)量（D），計(jì)算肺組織濕干質(zhì)量比（W/D）。剩余右肺嵌入石蠟包埋后，制成3 μm 的切片進(jìn)行染色。進(jìn)行蘇木精–伊紅（HE）染色和Masson 染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果以評(píng)估肺部炎癥和膠原沉積的水平。采用Szapiel 量化方法對(duì)HE 染色進(jìn)行評(píng)估[5]，采用改良的Ashcroft 量化方法對(duì)Masson 染色進(jìn)行評(píng)估[6]。

2.3 肺組織HYP 測(cè)定

精準(zhǔn)稱量30 mg 肺組織，使用生化試劑盒測(cè)定肺部膠原蛋白主成分HYP 的水平。HYP 氧化后與二甲氨基苯甲醛反應(yīng)顯紫紅色，用酶標(biāo)儀在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。

2.4 qRT-PCR 檢測(cè)EMT 相關(guān)蛋白的mRNA 表達(dá)

使用總RNA 提取試劑盒從肺組織及細(xì)胞中獲得總RNA。再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。使用qPCR 法測(cè)定E-cad、Vim、α-SMA、TGF-β1mRNA表達(dá)量。引物序列見表1，使用2?ΔΔCt法基于β-actin計(jì)算目標(biāo)mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.5 Western blotting 檢測(cè)EMT 以及NLRP3 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

將肺組織及細(xì)胞放入含1 mmol/L PMSF 的冰冷的RIPA 緩沖液中進(jìn)行超聲均質(zhì)提取總蛋白。使用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液中的蛋白濃度。提取的蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE 分離后電轉(zhuǎn)到PVDF膜。使用5%脫脂奶粉溶液封閉膜1 h，隨后用Ecad、VIM、α-SMA、TGF-β1、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、cleaved-IL-1β、cleaved-IL-18 的抗體在4 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜。用TBST 清洗3 次孵育后的膜，然后用HRP 標(biāo)記的二抗在室溫下培養(yǎng)1 h，再次洗膜后經(jīng)ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，最后使用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行量化分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2019 和SPSS Pro 在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)肺纖維化小鼠存活率的影響

給藥結(jié)束后，對(duì)照組小鼠存活率為100%，模型組小鼠存活率為47%，MCC950 和補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)可顯著增加肺纖維化小鼠存活率。MCC950 組存活率為67%，補(bǔ)肺活血膠囊0.32、0.63、1.26 g/kg組存活率分別為60%、67%、73%，見圖1。

圖1 肺纖維化小鼠存活率（n=15）Fig.1 Survival rate of mice with pulmonary fibrosis (n=15)

3.2 補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)肺纖維化小鼠體質(zhì)量、肺組織W/D 的影響

與模型組相比，MCC950 組、補(bǔ)肺活血膠囊1.26 g/kg 組體質(zhì)量顯著升高（P＜0.01）；MCC950 組和補(bǔ)肺活血膠囊0.63、1.26 g/kg 組肺組織W/D 顯著降低（P＜0.05、0.01），見圖2。

圖2 肺纖維化小鼠體質(zhì)量和肺組織W/D（，n=15）Fig.2 Body mass and W/D of mice with pulmonary fibrosis (,n=15)

3.3 補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)肺纖維化小鼠BALF 總細(xì)胞數(shù)和總蛋白的影響

與模型組相比，MCC950 組、補(bǔ)肺活血膠囊各劑量組BALF 總細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05、0.01）；MCC950 組和補(bǔ)肺活血膠囊0.63、1.26 g/kg 組總蛋白濃度顯著降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 BALF 總細(xì)胞數(shù)和總蛋白濃度（，n=15）Fig.3 Total cell count and total protein concentration of BALF (,n=15)

3.4 補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)肺纖維化小鼠肺組織病理的影響

HE 染色顯示，對(duì)照組肺組織未發(fā)現(xiàn)肺泡炎性滲出及纖維化病變，肺泡結(jié)構(gòu)清晰；模型組肺部結(jié)構(gòu)發(fā)生了扭曲，肺間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，纖維組織增生、纖維化，肺泡腔增大、融合；MCC950、補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后，肺纖維化小鼠肺組織病理化程度減輕，肺組織結(jié)構(gòu)完整度提升，肺泡間隔厚度減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。與模型組比較，MCC950 組和補(bǔ)肺活血膠囊各劑量組Szapiel 評(píng)分顯著降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 肺纖維化小鼠肺組織HE 染色及Szapiel 量化評(píng)分（，n=15）Fig.4 HE staining and Szapiel quantitative score of lung tissue of mice with pulmonary fibrosis (,n=15)

Masson 染色顯示，對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常；模型組肺間質(zhì)中存在明顯的藍(lán)色膠原蛋白沉積，呈大片束狀及片狀分布，肺組織纖維化程度嚴(yán)重；MCC950、補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后肺纖維化小鼠肺組織中藍(lán)色膠原蛋白沉積減少，肺纖維化程度明顯減輕。與模型組比較，MCC950 組和補(bǔ)肺活血膠囊各劑量組Ashcroft 評(píng)分顯著降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 肺纖維化小鼠肺組織Masson 染色及Ashcroft 量化評(píng)分（，n=15）Fig.5 Masson staining and Ashcroft quantitative score of lung tissue of mice with pulmonary fibrosis (,n=15)

3.5 補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)肺纖維化小鼠HYP 的影響

與模型組比較，MCC950 組和補(bǔ)肺活血膠囊0.63、1.26 g/kg 組HYP 含量顯著降低（P＜0.05、0.01），見圖6。

圖6 肺纖維化小鼠HYP 含量（，n=15）Fig.6 HYP content in mice with pulmonary fibrosis(,n=15)

3.6 補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)EMT 相關(guān)蛋白mRNA 和蛋白表達(dá)的影響

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與模型組相比，MCC950組、補(bǔ)肺活血膠囊各劑量組中的Vim、α-SMA、TGFβ1 mRNA 表達(dá)明顯降低，E-cad mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.05、0.01），見圖7。

圖7 補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)EMT 相關(guān)mRNA 的影響（，n=15）Fig.7 Effect of Bufei Huoxue Capsules on EMT-related mRNA (,n=15)

Western blotting 結(jié)果顯示，與模型組相比，MCC950 組、補(bǔ)肺活血膠囊各劑量組的Vim、α-SMA、TGF-β1 蛋白表達(dá)明顯降低，E-cad 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05、0.01），見圖8。

圖8 補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)EMT 相關(guān)表達(dá)蛋白的影響（，n=15）Fig.8 Effect of Bufei Huoxue Capsules on EMT-related expression proteins (,n=15)

3.7 補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)NLRP3 信號(hào)通路表達(dá)蛋白的影響

與模型組相比，MCC950 組、補(bǔ)肺活血膠囊各劑量組的NLRP3、ASC、mature-Caspase-1、mature-IL-1β、mature-IL-18 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05、0.01），見圖9。

圖9 補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)NLRP3 信號(hào)通路表達(dá)蛋白的影響（，n=15）Fig.9 Effect of Bufei Huoxue capsule on NLRP3 signaling pathway (,n=15)

4 討論

博來(lái)霉素作為一種化學(xué)治療性抗生素，被廣泛應(yīng)用于肺纖維化動(dòng)物模型的制作[11]。本研究通過(guò)博來(lái)霉素建立肺纖維化模型小鼠。MCC950 與補(bǔ)肺活血膠囊給藥治療后，肺纖維化小鼠生存率明顯提高，體質(zhì)量明顯增加，肺組織W/D、BALF 總細(xì)胞與總蛋白、羥脯氨酸含量均明顯降低，肺纖維化進(jìn)程明顯改善，補(bǔ)肺活血膠囊治療效果明顯。

后續(xù)本研究探討了補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)肺纖維化小鼠EMT 的影響，結(jié)果顯示，補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)后可提高肺纖維化小鼠肺組織E-cad 表達(dá)，降低VIM、α-SMA、TGF-β1 表達(dá)。過(guò)度的EMT 在肺纖維化發(fā)展中起到了關(guān)鍵性的作用。EMT 是上皮細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，這個(gè)過(guò)程中上皮細(xì)胞失去其部分特征和標(biāo)記從而獲得間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記，在各種損傷刺激下分化的上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)表型轉(zhuǎn)化可形成大量的成纖維細(xì)胞以及肌成纖維細(xì)胞，而肌成纖維細(xì)胞則可以通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過(guò)度積累促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展[12]。在EMT 過(guò)程中，上皮細(xì)胞基因表達(dá)受到抑制導(dǎo)致上皮細(xì)胞標(biāo)記物如E-cad 蛋白表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)激活導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物如Vim、α-SMA、蛋白表達(dá)增加[13]，因此可以通過(guò)檢測(cè)相關(guān)蛋白以及mRNA 的變化來(lái)表征EMT 的發(fā)生發(fā)展。TGF-β1 是ECM 過(guò)度積累、成纖維細(xì)胞增殖和分化為肌成纖維細(xì)胞的主要誘導(dǎo)劑，即肺纖維化中誘導(dǎo)EMT 發(fā)生的關(guān)鍵因子，抑制TGF-β1 的表達(dá)可改善EMT 的發(fā)展[14-15]。

近年來(lái)有許多研究證實(shí)EMT 的促進(jìn)可能與激活NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路有關(guān)，這種變化會(huì)加劇腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移，而其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用鮮有研究[16-18]。NLRP3 炎癥小體是由NLRP3、ASC、Caspase-1 組成的多蛋白復(fù)合物，當(dāng)NLRP3 被激活時(shí)會(huì)促進(jìn)NLRP3 炎癥小體各組分（NLRP3、ASC、Caspase-1）的組裝，進(jìn)而激活 pro-Caspase-1 形成具有活性的 cleaved-Caspase-1，對(duì)炎癥因子IL-1β 和IL-18 進(jìn)行切割并使其成熟，mature-IL-1β 可以刺激TGF-β1 合成，而TGF-β1 是EMT 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性因子，TGF-β1 合成增加將加劇肺泡EMT 進(jìn)程，從而加速肺纖維化形成，抑制NLRP3 可以明顯緩解肺纖維化[19-21]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，補(bǔ)肺活血膠囊可以下調(diào)NLRP3 相關(guān)蛋白的表達(dá)，下調(diào)肺纖維化小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，表明NLRP3 途徑可能是補(bǔ)肺活血膠囊抗肺纖維化的重要調(diào)節(jié)通路。MCC950 是一種有效的特異性NLRP3 炎癥小體小分子抑制劑，抑制原理與其直接結(jié)合NLRP3 中NACHT 結(jié)構(gòu)域的Walker B 基序繼而阻斷ATP 水解有關(guān)，此外其對(duì)NLRP1、NLRC4、AIM2 等炎癥小體的激活沒有影響[22-23]。因此本研究選取MCC950 作為陽(yáng)性對(duì)照藥物對(duì)比補(bǔ)肺活血膠囊對(duì)NLRP3 的抑制作用，結(jié)果顯示MCC950 可抑制NLRP3 通路活化及EMT 發(fā)生，同時(shí)對(duì)肺纖維化小鼠具有治療作用，而補(bǔ)肺活血膠囊與MCC950 干預(yù)對(duì)肺纖維化小鼠EMT 及治療作用的影響無(wú)明顯差異。

綜上所述，通過(guò)補(bǔ)肺活血膠囊治療后，肺纖維化小鼠生存率明顯提高，體質(zhì)量明顯增加，肺組織W/D、BALF 總細(xì)胞與總蛋白、HYP 含量均明顯降低，肺纖維化進(jìn)程明顯改善。因此可以證實(shí)補(bǔ)肺活血膠囊可以通過(guò)調(diào)控NLRP3 通路介導(dǎo)的EMT 抑制減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化程度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突